本发明属于生物纳米材料领域，涉及一种凝胶复合物，具体来说是一种多功能共轭高聚物与海藻酸钠凝胶复合物的制备及其应用。
背景技术
光热疗法是一种新型的肿瘤治疗方法，其原理是利用近红外激光照射富集在肿瘤部位的光热材料，利用材料的光热转化能力产生的高热量来杀死肿瘤细胞。近红外激光具有强的生物组织穿透能力，且光衰减小等特点，成为了光热治疗研究中的重要光源。聚吡咯(ppy)含有共轭结构，是一种典型的有机导电聚合物。光热治疗中，光热材料的光热转化效率是治疗的关键因素之一，有研究表明除具有优异导电性，聚吡咯还具有较强的近红外光吸收能力和光热转化能力，同时具有良好的生物相容性及稳定性。聚吡咯的制备方法包括电化学聚合和化学聚合。其中，化学聚合可通过氧化剂(如三价铁离子)或者金属有机物的偶联制备。
水凝胶是一种具有三维结构的高分子聚合物，能在水中溶胀并保持大量水分而不溶解，且具有良好的生物相容性。海藻酸钠为一种天然多糖，其分子结构中含有大量的羧基。在阳离子存在下，海藻酸钠g单元上的钠离子与阳离子发生交换反应，形成交联网络结构，进而形成凝胶。我们前期研究表明(doi:10.1021/acsami.7b17608)，海藻酸钠凝胶可用于负载光热材料和化疗药物。但这种水凝胶是通过钙离子和钠离子的交换成胶，当注射至病灶部位时，钙离子的迁徙可能会导致血管硬化等结果。因此，开发其他交联剂(离子)，制备安全性更高的海藻酸钠水凝胶具有重要的研究价值和临床转化前景。我们通过实验发现，铁离子也能与海藻酸钠的离子交换成胶；而且，铁离子经氧化成的亚铁离子可改善血红蛋白、肌红蛋白的机能，增强机体免疫力等。
动物水平的肿瘤光热治疗主要是通过尾静脉或瘤内将材料输送至小鼠体内。大部分尾静脉注射的材料会被肝、脾等网状器官捕捉，导致富集在肿瘤部位的材料很少，疗效不好。而瘤内注射虽可使材料较多地集中于肿瘤部位，但由于肿瘤部位的血管通透性增加，部分材料会渗透进入血液循环而对机体造成潜在的影响。为了弥补上述不足，我们设法将光热材料和化疗药物通过凝胶系统稳固地束缚在肿瘤部位，以提高材料利用率，降低对组织和器官的损伤。我们发现，铁离子既能氧化吡咯生成聚吡咯，又能与海藻酸钠进行离子交换形成水凝胶载体。因此，可在铁离子的桥接作用下，得到聚吡咯和海藻酸钠水凝胶的复合光热材料。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种多功能共轭高聚物凝胶基复合材料的制备及其应用，所述的这种多功能海藻酸钠水凝胶旨在解决现有技术中光热材料在肿瘤内部分布不均，毒性强且利用效率低的问题。
本发明提供了一种多功能共轭高聚物凝胶基复合材料的制备方法，将海藻酸钠溶于溶剂中，搅拌使之完全溶解，溶解后的海藻酸钠质量百分比浓度为0.5％-3％，然后放置于冰水浴中冷却；将共轭聚合物单体分散于上述海藻酸钠溶液中得混合溶液，所述的共轭聚合物单体为吡咯、噻吩、苯胺、多巴胺中的任意一种；再于上述混合溶液中加入金属阳离子化合物，所述的金属阳离子化合物为六水合氯化铁、氯化铝中的任意一种，反应完全后即可得到多功能共轭高聚物凝胶基复合材料。
进一步的，当海藻酸钠溶液体积为1ml时，所添加的共轭聚合物单体体积为8-32μl，所添加的金属阳离子与共轭聚合物单体的摩尔比为4:1。
进一步的，所述的溶剂为蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)、生理盐水(w/v＝0.9％)中的任意一种。
进一步的，所述的反应温度为0-10℃。
本发明还提供了一种负载有药物的复合共轭聚合物凝胶的制备方法，将海藻酸钠溶于溶剂中，搅拌使之完全溶解，溶解后的海藻酸钠质量百分比浓度为0.5％-3％，然后加入水溶性的抗癌药物，分散后的水溶性的抗癌药物的浓度为0.1-1mg/ml，然后放置于冰水浴中冷却；将共轭聚合物单体分散于上述海藻酸钠溶液中得混合溶液，所述的共轭聚合物单体为吡咯、噻吩、苯胺、多巴胺中的任意一种；再于上述混合溶液中加入金属阳离子化合物，反应完全后，即可得到多功能共轭高聚物凝胶基复合材料。
进一步的，所述的水溶性的抗癌药物为多柔比星或羧基喜树碱中的任意一种。
