本发明属于生命科学技术领域，具体涉及cct3的功能与用途。
背景技术
胃癌是世界上第二高发的恶性肿瘤，而在东方尤其是中国更加普遍。其发病率和死亡率在世界范围内仅次于胃癌。每年世界上新诊断的胃癌达到了95万人次；而中国的胃癌患者占42％，其中超过2/3的患者因为胃癌死亡。胃癌的发病受饮食和环境等危险因素影响，但目前没有任何一种理论可以完全解释其发病机制。
分子伴侣网络(包括伴侣分子和伴侣蛋白)在维持体内蛋白稳态和蛋白组的完整性中起着重要作用。在胞质中，各种各样的分子伴侣在保守进化通路指导下折叠、胞内定位和水解已折叠的蛋白。分子伴侣主要通过结合在新生成或者应激状态下错误折叠或者聚合的多肽链的疏水域发挥作用。另外，分子伴侣最主要的作用是保证多肽链的正确折叠及维持构象稳定，以及积极参与蛋白降解。分子伴侣的蛋白降解作用主要是通过维持目的蛋白的展开状态，通过泛素蛋白酶系统水解蛋白。对于不能展开的聚合蛋白，分子伴侣通过自噬作用或者选择性自噬途径切除受损的蛋白质。蛋白稳态对于维持细胞的正常作用至关重要，因此破坏蛋白稳态可以引发包括癌症在内的多种疾病。分子伴侣途径不可避免的参与癌症的发展。
伴侣蛋白携带t复合多肽1(cct、也叫作tric)属于第二类(真核)分子伴侣，与5-10％的蛋白质及细胞的生存至关重要。cct由2个固定模式排列的背靠背叠性寡聚环组成。cct分子中央腔每次只允许装载一个蛋白质分子，从而保证其折叠后可以不聚合。cct由8个不同的亚基构成，从而识别不同的基质蛋白，这些亚基具有热休克蛋白家族不具备的特定蛋白折叠能力。
cct3与胃癌的关系目前仍不明确。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供cct3在胃癌中的功能与用途。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了cct3抑制剂用于制备胃癌治疗药物的用途。
所述胃癌治疗药物至少具有以下功用之一：能够抑制胃癌细胞的生长和增殖、促进胃癌细胞的凋亡、抑制胃癌细胞成瘤能力、抑制胃癌组织生长。
优选地，所述cct3抑制剂是指对于cct3具有抑制效果的分子。
对于cct3具有抑制效果包括但不限于：抑制cct3活性，或者抑制cct3基因转录或表达。
所述cct3抑制剂可以为sirna、shrna、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的，所述cct3抑制剂可以为shrna。所述shrna的靶序列如seqidno.1所示。
所述胃癌治疗药物必然包含cct3抑制剂，并以cct3抑制剂作为前述功用的有效成分。
所述胃癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为cct3抑制剂，亦可包含其他可起到类似功用的分子。
所述胃癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述胃癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述胃癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。
本发明的第二方面，提供一种治疗胃癌的方法，为向对象施用cct3抑制剂。
所述的对象为哺乳动物或所述哺乳动物的胃癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或智人。所述胃癌细胞可为离体胃癌细胞，包括但不限于mgc-803及bgc-823。
所述对象可以是罹患胃癌的患者或期待治疗胃癌的个体，或者所述对象为胃癌患者或期待治疗胃癌的个体的离体胃癌细胞。
所述cct3抑制剂可以在接受胃癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明的第三方面，提供了一种胃癌治疗药物，包括有效量的cct3抑制剂及药用载体。
本发明的第四方面，提供了一种胃癌联合治疗药物组合，包括有效量的cct3抑制剂和至少一种其他胃癌治疗药物。
所述其他胃癌治疗药物是指除了cct3抑制剂以外的胃癌治疗药物。
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将cct3抑制剂和其他胃癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。
当其他胃癌治疗药物为抗肿瘤抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他胃癌治疗药物为化疗药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化疗药物的已知给药途径给药。
二)将cct3抑制剂和其他胃癌治疗药物配置成复方制剂。在将cct3抑制剂和其他胃癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
本发明第五方面，提供了一种胃癌治疗方法，为向对象施用有效量的cct3抑制剂，以及向对象施用有效量的其他胃癌治疗药物和/或向对象实施其他胃癌治疗手段。
