专利名称：组织工程表皮替代物及其制备方法
专利说明组织工程表皮替代物及其制备方法 本发明涉及生物材料及组织工程技术领域，具体地说是一种组织工程表皮替代物及其制备方法。皮肤是人体最大的器官，起着保护机体的重要作用。当各种原因造成皮肤缺损时，会造成机体工能的障碍，重则危机生命。对皮肤组织缺损，临床上常见的治疗方法为有凡士林纱布和断层皮片或全厚层皮片移植，其中，断层皮片是公认的标准治疗方法。但是，对于这种治疗方法存在造成新的皮肤创伤及供体不足的问题到目前为止还没有得到妥善的解决。
皮肤缺损后，缺损部位的增生性疤痕是其重要的并发症。研究显示，如果皮肤缺损部位能很快的上皮化，就可以减少缺损部位的瘢痕形成，或减轻疤痕的形成的程度。随着生物工程技术、医学的发展，以及各学科交叉的深入，组织工程技术的兴起，组织工程皮肤是成为人工皮肤研究的热点和重点。产生了一系列的专利，其中申请号为200310108082的专利就是关于一种提高创面上皮化的表皮替代物的构建方法。然而，该专利中使用的壳聚糖一明胶膜材是一种致密性的材料，不具有透气性，特别是在加细胞后，在湿润的状态下，壳聚糖/明胶发生溶胀，其透气性会进一步的降低，尤其是在较厚的膜材上，影响愈明显，从而影响临床修复的效果。本发明的目的在于在现有技术的基础上，制备出具有较好透气性的的壳聚糖-明胶膜材或支架作为表皮替代物的细胞转载系统，增加表皮替代物的临床修复效果。
本发明采用以下方法来实现一种组织工程表皮替代物，壳聚糖-明胶膜材或支架上设有直径为20到50微米的小孔。这样就能保证所制备出的表皮替代物具有良好的透气性，能增强临床修复效果。
本发明的另一个创新点在于提供了组织工程表皮替代物的制备方法，包括以下两种其一、一种组织工程表皮替代物的制备方法，包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶9～9∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将混合液加入平面皿中，在35～60℃的条件下加热2～3小时，干燥成膜材；(5)取出膜材，将膜浸泡在无水乙醇中20分钟，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反应3小时，进行交联反应；(7)然后用大量的蒸馏水冲洗，并浸泡24小时；(8)在35～60℃的条件下加热2～3小时，再次干燥成膜；(8)在膜上打直径为20到50微米，密度为1-10个/mm2的小孔，即得壳聚糖-明胶膜材；(9)将上述壳聚糖-明胶膜材置于角化上皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(10)然后按1×104～1×106/cm2的密度接种表皮细胞在已打过孔的膜材上；(11)将上述膜材用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为3～15天，即可得组织工程表皮替代物。
其二、一种组织工程表皮替代物的制备方法，包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶9～9∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将上述壳聚糖-明胶混合物在-40℃～-70℃的条件下预冻3-5小时；(5)然后用低温冷冻真空干燥机抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架在35-60℃的条件下加热2-3小时，再用1～4％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸馏水洗涤3-5次；(7)将经过上述处理的支架，加30mM的EDC或用1～5％戊二醛溶液进行交联反应2～3小时；(8)冲洗干净；(9)重新真空冷冻干燥，得到多孔的壳聚糖-明胶多孔支架；(10)将上述壳聚糖-明胶支架置于角化上皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(11)再按1×104～1×106/cm2的密度接种表皮细胞在支架上；(12)将上述支架用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为3～15天，即可得组织工程表皮替代物。
上述组织工程表皮替代物的制备方法中，所述的培养液为置于角化上皮细胞培养液。
在最后进行培养的时间最优的选择为5-7天。
所述的膜材的厚度为100～600μm。所述的支架厚度为100～1000μm。其表皮细胞替代物可用于临床大面积烧伤创面、各种皮肤外伤创面、整形外科中的供皮区创面、各种慢性溃疡皮肤缺损的修复。
本发明同现有技术相比，使用了壳聚糖、明胶作为原料，使之作为表皮替代物的细胞转载系统。不仅原料易得，技术相对容易掌握，而且所制备出的组织工程表皮替代物表面上设有小孔，透气性好，增加表皮替代物的临床修复效果。
图1为表皮替代物修复创面的的效果图1为改进的表皮替代物修复区2为未改进的表皮替代物修复区[具体实施方式
]以下对本发明作进一步的说明，这种技术对本专业的人员来说还是清楚地。
例1壳聚糖-明胶膜材所制备的组织工程表皮替代物一种组织工程表皮替代物的制备方法，包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶9混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将混合液加入平面皿中，在35℃加热2小时，干燥成膜材；(5)从平面皿取出膜材，将膜浸泡在无水乙醇中20分钟，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC反应3小时，进行交联反应；(7)然后用大量的蒸馏水冲洗，并浸泡24小时；(8)在35℃加热2小时，再次干燥成膜；(8)在膜上打直径为20微米，密度为1个/mm2的小孔，即得壳聚糖-明胶膜材；(9)将上述壳聚糖-明胶膜材置于表皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(10)按1×104/cm2的密度接种表皮细胞在以打过孔的膜材上；(11)将上述膜材用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为6天，即可得组织工程表皮替代物。
