本发明涉及农业微生物领域中预防动物腹泻的石榴皮微生态制剂及其应用。
背景技术：
大肠杆菌病(colibacillosisi)是由致病性大肠埃希氏菌引起的一组传染病，目前危害养殖业严重的主要是猪大肠杆菌病、禽大肠杆菌病、兔大肠杆菌病等。病原是肠道杆菌科埃希氏属的大肠埃希氏菌(e.coli)，简称大肠杆菌。猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的仔猪一组肠道传染性疾病。常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病三种。
中草药以其作用独特、安全、环保、价廉，病菌不易产生耐药性等优势，发挥着抗生素无法取代的作用而日益受到重视。中药防治猪细菌性肠道病已经取得较好的效果。赵坤等以石膏、滑石、白头翁、苍术等，王自然采用中药茜草、苦参等治疗仔猪大肠杆菌病，效果良好，治愈率达90％以上。
马齿苋为马齿苋科植物马齿苋portulacaoleraceal.的干燥地上部分。性味酸，寒。归肝、大肠经。具有清热解毒，凉血止血，止痢的功效。用于热毒血痢，痈肿疗疮，湿疹，丹毒，蛇虫咬伤，便血，痔血，崩漏下血。
石榴皮为石榴科植物石榴punicagranatuml.的干燥果皮。性味酸、涩，温。归大肠经。具有涩肠止泻，止血，驱虫的功效，用于久泻，久痢，便血，脱肛，崩漏，带下，虫积腹痛。
鱼腥草为三白草科植物蕺菜houttuyniacordatathunb.的新鲜全草或干燥地上部分。性味辛，微寒。归肺经。具有清热解毒，消痈排脓，利尿通淋的功效。用于肺痈吐脓，痰热喘咳，热痢，热淋，痈肿疮毒。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何预防动物腹泻。
为了解决以上技术问题，本发明提供了预防动物腹泻的中药微生态制剂。
本发明所提供的预防动物腹泻的中药微生态制剂(中药和菌剂的组合物)，其活性成分为石榴皮和抑制大肠杆菌的复合菌剂，所述抑制大肠杆菌的复合菌剂的活性成分由枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌组成。
上述中药微生态制剂中，所述枯草芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌accc02136，所述罗伊氏乳杆菌可为罗伊氏乳杆菌accc03949，所述酵母菌可为酿酒酵母accc21429。
上述中药微生态制剂中，所述抑制大肠杆菌的复合菌剂中，所述枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的菌落形成单位数目比可为1:1-4:1-4，如1:1:1。
上述中药微生态制剂中，所述石榴皮和所述抑制大肠杆菌的复合菌剂的配比满足每100克石榴皮：总菌体含量为0.3×108cfu的抑制大肠杆菌的复合菌剂。
上述中药微生态制剂中，所述总菌体含量是指所述抑制大肠杆菌的复合菌剂中所述枯草芽孢杆菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的菌落形成单位数目之和。
上述抑制大肠杆菌的复合菌剂也属于本发明的保护范围。
含有上述中药微生态制剂的动物饲料和含有上述抑制大肠杆菌的复合菌剂的动物饲料也属于本发明的保护范围。
石榴皮和上述抑制大肠杆菌的复合菌剂在制备预防动物腹泻或/和大肠杆菌病的产品(中药微生态制剂或饲料)中的应用也属于本发明的保护范围。
上述抑制大肠杆菌的复合菌剂在制备预防动物腹泻或/和大肠杆菌病的产品(中药微生态制剂或饲料)中的应用也属于本发明的保护范围。
本文中，所述大肠杆菌可为引起动物腹泻的大肠杆菌，如引起仔猪腹泻的大肠杆菌，如大肠埃希菌cvcc231。
本文中，所述动物可为哺乳动物，如猪和鼠。
本文中，所述抑制大肠杆菌的复合菌剂除活性成分外，还可包括辅料，如水、碳源和/或氮源等。碳源是微生物生长一类营养物，是含碳化合物，包括糖类、油脂、有机酸及有机酸酯和小分子醇等速效、迟效碳源。氮源是指提供微生物营养所需氮元素的物质，包括花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和硝酸盐等速效、迟效氮源。
本文中，所述抑制大肠杆菌的复合菌剂中的各种菌可以被培养的活细胞、活细胞的发酵液的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、粉剂或颗粒剂等。