本发明还提供了一种多功能共轭高聚物凝胶基复合材料的制备方法，将海藻酸钠溶于溶剂中，搅拌使之完全溶解，溶解后的海藻酸钠质量百分比浓度为0.5％-3％，然后放置于冰水浴中冷却；将金属阳离子化合物加入至上述溶液中，反应成凝胶，所述的金属阳离子化合物为六水合氯化铁、氯化铝中的任意一种；再于将共轭聚合物单体分散于上述海藻酸钠溶液中得混合溶液，所述的共轭聚合物单体为吡咯、噻吩、苯胺、多巴胺中的任意一种；反应完全后即可得到多功能共轭高聚物凝胶基复合材料。
进一步的，当海藻酸钠溶液体积为1ml时，所添加的共轭聚合物单体体积为8-32μl，所添加的金属阳离子与共轭聚合物单体的摩尔比为4:1。
进一步的，所述的溶剂为蒸馏水、磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)、生理盐水(w/v＝0.9％)中的任意一种。
进一步的，所述的反应温度为0-10℃。
本发明还提供了一种负载有药物的复合共轭聚合物凝胶的制备方法，将海藻酸钠溶于溶剂中，搅拌使之完全溶解，溶解后的海藻酸钠质量百分比浓度为0.5％-3％，然后加入水溶性的抗癌药物，分散后的水溶性的抗癌药物的浓度为0.1-1mg/ml，放置于冰水浴中冷却；将金属阳离子化合物加入至上述溶液中，反应成凝胶，所述的金属阳离子化合物为六水合氯化铁、氯化铝中的任意一种；再将共轭聚合物单体分散于上述海藻酸钠溶液中得混合溶液，所述的共轭聚合物单体为吡咯、噻吩、苯胺、多巴胺中的任意一种；反应完全后即可得到多功能共轭高聚物凝胶基复合材料。
进一步的，所述的水溶性的抗癌药物为多柔比星或羧基喜树碱中的任意一种。
本发明还提供了采用上述的方法制备的多功能共轭高聚物凝胶基复合材料作为光热转化材料的用途。
本发明在海藻酸钠溶液中加入将能进行阳离子聚合的共轭聚合物单体和大于二价的阳离子引发剂。以吡咯为共轭聚合单体，六水合氯化铁为阳离子引发剂为例，提供了两种凝胶制备方法：①将海藻酸钠溶于溶剂中，加入吡咯搅拌均匀，再加入六水合氯化铁使海藻酸钠成胶和吡咯聚合同时进行；②将海藻酸钠溶于溶剂中，加入六水合氯化铁形成水凝胶，然后加入吡咯进行阳离子聚合。这两种方法皆可获得具有一定网络结构的黑色复合水凝胶。
本发明利用铁离子能与吡咯聚合及海藻酸钠发生交联反应的性质，提供了一种在铁离子的桥联作用下实现聚吡咯和海藻酸钠复合凝胶的同步制备方法。
本发明工艺简单，产品制备时间短，所得产物在体内外模拟实验中都体现了良好的生物相容性。与以往将光热材料直接分散于水凝胶中制备复合凝胶不同，本发明选择海藻酸钠作为基质，吡咯作为单体，利用铁离子既能使吡咯聚合，又能与海藻酸钠发生离子交换的双重特性制备复合凝胶。值得一提的是，本发明中海藻酸钠凝胶和吡咯聚合同步进行，且该凝胶制备过程中不需要其他有机溶剂的参与，体现了绿色化学“无溶剂”的理念。实验表明，本发明制备的凝胶具有良好的光热转化能力。原位植入后，聚吡咯被海藻酸钠凝胶束缚于肿瘤内，不至于大量地进入血液循环，提高了材料利用效率，且减小了对正常组织和器官的损伤影响。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明制备的凝胶工艺简单，产品易得，具有优异的光热转化能力，能弥补尾静脉和瘤内注射材料利用效率低、毒性大等缺点，有望应用于肿瘤的高效协同治疗等领域，具有一定临床应用价值。
本发明还提供了上述凝胶作为光热转化材料对肿瘤的治疗应用。本发明制备的共轭高聚物凝胶基复合材料具有优越的光热转化性能，良好的生物相容性，可应用于安全高效的肿瘤光热治疗。
附图说明
图1为复合水凝胶的fesem图片：(a)纯琼脂、(b)纯聚吡咯、(c)方法一制备的复合水凝胶；(d)方法二制备的复合水凝胶。
图2为(a)不同激光功率密度的808nm激光照射下，两种方法制备的复合水凝胶的温度随时间变化曲线；(b)与(a)对应的光热成像图片。不同激光功率密度的1064nm激光照射下，两种方法制备的复合水凝胶的温度随时间变化曲线(c)；与(c)对应的热成像照片(d)。
