本发明涉及凝结芽孢杆菌在制备预防或治疗慢性疲劳综合征制剂中的应用，具体是用凝结芽孢杆菌预防或治疗慢性疲劳综合征。
背景技术：
：慢性疲劳综合征(cfs)是机体躯体及精神上长期过度消耗不能缓解，以反复出现、不易消除的严重功能紊乱为特征的疾病。该病对患者的记忆力、注意力、工作、教育和个人活动带来严重的影响。随着现代生活节奏的加快，cfs的发病率呈现上升趋势。据美国疾病控制中心(cdc)预测：慢性疲劳已成为21世纪影响人类健康的主要疾病之一，我国该病的发病率也正逐年上升，涉及我国城市人口的10％—25％，且女性高于男性，高发年龄段为31-50岁，严重危害着国人的健康。由于cfs病因不明，目前尚无特效治疗方法。目前，慢性疲劳综合征的药物治疗以缓解临床症状为主。由于患者对很多药物都表现出高度敏感性，特别是影响中枢神经系统的药物，因此，一般治疗策略是从小剂量开始，逐步加量，此外还需慎用可引起疲劳副反应的药物。药物治疗仅缓解症状，并不能有效的治疗疾病，且所用药物长期服用会产生多种毒副作用。本发明人经过研究发现，凝结芽孢杆菌能够有效预防或治疗慢性疲劳综合征，安全没有任何毒副作用，效果优于双歧杆菌，且未见相关研究报道，特申请此发明专利。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能预防或治疗慢性疲劳综合征的制剂，该制剂由凝结芽孢杆菌制成。本发明的制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知的能实现的制备工艺均可以：采取可能含凝结芽孢杆菌的样品，然后将样品置于灭菌瓶内，研究时从中取一定量的样品加入18ml灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度，分别涂布于凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于培养箱内，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，然后根据《伯杰细菌鉴定手册》、相关细菌鉴定文献或16srrna序列对比分析进行凝结芽孢杆菌鉴定和毒性试验，将无毒性的凝结芽孢杆菌干燥菌粉按需要比例添加辅料制成片剂、胶囊、散剂、粉剂或液体制剂等各种剂型，也可加入其他活菌或低聚果糖等低聚糖起到协同作用。凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于：纯化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，酵母粉5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温801.0ml，碳酸钙20g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，调ph6.2-6.5，115℃高压灭菌20min。凝结芽孢杆菌液体扩增培养基优选但不局限于：纯化水1000ml，蛋白胨10g，牛肉浸取物3g，氯化钠5g，葡萄糖5g，调ph7，115℃高压灭菌20min。为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的凝结芽孢杆菌，本发明所述凝结芽孢杆菌并不局限于为说明本发明所述的菌，只要无毒性的凝结芽孢杆菌均是本发明所述，均在本发明的保护范围内。本发明所述凝结芽孢杆菌优选但不限于凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌保藏编号cgmccno.1.2407。本发明实施说明中优选使用的凝结芽孢杆菌的细菌学性质：1、为说明本发明，本发明利用上述方法分离的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207。2、菌落形态显微镜观察：杆状，革兰氏染色阳性。平板形态：菌落呈白色、圆形、边缘整齐、大小2-3mm。3、生理生化鉴定明胶液化：－；过氧化氢酶：+；vp试验：+；苯丙氨酸脱氨酶试验－。4、糖酵解实验鉴定葡萄糖：+；麦芽糖：+；蔗糖：+；木糖：－；果糖：+；鼠李糖：－；乳糖：+；菊粉：+；半乳糖：+；糊精：+。5、分离的菌进行16srrna基因测序，测得序列用blast与genbank和rdp数据库中的基因序列进行相似性分析，确定分离的菌为凝结芽孢杆菌。本发明所述的凝结芽孢杆菌指活的生物个体。本发明是以有效剂量按上述方法分离的凝结芽孢杆菌作为主要活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等辅料，制成任何一种适合于使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、粉剂等剂型。本发明所述凝结芽孢杆菌作为主要药物活性成份制成活菌制剂。本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可达到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上。本发明所指有效剂量是指按上述方法分离的凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可达到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。