实验证明，在含石榴皮的各组中，攻菌第1天的腹泻率最低的是石榴皮益生菌高剂量组为12.5％，攻菌第1天的腹泻率最高的是石榴皮益生菌低剂量组、石榴皮低剂量组、石榴皮中剂量组和益生菌组，均为37.5％，石榴皮益生菌高剂量组攻菌第1天的腹泻率降为石榴皮高剂量组的50.0％，石榴皮益生菌高剂量组攻菌第1天的腹泻率降为益生菌组的33.3％；含石榴皮的各组和益生菌组攻菌第2天和第3天的腹泻率均为0(表5)；说明石榴皮和枯草罗伊氏酵母复合菌剂在预防腹泻方面起到了协同作用。在对腹泻致病菌大肠埃希菌(cvcc231)的抑菌作用上，枯草罗伊氏酵母复合菌剂高于枯草芽孢杆菌accc02136菌剂、罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂和酿酒酵母accc21429菌剂的三者之和，说明在枯草罗伊氏酵母复合菌剂中，枯草芽孢杆菌accc02136、罗伊氏乳杆菌accc03949和酿酒酵母accc21429在抑制腹泻致病菌大肠埃希菌方面产生了协同作用(表1)。本发明的抑制大肠杆菌的复合菌剂和预防动物腹泻的中药微生态制剂可用于预防动物腹泻。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)accc02136于2007年7月20日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)accc02136在下文中简称枯草芽孢杆菌accc02136。
下述实施例中的罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)accc03949于2008年6月15日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)accc03949在下文中简称罗伊氏乳杆菌accc03949。
下述实施例中的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)accc21429于2017年2月24日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称accc，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)accc21429在下文中简称酵母菌accc21429。
大肠埃希菌cvcc231于1984年12月30日收藏于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(简称cvcc,地址：大兴生物医药基地庆丰路33号国家兽医微生物中心8号楼)自该收藏日起公众可从中国兽医微生物菌种保藏管理中心获得该菌株。大肠埃希菌cvcc231引起新生仔猪腹泻。
实施例1、抑制大肠杆菌的复合菌剂
本实施例的抑制大肠杆菌的复合菌剂是枯草罗伊氏酵母复合菌剂，它的活性成分由枯草芽孢杆菌accc02136，罗伊氏乳杆菌accc03949和酿酒酵母accc21429组成，该复合菌剂中，枯草芽孢杆菌accc02136，罗伊氏乳杆菌accc03949和酿酒酵母accc21429的菌落形成单位(cfu)数目比为1:1:1。
本实施例比较了该抑制大肠杆菌的复合菌剂和枯草芽孢杆菌accc02136菌剂、罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂、酿酒酵母accc21429菌剂和枯草罗伊氏复合菌剂对腹泻病原菌大肠埃希菌(cvcc231)的抑制作用，具体方法如下：
1、菌剂的制备
1.1酿酒酵母菌accc21429菌剂的制备
取保存的酵母菌accc21429于ypd培养基中28℃，140r/min，培养48h，得到酵母菌accc21429菌液。用无菌生理盐水稀释酵母菌accc21429菌液，得到酵母菌accc21429菌剂，该酵母菌accc21429菌剂中酵母菌accc21429的含量为1.2×107cfu/ml。
1.2罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂的制备
取保存的罗伊氏乳杆菌accc03949于mrs培养基中37℃，140r/min，培养24h，得到罗伊氏乳杆菌accc03949菌液。用无菌生理盐水稀释罗伊氏乳杆菌accc03949菌液，得到罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂，该罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂中罗伊氏乳杆菌accc03949的含量为1.2×107cfu/ml。