例2壳聚糖-明胶膜材所制备的组织工程表皮替代物一种组织工程表皮替代物的制备方法，包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将混合液加入平皿中，在48℃加热2.5小时，干燥成膜材；(5)将膜浸泡在无水乙醇中20分钟，除去乙醇；(6)再加入0.25％戊二醛溶液反应3小时，进行交联反应；(7)然后先用2％的硼氢化钠溶液洗涤，去除多余的戊二醛，再用大量的蒸馏水冲洗，并浸泡24小时；(8)在48℃加热2.5小时，再次干燥成膜；(8)在膜上打直径为35微米，密度为2个/mm2的小孔，即得壳聚糖-明胶膜材；(9)将上述壳聚糖-明胶膜材置于角化上皮培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(10)按1×105/cm2的密度接种表皮细胞在以打过孔的膜材上；(11)将上述膜材用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为9天，即可得组织工程表皮替代物。
例3壳聚糖-明胶膜材所制备的组织工程表皮替代物一种组织工程表皮替代物的制备方法，包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为9∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将混合液加入平皿中，在60℃加热3小时，干燥成膜材；(5)将膜浸泡在无水乙醇中20分钟，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC反应3小时，进行交联反应；(7)然后用大量的蒸馏水冲洗，并浸泡24小时；(8)在60℃加热3小时，再次干燥成膜；(8)在膜上打直径为50微米，密度为4个/mm2的小孔，即得壳聚糖-明胶膜材；(9)将上述壳聚糖-明胶膜材置于表皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(10)按1×106/cm2的密度接种表皮细胞在以打过孔的膜材上；(11)将上述膜材用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为15天，即可得组织工程表皮替代物。
例4壳聚糖-明胶支架所制备的组织工程表皮替代物(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶9混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将上述壳聚糖-明胶混合物在-40℃的条件下预冻3小时；(5)然后用低温冷冻真空干燥机抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架再35℃加热2小时，再用1％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸馏水洗涤3次；(7)将经过上述处理的支架，加30mM的EDC进行交联反应2小时；(8)冲洗干净；(9)重新真空冷冻干燥，得到多孔的壳聚糖-明胶多孔支架；(10)将上述壳聚糖-明胶支架置于表皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(11)按1×104/cm2的密度接种表皮细胞在支架上；(12)将上述支架用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为6天，即可得组织工程表皮替代物。
例5壳聚糖-明胶支架所制备的组织工程表皮替代物(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将上述壳聚糖-明胶混合物在-55℃预冻4小时；(5)然后用低温冷冻真空干燥机抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架再48℃加热2.5小时，再用3％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸馏水洗涤4次；(7)将经过上述处理的支架，用2.5％戊二醛溶液进行交联反应2.5小时；(8)先用2％的硼氢化钠溶液洗涤，去除多余的戊二醛，再用大量的蒸馏水冲洗干净；(9)重新真空冷冻干燥，得到多孔的壳聚糖-明胶多孔支架；(10)将上述壳聚糖-明胶支架置于表皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(11)按1×105/cm2的密度接种表皮细胞在支架上；(12)将上述支架用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为9天，即可得组织工程表皮替代物。