本发明所述制剂包括凝结芽孢杆菌单独应用或与其他药物联合应用，尤其包括凝结芽孢杆菌单独应用或与双歧杆菌联合应用。本发明所述双歧杆菌指活的生物个体。本发明所述双歧杆菌联合应用的制剂中，固体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106cfu/g，一般在1×107cfu/g以上，最高可达到1×1012cfu/g或1×1012cfu/g以上；或液体制剂包含的双歧杆菌总活菌数不低于1×106cfu/ml，一般在1×107cfu/ml以上，最高可达到1×1012cfu/ml或1×1012cfu/ml以上。由于本发明首次公开了凝结芽孢杆菌作为主要活性成份制成制剂在预防或治疗慢性疲劳综合征中的应用，因此含上述凝结芽孢杆菌的制剂在预防或治疗慢性疲劳综合征制剂中的应用均属于本发明的保护范围。本发明所述的凝结芽孢杆菌在制成任何一种剂型时，均具有预防或治疗慢性疲劳综合征的作用。如果其组份中含有凝结芽孢杆菌成份制备成制剂，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有预防或治疗慢性疲劳综合征的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的凝结芽孢杆菌可以制成药品、保健食品、食品或饮品等。具体实施方式制备例说明：上述已经对凝结芽孢杆菌制剂的制备进行说明，这里通过凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌保藏编号cgmccno.1.2407(凝结芽孢杆菌保藏编号cgmccno.1.2407购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)为例进行具体说明，其他凝结芽孢杆菌菌种制剂的制备方法本领域技术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握，在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。制备实施例1凝结芽孢杆菌粉剂的制备1菌粉的制备和菌种的鉴定采取人的粪便、土壤、草垛底物等样品，然后将样品置于灭菌瓶内，从中取2克样品加入18ml灭菌的稀释液中，充分混匀，在无菌操作台内，进行10-1、10-2、10-3、10-4，10-5，10-6，10-7梯度稀释，取10-5，10-6，10-7三个稀释梯度，涂布于凝结芽孢杆菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于培养箱，37℃下培养48小时，选择长势良好的单菌落接种到凝结芽孢杆菌液体扩增培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109cfu/g以上，然后进行菌种鉴定，经生理生化和16srrna序列对比分析鉴定为凝结芽孢杆菌，为凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207。凝结芽孢杆菌保藏编号cgmccno.1.2407菌粉制备，将凝结芽孢杆菌保藏编号cgmcc1.2407接种到凝结芽孢杆菌液体扩增培养基中，37℃下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数均为1×109cfu/g以上。2毒性试验2.1动物及分组取30只spf级别小鼠，6-8周龄，体重14-18g，随机分凝结芽孢杆菌cgmccno.1207组、凝结芽孢杆菌cgmccno.1.2407组和未给药组，每组10只。2.2制备菌液将上述不同的凝结芽孢杆菌菌粉分别用纯化水调制为含菌数均为1×109cfu/ml的菌液。2.3方法各凝结芽孢杆菌组和未给药组均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，各凝结芽孢杆菌组每天灌服凝结芽孢杆菌菌液0.5ml，未给药组每天灌服纯化水0.5ml，饲喂14天，观察体重及毒性反应。2.4结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，未见中毒反应。3制备成粉剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定后，经实验检验无毒性，就可将凝结芽孢杆菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据凝结芽孢杆菌菌粉的活菌数，按比例添加淀粉制成粉剂，使活菌数不低于1×107cfu/g，然后装袋。应用效果实施例说明：本发明以凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207或凝结芽孢杆菌保藏编号cgmccno.1.2407为代表说明凝结芽孢杆菌的应用效果。本发明中使用的双歧杆菌来自于市场销售产品，公众能够购买到的双歧杆菌活菌均可。应用效果实施例1：凝结芽孢杆菌在治疗慢性疲劳综合征中的应用1模型组制备：1.1实验动物健康雄性wistar大鼠，体重(180±20)g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。实验前适应饲养一周：按昼夜节律采光12h，控制温度、湿度，自由摄取食物和水，每日定时更换饲料，通风良好，排除其它应激因素干扰。