1.3枯草芽孢杆菌accc02136菌剂的制备
取保存的枯草芽孢杆菌accc02136于lb培养基中28℃，140r/min，培养24h，得到枯草芽孢杆菌accc02136菌液。用无菌生理盐水稀释枯草芽孢杆菌accc02136菌液，得到枯草芽孢杆菌accc02136菌剂，该枯草芽孢杆菌accc02136菌剂中枯草芽孢杆菌accc02136的含量为1.2×107cfu/ml。
1.4枯草罗伊氏酵母复合菌剂的制备
将1.1的酵母菌accc21429菌液、1.2的罗伊氏乳杆菌accc03949菌液和1.3的枯草芽孢杆菌accc02136菌液分别用无菌生理盐水稀释后混合，得到枯草罗伊氏酵母复合菌剂。该枯草罗伊氏酵母复合菌剂中，酵母菌accc21429的含量为0.4×107cfu/ml，罗伊氏乳杆菌accc03949的含量为0.4×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc02136的含量为0.4×107cfu/ml，即该枯草罗伊氏酵母复合菌剂中，总菌含量为1.2×107cfu/ml。
1.5、枯草罗伊氏复合菌剂的制备
将1.2的罗伊氏乳杆菌accc03949菌液和1.3的枯草芽孢杆菌accc02136菌液分别用无菌生理盐水稀释后混合，得到枯草罗伊氏复合菌剂。该枯草罗伊氏复合菌剂中，罗伊氏乳杆菌accc03949的含量为0.6×107cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc02136的含量为0.6×107cfu/ml，即该枯草罗伊氏复合菌剂中，总菌含量为1.2×107cfu/ml。
2、拮抗大肠杆菌的实验
2.1仔猪腹泻致病菌的活化
取保存的大肠埃希菌cvcc231到lb液体培养基中，37℃，140r/min培养24h。之后用无菌生理盐水进行10倍稀释计数，每个浓度设3个平行，临用前稀释至1.0×107cfu/ml，得到大肠杆菌菌液。
2.2罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂对大肠杆菌的拮抗实验
取100μl1.0×107cfu/ml的2.1的大肠杆菌菌液均匀地涂布在lb固体培养基上，每个培养基上放置4个牛津杯。每个牛津杯中分别加入200μl1.2×107cfu/ml的1.2的罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂。37℃培养24h，测定抑菌圈的大小。实验以2.1的大肠杆菌菌液、1.2罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂纯培养平板为对照组，以lb培养基为空白对照。
2.3枯草芽孢杆菌accc02136菌剂对大肠杆菌的拮抗实验
取100μl1.0×107cfu/ml的2.1的大肠杆菌菌液均匀地涂布在lb固体培养基上，每个培养基上放置4个牛津杯。每个牛津杯中分别加入200μl1.2×107cfu/ml的1.3的枯草芽孢杆菌accc02136菌剂。37℃培养24h，测定抑菌圈的大小。实验以2.1的大肠杆菌菌液、1.3的枯草芽孢杆菌accc02136菌剂纯培养平板为对照组，以lb培养基为空白对照。
2.4酵母菌accc21429菌剂对大肠杆菌的拮抗实验
取100μl1.0×107cfu/ml的2.1的大肠杆菌菌液均匀地涂布在lb固体培养基上，每个培养基上放置4个牛津杯。每个牛津杯中分别加入200μl1.2×107cfu/ml的1.1的酵母菌accc21429菌剂。37℃培养48h，测定抑菌圈的大小。实验以2.1的大肠杆菌菌液、1.1的酵母菌accc21429菌剂纯培养平板为对照组，以lb培养基为空白对照。
2.5枯草罗伊氏酵母复合菌剂对大肠杆菌的拮抗实验
取100μl1.0×107cfu/ml的2.1的大肠杆菌菌液均匀地涂布在lb固体培养基上，每个培养基上放置4个牛津杯。每个牛津杯中分别加入200μl总菌含量为1.2×107cfu/ml的1.4的枯草罗伊氏酵母复合菌剂。37℃培养24h，测定抑菌圈的大小。实验以2.1的大肠杆菌菌液、1.4的枯草罗伊氏酵母复合菌剂纯培养平板为对照组，以lb培养基为空白对照。
2.6枯草罗伊氏复合菌剂对大肠杆菌的拮抗实验
取100μl1.0×107cfu/ml的2.1的大肠杆菌菌液均匀地涂布在lb固体培养基上，每个培养基上放置4个牛津杯。每个牛津杯中分别加入200μl总菌含量为1.2×107cfu/ml的1.5的枯草罗伊氏复合菌剂。37℃培养24h，测定抑菌圈的大小。实验以2.1的大肠杆菌菌液、1.5的枯草罗伊氏复合菌剂纯培养平板为对照组，以lb培养基为空白对照。