可以同步地或顺序地给予有效量的cct3抑制剂和至少一种有效量的其他胃癌治疗药物。
基于cct3为本发明首次新发现的胃癌治疗靶点，在与cct3抑制剂以外的其他胃癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于胃癌的抑制。
所述其他胃癌治疗药物包括但不限于：抗肿瘤抗体、化疗药物或靶向型药物等。
所述cct3抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他胃癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗肿瘤抗体或化疗药物，一般采用胃肠外给药。
本发明的第六方面，提供cct3的其他新用途，所述cct3抑制剂至少具有以下功用之一：能够抑制胃癌细胞的生长和增殖、促进胃癌细胞的凋亡、抑制胃癌细胞成瘤能力、抑制胃癌组织生长。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，cct3可作为胃癌治疗靶点，抑制cct3的表达能够显著抑制胃癌细胞的生长和增殖、促进胃癌细胞的凋亡、抑制胃癌细胞成瘤能力、抑制胃癌组织生长。因此，本发明从临床病人样品水平、细胞功能水平和分子水平对胃癌的发病机理及胃癌的临床治疗提供有力的科学证据。
附图说明
图1：左a为实验组为胃癌组织，右b对照组为来自于同一患者的癌旁组织，胞质内癌组织cct3表达量明显高于癌旁组织。
图2a：通过和对照组比较，bgc-823系和mgc-803系中cct3的表达分别减少了94.6％和95.7％。
图2b：随着cct3表达的急剧减少，肿瘤细胞的增殖被明显抑制。
图2c：shcct3组肿瘤细胞的克隆形成能力明显被抑制，表明敲除cct3后肿瘤细胞表现出了更低的增殖潜能(p<0.01)。
图3a：cct3敲除后凋亡增加，实验结果表明，shcct3慢病毒感染组caspase3/7的活力分别是对照组的3.6倍和1.6倍。
图3b：含有shcct3的慢病毒感染后的细胞，bgc-823细胞系有19.3％凋亡，mgc-803细胞系有35.1％凋亡；而与其相对应的对照组分别只有5.6％及7.5％的细胞凋亡。
图4a：cct3敲除组肿瘤生长明显抑制。
图4b：cct3敲除组肿瘤生长明显抑制。
图5：cct3敲除后基因表达的改变，发现map3k7、cdc42、ccnd3的表达水平显著下调，而cdk2、cdk6表达显著上调。
具体实施方式
本发明在研究中发现，cct3可作为胃癌治疗靶点，抑制cct3的表达能够显著抑制胃癌细胞的生长和增殖、促进胃癌细胞凋亡、抑制胃癌细胞成瘤能力、抑制胃癌肿瘤组织生长。
cct3抑制剂
指对于cct3具有抑制效果的分子。对于cct3具有抑制效果包括但不限于：抑制cct3活性，或者抑制cct3基因转录或表达。所述cct3抑制剂包括但不限于sirna、shrna、抗体、小分子化合物。
抑制cct3活性是指使cct3活力下降。优选地，相比抑制前，cct3活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制cct3基因转录或表达是指：使cct3的基因不转录，或降低cct3的基因的转录活性，或者使cct3的基因不表达，或降低cct3的基因的表达活性。
本领域技术人员可以使用常规方法对cct3的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰rna等。
cct3的基因转录或表达的抑制可以通过pcr及westernblot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，cct3基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地cct3基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
cct3抑制剂制备药物
以cct3抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与cct3抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
联合治疗药物组合和施用方法
所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：
一)将cct3抑制剂及其他抗肿瘤药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。
二)将cct3抑制剂及其他抗肿瘤药物配置成复方制剂。在将cct3抑制剂及其他抗肿瘤药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。
抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。
小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。sirna、shrna、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。