例6壳聚糖-明胶支架所制备的组织工程表皮替代物将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为9∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将上述壳聚糖-明胶混合物在-70℃预冻5小时；(5)然后用低温冷冻真空干燥机抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架再60℃加热3小时，再用4％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸馏水洗涤5次；(7)将经过上述处理的支架，加入30mM的EDC进行交联反应3小时；(8)冲洗干净；(9)重新真空冷冻干燥，得到多孔的壳聚糖-明胶多孔支架；(10)将上述壳聚糖-明胶支架置于表皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(11)按1×106/cm2的密度接种表皮细胞在支架上；(12)将上述支架用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为15天，即可得组织工程表皮替代物。
例7组织工程表皮替代物在临床中的应用该表皮替代物可以应用于临床大面积烧伤创面、整形外科中的供皮区创面、各种慢性溃疡等皮肤缺损的修复。
在患者背部取中厚皮片后，留下16×10cm2供皮区创面，分别用根据专利申请CN200310108082提供的技术方案构建的表皮替代物和根据本专利的技术方案构建的表皮替代物进行治疗，将表皮细胞替代物的细胞面与患者的创面接触，常规创面包扎处理。7天后打开外敷料，观察创面情况。结果显示两种表皮替代物修复的创面均上皮化，但是，本专利构建的表皮替代物和专利申请CN200310108082构建的表皮替代物修复创面的的效果相比，上皮化范围和上皮化质量均优于后者。
权利要求
1.一种组织工程表皮替代物，其特征在于壳聚糖-明胶膜材或支架上设有直径为20到50微米的小孔。
2.一种组织工程表皮替代物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶9～9∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将混合液加入平面皿中，在35～60℃的条件下加热2～3小时，干燥成膜材；(5)取出膜材，并将膜浸泡在无水乙醇中20分钟，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反应3小时；(7)然后用大量的蒸馏水冲洗，并浸泡24小时；(8)在35～60℃的条件下加热2～3小时，再次干燥成膜；(8)在膜上打直径为20到50微米，密度为1-10个/mm2的小孔，即得壳聚糖-明胶膜材；(9)将上述壳聚糖-明胶膜材置于角化上皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(10)按1×104～1×106/cm2的密度接种表皮细胞在已打过孔的膜材上；(11)将上述膜材用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为3～15天，即可得组织工程表皮替代物。
3.一种组织工程表皮替代物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)将壳聚糖用1％的乙酸溶解，配制成浓度为2％的壳聚糖溶液；(2)明胶用蒸馏水溶解，配制成浓度4％明胶溶液；(3)将壳聚糖溶液和明胶溶液按重量比为1∶9～9∶1混合，并于37℃的条件下搅拌混合24小时；(4)将上述壳聚糖-明胶混合物在-40℃～-70℃预冻3-5小时；(5)然后用低温冷冻真空干燥机抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架在35-60℃的条件下加热2-3小时，再用1～4％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸馏水洗涤3-5次；(7)将经过上述处理的支架，加30mM的EDC或用1～5％戊二醛溶液进行交联反应2～3小时；(8)冲洗干净；(9)重新真空冷冻干燥，得到多孔的壳聚糖-明胶多孔支架；(10)将上述壳聚糖-明胶支架置于角化上皮细胞培养液内培养过夜，然后吸干培养液；(11)然后按1×104～1×106/cm2的密度接种表皮细胞在支架上；(12)将上述支架用无血清的角化上皮细胞培养液进行培养，每3天换液一次，培养时间为3～15天，即可得组织工程表皮替代物。
4.根据权利要求2或3所述的一种组织工程表皮替代物的制备方法，其特征在于所述的培养液为角化上皮细胞培养培养液。
5.根据权利要求2或3所述的一种组织工程表皮替代物的制备方法，其特征在于所述的培养时间为5-7天。
6.根据权利要求2所述的一种组织工程表皮替代物的制备方法，其特征在于所述的膜材的厚度为100～600μm。
7.根据权利要求3所述的一种组织工程表皮替代物的制备方法，其特征在于所述的支架厚度为100～1000μm。
8.根据权利要求1所述的一种组织工程表皮替代物，其特征在于其可用于临床大面积烧伤创面、皮肤外伤创面、整形外科中的供皮区创面、各种慢性溃疡皮肤缺损的修复。
全文摘要
本发明涉及生物材料及组织工程技术领域，具体地说是一种组织工程表皮替代物及其制备方法。一种组织工程表皮替代物，其特征在于壳聚糖－明胶膜材或支架上设有直径为20到50微米的小孔。本发明同现有技术相比，使用了壳聚糖、明胶作为原料，使之作为表皮替代物的细胞转载系统。不仅原料易得，技术相对容易掌握，而且所制备出的组织工程表皮替代物表面上设有小孔，透气性好，增加表皮替代物的临床修复效果。
文档编号A61L27/60GK1739813SQ20051002969
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月15日 优先权日2005年9月15日
发明者丁勃元, 麻锦央 申请人:上海赐人合元企业发展有限公司