结果表明在对腹泻致病菌大肠埃希菌(cvcc231)的抑菌作用上，枯草罗伊氏复合菌剂略高于枯草芽孢杆菌accc02136菌剂、罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂，但没有显著差异，枯草罗伊氏酵母复合菌剂却高于枯草芽孢杆菌accc02136菌剂、罗伊氏乳杆菌accc03949菌剂和酵母菌accc21429菌剂的三者之和。说明在枯草罗伊氏酵母复合菌剂中，枯草芽孢杆菌accc02136、罗伊氏乳杆菌accc03949和酵母菌accc21429在抑制腹泻致病菌大肠埃希菌方面产生了协同作用(表1)。
表1、各菌剂对大肠杆菌的抑制作用
实施例2、枯草罗伊氏酵母复合菌剂及中药微生态制剂预防腹泻的动物实验
1实验方法
1.1干姜水制备
取干姜，冷水浸泡2h后，大火煮沸，文火保持微沸40min，过滤，药渣中加入60-70℃温水煮沸，文火保持微沸30min，过滤，再次煎煮。合并三次滤液，浓缩至0.5g/ml，4℃保存备用。
1.2仔猪腹泻致病菌大肠埃希菌的菌种活化
取-20℃保存的大肠埃希菌cvcc231接种到lb液体培养基中，37℃，140rpm/min培养12h，显微计数法计数，临用前用无菌生理盐水稀释至7.5×107cfu/ml，得到大肠埃希菌菌液。
1.3药物的制备
1.3.1用于配置含药饲料的鱼腥草、马齿苋、石榴皮的制备
利用超微粉碎机将鱼腥草、马齿苋、石榴皮三种中药分别粉碎，得到用于配置含药饲料的鱼腥草、马齿苋、石榴皮。
1.3.2、中药微生态制剂的制备
1.3.2.1枯草罗伊氏酵母复合菌剂的制备
将实施例1中1.1的酵母菌accc21429菌液、1.2的罗伊氏乳杆菌accc03949菌液和1.3的枯草芽孢杆菌accc02136菌液分别用无菌生理盐水稀释后混合，得到枯草罗伊氏酵母复合菌剂。该枯草罗伊氏酵母复合菌剂中，酵母菌accc21429的含量为0.5×108cfu/ml，罗伊氏乳杆菌accc03949的含量为0.5×108cfu/ml，枯草芽孢杆菌accc02136的含量为0.5×108cfu/ml，即该枯草罗伊氏酵母复合菌剂中，总菌含量为1.5×108cfu/ml。
1.3.2.2马齿苋微生态制剂1的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的马齿苋与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入1.0ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到马齿苋微生态制剂1，该马齿苋微生态制剂1中，马齿苋的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为1.5×108cfu/110g。
1.3.2.3马齿苋微生态制剂2的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的马齿苋与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入0.4ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到马齿苋微生态制剂2，该马齿苋微生态制剂2中，马齿苋的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为0.6×108cfu/110g。
1.3.2.4马齿苋微生态制剂3的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的马齿苋与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入0.2ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到马齿苋微生态制剂3，该马齿苋微生态制剂3中，马齿苋的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为0.3×108cfu/110g。
1.3.2.5石榴皮微生态制剂1的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的石榴皮与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入1.0ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到石榴皮微生态制剂1，该石榴皮微生态制剂1中，石榴皮的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为1.5×108cfu/110g。