图3为在不同功率密度的808nm激光照射下，浸于生理盐水中的复合水凝胶(方法二制备)的温度随时间变化曲线(a)；(b)为与(a)相应的热成像照片。在不同功率密度的1064nm激光照射下，浸于生理盐水中的复合凝胶(方法二制备)的温度随时间变化曲线(c)；(d)为与(c)相应的热成像照片。
图4为在808nm近红外激光照射下(功率密度0.3w/cm2，激光开5分钟，关5分钟)，水凝胶的光热稳定性测试结果(a和b分别为方法一和方法二制备的复合水凝胶)。
图5为(a)与两种方法制备的复合水凝胶共培养后的l929细胞存活率；dead/live染色结果：(b)未经材料处理；(c)经方法一制备的复合凝胶处理；(d)经方法二制备的复合凝胶处理。
图6为(a)经复合水凝胶和激光处理后ht29细胞的存活率；(b)对照组的dead/live染色图片；(c)实验组的dead/live染色结果。
图7为(a)在激光照射下(808nm和1064nm，功率密度均为0.5w/cm2)，小鼠肿瘤部位温度随时间的变化曲线及(b)对应的光热成像图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取3g海藻酸钠溶于100ml去离子水中，常温搅拌均匀，得海藻酸钠水溶液。然后，取1ml上述溶液于玻璃瓶中(玻璃瓶置于冰水浴中)。将32μl吡咯和56μl六水合氯化铁(浓度1g/ml)依次加入玻璃瓶中，反应4h后，即得多功能共轭高聚物凝胶基复合材料。
载药复合水凝胶的制备：在100ml去离子水中加入100mgdox，溶解后加入3g海藻酸钠，其余步骤与上述相同。
实施例2
取3g海藻酸钠溶于100ml去离子水中，常温搅拌均匀，得海藻酸钠水溶液。然后，取1ml上述溶液于玻璃瓶中(玻璃瓶置于冰水浴中)。将56μl六水合氯化铁(浓度1g/ml)和32μl吡咯依次加入玻璃瓶中，反应4h后，即得多功能共轭高聚物凝胶基复合材料。
载药复合水凝胶的制备：在100ml去离子水中加入100mgdox，溶解后加入3g海藻酸钠，其余步骤与上述相同。
实施例3
将实施例1中的凝胶冷冻干燥，分析其形貌。样品在feimagellan400型场发射扫描电子显微镜上完成分析。
由电镜扫描图片可以看出，图1(a)中海藻酸钠凝胶表面相对平滑，图1(b)中聚吡咯为不规则球状。而用实施例1和实施例2制备的复合水凝胶(图1(c-d))形貌一致，即在海藻酸钠的表面及内部都分布有聚吡咯颗粒，证明了聚吡咯和海藻酸钠已有效地复合在一起。
实施例4
将实施例1和实施例2两种方法制备的复合水凝胶用不同功率密度(0.1w/cm2,0.2w/cm2,0.3w/cm2,0.5w/cm2,0.8w/cm2)的808nm和1064nm的近红外激光照射，蒸馏水作为对照组。使用flire60红外热像仪记录凝胶温度随时间的变化情况和红外热成像照片。由图2(a)、2(c)知，在近红外激光照射下，温差随着照射时间逐渐增大；激光密度的增加，温差也逐渐增加。用808nm激光照射1分钟后，复合水凝胶的温差可分别达39.52℃(激光密度0.5w/cm2)和47.18℃(激光密度0.5w/cm2)；用1064nm激光照射1分钟，温差则可分别达36.36℃(激光密度0.5w/cm2)和48.06℃(激光密度0.5w/cm2)，充分说明了材料具有优异的光热转化能力。另外，用相同功率的808nm和1064nm激光照射复合水凝胶，温差差别不大，表明材料在808nm及1064nm两个窗口均具有良好的光热转化特性。图2(b)和(d)中红外热成像照片进一步说明了复合水凝胶具有优异的光热转化能力。
为了证明复合水凝胶在生物体内也具有良好的光热转换性能，我们研究了生理盐水中复合水凝胶的发热情况(生理盐水淹没复合水凝胶，激光的功率密度为0.1w/cm2,0.3w/cm2和0.5w/cm2，激光波长为808nm和1064nm)。如图3(a)和(c)，在同一激光密度下，复合水凝胶显示了类似的光热转化性能，与所辐射激光的波长关系不大。在同等条件下，生理盐水中的复合水凝胶的升温情况较图2有一定程度下降，表明复合水凝胶具有良好的热传导能力，能够及时地将产生的热量能传导至环境中。图3(b)和(d)中红外热成像照片也直观地证实了上述结论。总之，本发明制备的复合水凝胶展现出了良好的光热转换能力，有望进一步应用于肿瘤的光热治疗。