可以同步的或顺序地给予有效量的cct3抑制剂及有效量的其他胃癌药物。使用时，可将有效量的cct3抑制剂及有效量的其他胃癌药物同时使用，也可将有效量的cct3抑制剂及有效量的其他胃癌药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。
化疗药物包括烷化剂(如尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺和甘磷酰芥等)、抗代谢药(如去氧氟鸟苷、多西弗鸟啶、氟尿嘧啶、巯嘌呤、甲氨蝶呤等核苷酸类似物)、抗肿瘤抗生素(如放线菌素d、阿霉素和柔红霉素等抗生素)、抗肿瘤动植物成分药(如长春瑞滨、紫杉醇、三尖杉酯碱、伊立替康、泰索帝和长春碱等)、抗肿瘤激素药(如阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦和他莫昔芬等)以及如顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌和丙卡巴肼等常用化疗药。
靶向型药物包括egfr阻断剂如吉非替尼(gefitinib、iressa和易瑞沙)和埃罗替尼(erlotinib、tarceva)、特定细胞标志物的单克隆抗体如西妥昔单抗(cetuximab、erbitux)和抗her-2单抗(赫赛汀，trastuzumab、herceptin)、酪氨酸激酶受体抑制剂如克唑替尼(crizotinib、xalkori)、抗肿瘤血管生成药物如bevacizumab、endostatin和bevacizumab等、bcr-abl酪氨酸激酶抑制剂如imatinib和dasatinib、抗cd20单抗如rituximab、igfr-1激酶抑制剂如nvp-aew541、mtor激酶抑制剂如cci-779、泛素-蛋白酶体抑制剂如bortezomib等。
其他肿瘤治疗手段可选自手术切除、射频消融、氩氦超导手术治疗、激光消融治疗、高强度聚焦超声以及放射治疗包括x-刀、r-刀、3d-crt和imrt中的一种或多种。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
实施例1胃癌组织中cct3上调
(一)组织标本及免疫组化
胃癌标本来自知情同意的26位胃癌切除患者，胃癌组织及癌旁组织石蜡包埋后经过兔子cct3抗体(1:50,abcam,ab1774255)处理，在通过标准免疫组化染色。细胞染色强度评分如下：0为未染色，1为弱染色，2为中等染色，3为强染色。细胞染色百分率：0为无阳性细胞，1为1～25％阳性细胞，2为26～50％阳性细胞，3为51～75％阳性细胞，4为超过75％阳性细胞。只有肿瘤细胞及上皮细胞染色评估，组织切片免疫染色分数为细胞染色强度分数和细胞染色百分率分数比值。免疫染色≤6纳入cct3低表达组，>6纳入cct3高表达组。
(二)实验结果
实验中检测cct3在胃癌组织中表达的标本取材于26例胃癌手术患者，并对标本进行固定。实验组为胃癌组织，对照组为来自于同一患者的癌旁组织。分别从同一患者的癌组织及癌旁组织取4块标本进行检测。胞质内癌组织cct3表达量明显高于癌旁组织(图1，p<0.001，mcnemar'stest)。
实施例2敲除cct3治疗胃癌
(一)cct3shrna，慢病毒载体和病毒扩增
shrna是依据cct3信使rna的目标序列5’caagtccatgatcgaaatt3’(seqidno.1)设计的，目的基因包含靶向发卡结构、转录终止序列以及允许慢病毒载体gv115(genechem,shanghai,china)插入的限制性酶切位点，而对比序列也具有使用相同技术合成的无目的基因的发卡结构。慢病毒成分由测序部分和生成部分构成。病毒的包装与净化系统为genechem(上海，中国)的慢病毒表达系统。
(二)细胞培养及慢病毒转染
人胃癌细胞株mgc-803及bgc-823培养在rpmi-1640(10％小牛胎血清、37℃、5％co2.)中，3天更换培养液一次。在感染复数(moi)为50的条件下，慢病毒感染率达到80％。慢病毒感染72h后，细胞被用于下游分析。
(三)quantitativert-pcr
慢病毒感染胃癌细胞后，总rna的提取使用试剂盒。cdna的合成使用m-mlv逆转录酶(美国，promega，m1705)。实时荧光定量pcr进行实时pcr系统7500(美国，aglient，applied)使用sybr主模式。使用gapdh作为内参，通过2-δδct计算相对cct3表达量。
引物序列为：5’-tcagtcggtggtcatctttgc-3’(seqidno.2)；
cct3互补序列：5’-cctccaggtatcttttccactct-3’(seqidno.3)；
内参序列：5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’(seqidno.4)；
内参互补序列：5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(seqidno.5)。
(四)细胞增殖检测(mtt法分析)