1.3.2.6石榴皮微生态制剂2的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的石榴皮与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入0.4ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到石榴皮微生态制剂2，该石榴皮微生态制剂2中，石榴皮的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为0.6×108cfu/110g。
1.3.2.7石榴皮微生态制剂3的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的石榴皮与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入0.2ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到石榴皮微生态制剂3，该石榴皮微生态制剂3中，石榴皮的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为0.3×108cfu/110g。
1.3.2.8鱼腥草微生态制剂1的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的鱼腥草与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入1.0ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到鱼腥草微生态制剂1，该鱼腥草微生态制剂1中，鱼腥草的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为1.5×108cfu/110g。
1.3.2.9鱼腥草微生态制剂2的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的鱼腥草与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入0.4ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到鱼腥草微生态制剂2，该鱼腥草微生态制剂2中，鱼腥草的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为0.6×108cfu/110g。
1.3.2.10鱼腥草微生态制剂3的制备
每100g的1.3.1的用于配置含药饲料的鱼腥草与10g的蒙脱石吸附剂混合均匀后加入0.2ml的1.3.2.1的枯草罗伊氏酵母复合菌剂，通风干燥后得到鱼腥草微生态制剂3，该鱼腥草微生态制剂3中，鱼腥草的质量含量为90.9％，枯草罗伊氏酵母复合菌剂的含量以总菌体含量计为0.3×108cfu/110g。
1.4含药饲料制备
分别向基础饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司产品)中添加1.3的药物得到含药饲料，具体如下。
1.4.1鱼腥草低剂量饲料、鱼腥草中剂量饲料和鱼腥草高剂量饲料
将1.3.1的用于配置含药饲料的鱼腥草加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，分别制成鱼腥草含量为1g/kg的鱼腥草低剂量饲料、鱼腥草含量为2.5g/kg的鱼腥草中剂量饲料和鱼腥草含量为5g/kg的鱼腥草高剂量饲料。
1.4.2马齿苋低剂量饲料、马齿苋中剂量饲料和马齿苋高剂量饲料
将1.3.1的用于配置含药饲料的马齿苋粉碎后加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，分别制成马齿苋含量为1g/kg的马齿苋低剂量饲料、马齿苋含量为2.5g/kg的马齿苋中剂量饲料和马齿苋含量为5g/kg的马齿苋高剂量饲料。
1.4.3石榴皮低剂量饲料、石榴皮中剂量饲料和石榴皮高剂量饲料
将1.3.1的用于配置含药饲料的石榴皮粉碎后加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，分别制成石榴皮含量为1g/kg的石榴皮低剂量饲料、石榴皮含量为2.5g/kg的石榴皮中剂量饲料和石榴皮含量为5g/kg的石榴皮高剂量饲料。