实施例5
光热稳定性及转化效率测定：各取0.1g方法一和二制备的复合水凝胶放置于96孔板中，然后加入0.1ml蒸馏水没过材料。施以5分钟激光照射(0.3w/cm2)后关闭光源，使之降温5分钟，并重复9个激光开/关循环。用flire60红外热像仪记录凝胶温度随时间的变化情况。由图4(a)和(b)可以看出，每个循环上升或者下降的趋势基本相同，且每个循环激光开启所达到的最高温和激光关闭所达到的最低温差别不大。根据公式所计算出来的两种复合水凝胶的光热转换效率分别为30.5％和41.8％，进一步说明复合水凝胶材料具有良好的光热转化性能。
实施例6
将l929细胞种植于96孔板中，加入100μl1640细胞培养基培养过夜。弃去上述培养基，并加入0.05g实施例1和2中两种方法得到的复合凝胶和100μl新的1640细胞培养基，对照组只添加100μl1640细胞培养基(存活率设定为100％)。将上述细胞置于co2恒温培养箱中孵育24h，用cck-8及live/dead细胞活性检测试剂盒定量和定性检测细胞的存活情况。如图5(a)所示，两种方法得到的复合水凝胶均不会影响细胞的存活(经方法一和方法二制备的复合水凝胶培养的细胞存活率分别为98.41％和88.54％)。与对照组类似(图5(b))，两种复合水凝胶处理的细胞均可以被live/dead试剂染成绿色(活细胞被染成绿色)，几乎没有细胞被染成红色(死亡细胞被染成红色)。cck-8和live/dead细胞染色的结果表明两种方法制备的复合水凝胶均具有良好的细胞相容性。
实施例7
细胞治疗：在种植有ht29细胞的96孔板中分别加入0.05g由两种方法制备的复合水凝胶，并加入100μl1640细胞培养基，对照组为100μl1640细胞培养液(存活率设为100％)。用808nm和1064nm近红外激光(功率密度均为0.5w/cm2)照射5分钟，然后，用cck-8及live/dead细胞活性检测试剂盒处理实验细胞，并用酶标仪及显微镜观察细胞存活情况及形貌。由图6(a)可知，用激光照射复合水凝胶(方法一和方法二制备)处理的ht29细胞5min，其存活率较对照组明显降低，在细胞水平上证明了复合水凝胶具有优秀的肿瘤光热治疗效果。而且，两种水凝胶在808nm激光照射下对细胞产生的杀伤效果均优于同等功率密度的1064nm激光。与对照组相比(图6(b))，从图(c)中live/dead染色结果也可以看出1064nm激光照射后，癌细胞被染成绿色区域明显大于808nm激光，进一步说明808nm激光能够更好地与激发复合水凝胶，产生更好的光热治疗效果。负载药物后，复合水凝胶(方法二制备)对肿瘤的杀伤效果得到进一步提高(808nm激光照射，负载药物/未负载药物：26.53％/13.42％；1064nm激光照射，负载药物/未负载药物：32.32％/21.21％)，体现了水凝胶对肿瘤的光热治疗与化疗的协同作用。
实施例8
小鼠治疗：将小鼠肿瘤切除后，原位包埋0.05g载有药物的复合水凝胶(方法二制备)。用808nm激光照射肿瘤部位5分钟(0.5w/cm2)，用flire60型红外热像仪记录照射部位的温度。由图7(a)可已看出，经材料包埋的小鼠激光照射温度明显高于对照组，且808nm激光照射温差显著大于1064nm，说明了808nm激光小鼠治疗效果优于1064nm，图7(b)中的红外热成像图片也证实了这一点。808nm激光照射下，5分钟后温度可以升高60℃，这为高效杀死肿瘤的光热治疗奠定了基础。
实施例9
小鼠治疗：将小鼠肿瘤切除，然后，原位包埋0.05g载有药物的复合水凝胶(方法二制备)。用1064nm激光照射5分钟(0.5w/cm2)，用flire60型红外热像仪记录小鼠肿瘤切除部位局部温度随时间的变化关系。由图7(a)可已看出，经材料包埋的小鼠激光照射温度明显高于对照组，且808nm激光照射温差显著大于1064nm，说明了808nm激光小鼠治疗效果优于1064nm，图7(b)中的红外热成像图片也证实了这一点。808nm激光照射下，5分钟后温度可以升高60℃，这为高效杀死肿瘤的光热治疗奠定了基础。