将慢病毒感染后的mgc-803和bgc-823胃癌细胞株重悬细胞成悬液并计数；以每孔2,000细胞接种于96孔板，每组3复孔。同时在5块板上计数，每块板分别取24h、48h、72h、96h和120h计数。mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)来自于genview(houstontx,usa；jt343)。mtt在吸光度为490mm(od490)时检测细胞数量及绘制细胞生长曲线。
(五)克隆形成检测
肿瘤克隆形成实验如前所述。简而言之，慢病毒感染bgc-823和mgc-803细胞株3天后，分别接种于6孔板培养板中(300细胞/孔和400细胞/孔)。bgc-823细胞株孵化8天以及mgc-803细胞株孵化10天以待集落形成。集落形成后通过固定和染色后计数。
(六)细胞凋亡检测
慢病毒感染肿瘤细胞后caspase3/7的活性通过caspase-
早期细胞凋亡后通过annexin-vapc检测设备(美国，cat.88-8007,ebioscience)检测。
荧光活化细胞通过guavaeasycyteht血细胞计数(美国，millipore)系统分选。
(七)肿瘤细胞移植检测
慢病毒感染的bgc-823细胞株是由包含4ug/ml的嘌呤霉素(美国，cat.631305,clontech)的生长介质孵育48h后提取。随后，成瘤细胞(4×106个细胞/只)皮下注射至balb/c裸鼠(雌鼠，4周大小)右前肢腋下。转染后分别在第7天、11天、14天、17天及19天测量瘤体大小。瘤体大小用公式π/6×l×w2(mm3)计算。试验动物在第19天处死并取出瘤体称重。
(八)westernblotting检测
将前文提到的mgc-803细胞裂解后，用小鼠来源抗-gapdh(1:4000,santacruz,sc-32233)、兔来源抗-map3k7(1:4000,santacruz,sc-32233)，兔来源抗-cdc42(1:1000,abcam,ab187643)，兔来源抗-cdk2抗体(1:1000,cst,#2546)，小鼠来源抗-cdk6(1:1000,cst,#3136)以及小鼠来源抗-ccnd3(1:1000,cst,#3136)进行westernblotting检测。在实验中用到的二抗如下：抗兔igg抗体(1:5000,santacruz,sc-2004)或者抗鼠igg抗体(1:5000,santacruz,sc-2005)。用于信号检测的化学发光试剂：cat.32106,thermofisher(美国)。
(九)实验结果
1.体外实验中敲除cct3抑制肿瘤生长
通过含有能够靶向针对cct3mrna(shcct3)的短发卡rna的慢病毒去感染bgc-823和mgc-803两株人类胃癌细胞株，从而进一步验证cct3对于胃癌细胞生长、存活的作用。然后通过qrt-pcr法验证cct3在bgc-823和mgc-803细胞中的沉默效应。慢病毒感染后，通过和对照组比较，bgc-823系和mgc-803系中cct3的表达分别减少了94.6％和95.7％(图2a)。通过mtt检测发现沉默cct3后肿瘤细胞的增殖也受到影响。随着cct3表达的急剧减少，肿瘤细胞的增殖被明显抑制，如图2b所示为一条平坦的生长曲线。此外，shcct3组肿瘤细胞的克隆形成能力明显被抑制(图2c)，表明敲除cct3后肿瘤细胞表现出了更低的增殖潜能(p<0.01)。总而言之，根据以上结果，cct3过表达在胃癌细胞的增殖中起着关键作用。
2.敲除cct3促进肿瘤凋亡
含有shcct3的慢病毒感染后的细胞，bgc-823细胞系有19.3％凋亡，mgc-803细胞系有35.1％凋亡；而与其相对应的对照组分别只有5.6％及7.5％的细胞凋亡(图3b)。caspase3/7活力测定证实cct3敲除后凋亡增加，实验结果表明，shcct3慢病毒感染组caspase3/7的活力分别是对照组的3.6倍和1.6倍(图3a)。以上结果表明cct3表达减少可能增加胃癌细胞凋亡。
3.体内试验中敲除cct3抑制肿瘤细胞的增长
在体外试验中，减少胃癌细胞株中cct3的表达能够抑制细胞增殖和促进细胞凋亡(图3a,b)，在体内如果敲除cct3后给予任何抗肿瘤活性药物，结果将不能预估。为了研究移植的肿瘤生长过程中敲除cct3的影响，将用慢病毒包装的bgc-823细胞株以及对照组移植到裸鼠体内。在动物身上监测肿瘤细胞的生长19天。结果显示体内实验中，cct3敲除组肿瘤生长明显抑制(图4a,b)。与对照组相比，肿瘤的重量和体积显著降低(p<0.05)。结果表明，cct3在体内试验中也扮演了一个重要的角色。
4.cct3敲除后基因表达的改变
为了明确在复杂的细胞通路网络中，cct3扮演了什么样的潜在角色，affymetrix人类全基因表达谱芯片检测显示，实验组cct3-shrna相对于对照组，上调基因859个，下调基因887个。采用ipa(
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
sequencelisting
<110>兰州大学第二医院
<120>cct3的功能与用途
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