1.4.4马齿苋微生态制剂低剂量饲料、马齿苋微生态制剂中剂量饲料和马齿苋微生态制剂高剂量饲料
将1.3.2.2的马齿苋微生态制剂1加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成马齿苋含量为1g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的马齿苋微生态制剂低剂量饲料。
将1.3.2.3的马齿苋微生态制剂2加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成马齿苋含量为2.5g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的马齿苋微生态制剂中剂量饲料。
将1.3.2.4的马齿苋微生态制剂3加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成马齿苋含量为5g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的马齿苋微生态制剂高剂量饲料。
1.4.5石榴皮微生态制剂低剂量饲料、石榴皮微生态制剂中剂量饲料和石榴皮微生态制剂高剂量饲料
将1.3.2.5的石榴皮微生态制剂1加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成石榴皮含量为1g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的石榴皮微生态制剂低剂量饲料。
将1.3.2.6的石榴皮微生态制剂2加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成石榴皮含量为2.5g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的石榴皮微生态制剂中剂量饲料。
将1.3.2.7的石榴皮微生态制剂3加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成石榴皮含量为5g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的石榴皮微生态制剂高剂量饲料。
1.4.6鱼腥草微生态制剂低剂量饲料、鱼腥草微生态制剂中剂量饲料和鱼腥草微生态制剂高剂量饲料
将1.3.2.8的鱼腥草微生态制剂1加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成鱼腥草含量为1g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的鱼腥草微生态制剂低剂量饲料。
将1.3.2.9的鱼腥草微生态制剂2加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成鱼腥草含量为2.5g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的鱼腥草微生态制剂中剂量饲料。
将1.3.2.10的鱼腥草微生态制剂3加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，制成鱼腥草含量为5g/kg、枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的鱼腥草微生态制剂高剂量饲料。
1.4.7复合菌剂饲料
每10g的蒙脱石吸附剂与1ml的1.3.2.1的复合菌剂混匀，通风干燥后与加入到粉碎后的基础饲料中，混匀后加水搅拌，得到枯草罗伊氏酵母复合菌剂含量以总菌体含量计为1.5×106cfu/kg的复合菌剂饲料。
1.5动物分组及处理
昆明小鼠，雄性，18-22g，适应性生长3d，随机分为21组，每组8只，具体分组见表2。除空白组外，其它各组每只小鼠在饲喂表2中的相应饲料10d后，灌胃1.1的干姜水(0.028ml/g体重)，1次/d，连续灌胃干姜水10d后连续3天每天腹腔注射7.5×107cfu/ml的1.2的大肠埃希菌菌液，制造腹泻模型。实验结束后，采集小鼠血清样品，以备后续检测。空白组不灌胃1.1的干姜水也不腹腔注射7.5×107cfu/ml的1.2的大肠埃希菌菌液，每天饲喂基础饲料。按照各检测指标的说明书采用全自动生化仪检测小鼠血清样品中的肝功能以及电解质水平。