1.2制备方式采用强制冷水游泳法(1d)+慢性束缚法(2d)的方式建立大鼠慢性疲劳综合征模型，共计造模21d。游泳水温为(10±1)℃，每次游泳持续时间为6～8min，慢性束缚持续时间为3h，每次造模时间随机。1.3模型组制备结果造模成功。2药物治疗实验：2.1实验方法选取体重(180±20)g的健康雄性wistar大鼠50只，随机分为正常对照组(n＝10)、凝结芽孢杆菌cgmccno.1207组(n＝10)、凝结芽孢杆菌cgmccno.1.2407组(n＝10)、双歧杆菌组(n＝10)、模型对照组(n＝10)。所有对象均给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致。正常对照组不做任何处理，各治疗组和模型对照组按1.2所述方式建立小鼠慢性疲劳综合征模型，并于模型建立的第1天起，凝结芽孢杆菌(cgmccno.1207、cgmccno.1.2407)和双歧杆菌治疗组使用含菌数为1×106cfu/ml(用0.9％生理盐水调制菌粉)的菌液灌服0.5ml，模型对照组和正常对照组每天灌服0.9％生理盐水0.5ml，直至第21天结束。观察凝结芽孢杆菌对慢性疲劳综合征大鼠行为学的影响，并与双歧杆菌进行比较。2.2行为学评估对实验鼠进行行为学评估，包括体力和精神疲劳检测(鼠尾悬挂实验)和学习记忆测试(moirrs水迷宫测试)。数据使用spss21.0进行统计学分析。3结果3.1体力和精神疲劳评估与对照组相比较，慢性疲劳综合征模型大鼠鼠尾悬挂不动时间增加(p＜0.01)，差别有统计学意义。与慢性疲劳综合征模型大鼠相比，凝结芽孢杆菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治疗后，大鼠鼠尾悬挂不动时间降低(p＜0.01)，差异具有统计学意义。与双歧杆菌治疗组大鼠相比，凝结芽孢杆菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治疗组鼠尾悬挂不动时间降低(p＜0.05)，差异具有统计学意义。凝结芽孢杆菌cgmccno.1207组和cgmccno.1.2407组之间，大鼠鼠尾悬挂不动时间无统计学差异(p＞0.05)。凝结芽孢杆菌对慢性疲劳综合征大鼠的体力和精神疲劳有显著改善作用，并显著高于双歧杆菌治疗组。见表1。表1不同组别大鼠鼠尾悬挂行为变化统计分析组别例数鼠尾悬挂不动时间(s)正常对照组10144.20±11.17模型对照组10193.25±14.69双歧杆菌治疗组10174.22±12.58凝结芽孢杆菌cgmccno.1207组10157.71±12.62凝结芽孢杆菌cgmccno.1.2407组10154.41±12.443.2学习记忆能力评估与对照组相比较，慢性疲劳综合征模型大鼠学习记忆能力差(p＜0.01)，差异有统计学意义；与慢性疲劳综合征模型大鼠相比，凝结芽孢杆菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治疗后，大鼠学习记忆能力提高(p＜0.01)，差异有统计学意义；与双歧杆菌治疗组大鼠相比，凝结芽孢杆菌cgmccno.1207和cgmccno.1.2407治疗组大鼠学习记忆能力提高(p＜0.05)，差异有统计学意义；凝结芽孢杆菌cgmccno.1207组和cgmccno.1.2407组之间，大鼠学习记忆能力无统计学差异(p＞0.05)。凝结芽孢杆菌能显著提高慢性疲劳综合征大鼠的学习记忆能力，其效果显著高于双歧杆菌。见表2。表2不同组别大鼠学习记忆能力统计分析组别例数学习记忆能力(s)正常对照组1023.78±10.83模型对照组1068.25±14.58双歧杆菌治疗组1052.24±12.30凝结芽孢杆菌cgmccno.1207组1036.85±12.11凝结芽孢杆菌cgmccno.1.2407组1038.52±11.624讨论慢性疲劳综合征模型组和正常对照组相比大鼠的体力和精神疲劳显著增加(p＜0.01)，学习记忆能力显著变差(p＜0.01)，而经凝结芽孢杆菌治疗后，体力和精神疲劳降低(p＜0.01)，学习记忆能力提高(p＜0.01)，且疗效显著好于双歧杆菌治疗组。表明凝结芽孢杆菌干预能显著减少慢性疲劳综合征大鼠的慢性疲劳综合征症状。凝结芽孢杆菌制剂能够有效预防或治疗慢性疲劳综合征，明显减少慢性疲劳综合征症状，且无任何毒副作用，应用依从性好，是预防或治疗慢性疲劳综合征的新方法、新突破。本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2004年8月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏。分类命名：凝结芽孢杆菌bacilluscoagulans,保藏编号cgmccno.1207。凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207由本发明申请单位自行分离获得，已在商业渠道销售，并且已经授权专利保护(专利号200410098660.4)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明，因此，本发明未提供凝结芽孢杆菌tbc169保藏编号cgmccno.1207保藏证明。凝结芽孢杆菌cgmccno.1.2407购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。当前第1页12