表2、动物分组及饲喂的饲料
2实验结果
实验各组小鼠在实验期间均无死亡。从正式实验第1天开始计的体重的测定结果如表3和表4所示，模型组小鼠发生腹泻后体重明显降低。分析马齿苋各用药组发现，马菌3和马3的体重与空白组差异不显著，而显著高于模型组，表明马菌3和马3能够抵抗大肠杆菌感染对小鼠生长性能的影响。分析石榴皮各用药组发现，石菌3和石3的体重与空白组差异不显著，而显著高于模型组，表明石菌3和石3能够抵抗大肠杆菌感染对小鼠生长性能的影响。
表3、马齿苋各用药组小鼠的体重变化情况(均值±标准误)
注：马1为马齿苋低剂量组，马2为马齿苋中剂量组，马3为马齿苋高剂量组，马菌1为马齿苋益生菌低剂量组，马菌2为马齿苋益生菌中剂量组，马菌3为马齿苋益生菌高剂量组；不具有相同字母的处理间具有显著差异，具有相同字母的处理间不具有显著差异。
表4、石榴皮各用药组小鼠体重变化情况(均值±标准误)
注：石1为石榴皮低剂量组，石2为石榴皮中剂量组，石3为石榴皮高剂量组，石菌1为石榴皮益生菌低剂量组，石菌2为石榴皮益生菌中剂量组，石菌3为石榴皮益生菌高剂量组；不具有相同字母的处理间具有显著差异，具有相同字母的处理间不具有显著差异。
实验各组小鼠腹泻率情况见表5。腹泻率为该组腹泻只数/总只数。由表5可知：
1、模型组小鼠在攻菌第1天、攻菌第2天和攻菌第3天的腹泻率分别为87.5％、50.0％和50.0％，显著高于其它用药组。
2、益生菌组，攻菌第1天的腹泻率降为模型组的42.9％，攻菌第2天和攻菌第3天的腹泻率均为0，说明该枯草罗伊氏酵母复合菌剂起到了预防腹泻的作用。
3、在含马齿苋的各组中，攻菌第1天的腹泻率最低的是马齿苋益生菌高剂量组，为12.5％；攻菌第1天的腹泻率最高的是马齿苋益生菌低剂量组，为37.5％；马齿苋益生菌高剂量组攻菌第1天的腹泻率降为马齿苋高剂量组的50.0％，马齿苋益生菌高剂量组攻菌第1天的腹泻率降为益生菌组的33.3％；马齿苋益生菌高剂量组和益生菌组攻菌第2天和第3天的腹泻率均为0，马齿苋高剂量组的攻菌第2天和第3天的腹泻率分别为25.0％和12.5％；说明马齿苋和枯草罗伊氏酵母复合菌剂在预防腹泻方面起到了协同作用。
4、在含石榴皮的各组中，攻菌第1天的腹泻率最低的是石榴皮益生菌高剂量组为12.5％，攻菌第1天的腹泻率最高的是石榴皮益生菌低剂量组、石榴皮低剂量组、石榴皮中剂量组和益生菌组，均为37.5％，石榴皮益生菌高剂量组攻菌第1天的腹泻率降为石榴皮高剂量组的50.0％，石榴皮益生菌高剂量组攻菌第1天的腹泻率降为益生菌组的33.3％；含石榴皮的各组和益生菌组攻菌第2天和第3天的腹泻率均为0；说明石榴皮和枯草罗伊氏酵母复合菌剂在预防腹泻方面起到了协同作用。
5、在含鱼腥草的各组中，攻菌第1天的腹泻率最低的是鱼腥草益生菌中剂量组和鱼腥草益生菌高剂量组，均为37.5％，与益生菌组攻菌第1天的腹泻率相同；攻菌第2天和第3天的腹泻率最低的是鱼腥草益生菌高剂量组、鱼腥草中剂量组和鱼腥草高剂量组，均为0％，与益生菌组攻菌第2天和第3天的腹泻率相同；说明鱼腥草和该枯草罗伊氏酵母复合菌剂在预防腹泻方面没有产生协同作用。
表5、各组的腹泻率
注：攻菌第1天为第一次腹腔注射大肠埃希菌菌液后24小时，攻菌第2天为第二次腹腔注射大肠埃希菌菌液后24小时，攻菌第3天为第三次腹腔注射大肠埃希菌菌液后24小时。
血清中的丙氨酸氨基转移酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、乳酸脱氢酶(ldh)、葡萄糖(glu)、钠(na)氯(cl)和钾(k)检测结果如表6和表7所示，模型组小鼠发生腹泻，导致肝功能以及部分电解质紊乱，小鼠腹泻模型建造成功。分析比较马齿苋各用药组的作用效果发现，马菌3(马齿苋益生菌高剂量组)的效果优于其他用药组，能够很好的恢复腹泻造成的机体功能损伤。分析比较各石榴皮各用药组的作用效果发现，石菌3(石榴皮益生菌高剂量组)的效果优于其他用药组，能够很好的恢复腹泻造成的机体功能损伤。
表6、马齿苋各组生化指标变化(均值±标准误)
注：马1为马齿苋低剂量组，马2为马齿苋中剂量组，马3为马齿苋高剂量组，马菌1为马齿苋益生菌低剂量组，马菌2为马齿苋益生菌中剂量组，马菌3为马齿苋益生菌高剂量组；不具有相同字母的处理间具有显著差异，具有相同字母的处理间不具有显著差异。
表7、石榴皮各组生化指标的变化(均值±标准误)
注：石1为石榴皮低剂量组，石2为石榴皮中剂量组，石3为石榴皮高剂量组，石菌1为石榴皮益生菌低剂量组，石菌2为石榴皮益生菌中剂量组，石菌3为石榴皮益生菌高剂量组；不具有相同字母的处理间具有显著差异，具有相同字母的处理间不具有显著差异。