本发明涉及一种灵芝的提取方法，特别是一种灵芝多糖含量高的灵芝的提取方法。
背景技术：
灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。灵芝是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属，在我国有两千多年的药用史。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为灵芝能治疗多种疾病，是滋补强壮扶正固本的珍贵药物。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，存在于灵芝的子实体、孢子粉和菌丝体中，具有抑制肿瘤、增强机体对自由基清除的能力，故能减少自由基对机体的损伤、有延缓衰老之功效，还可以提高免疫力、抗炎症、降血脂、降血糖等作用。
灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，存在于灵芝的子实体、孢子粉和菌丝体中，具有抑制肿瘤、增强机体对自由基清除的能力，故能减少自由基对机体的损伤、有延缓衰老之功效，还可以提高免疫力、抗炎症、降血脂、降血糖等作用。如果将灵芝进行加工，更能有利于灵芝药效的发挥，现有技术中对灵芝进行加工时，通常是直接将灵芝粉碎成粉，但是发明人在研究过程中发现，采用现有技术对灵芝进行加工时，灵芝的有效成分多糖不易测出，使得灵芝的的药效还不够理想。
技术实现要素：
本发明的目的，是提供一种灵芝的提取方法。本发明对灵芝的具体提取工艺进行了改进，使得灵芝的有效成分多糖容易测出，且测出的多糖含量高，使得灵芝的药效好。
本发明是这样实现的。
一种灵芝的提取方法，取干燥的灵芝子实体，切碎，于-25℃-20℃下冷冻后，解冻，用乙醇溶液加热回流提取，滤过，滤渣备用，提取液减压回收乙醇，浓缩液加水，上大孔吸附树脂，加水洗脱，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得醇提取液，备用；滤渣中加入氢氧化钾水溶液，文火加热至50-60℃后，保温，加入活性炭，静置，过滤，滤液与上述醇提取液合并，浓缩，即得。
前述的灵芝的提取方法，具体包括以下步骤：
（1）取干燥的灵芝子实体，切碎，于-25℃-20℃下冷冻10-12h，得a品；
（2）a品常温下解冻后，用10-12倍量的浓度为70-80%的乙醇溶液加热回流提取2-3次，每次1-2小时，滤过，滤渣备用，提取液减压回收乙醇，得浓缩液，即b品；
（3）b品加水至体积每毫升与药材量每克之比为1-3：3-1，上大孔吸附树脂，加水洗脱4-10倍柱体积，再用浓度为30-70%乙醇洗脱4-10倍柱体积，收集洗脱液，回收乙醇，得醇提取液，即c品；
（4）滤渣中加入15-25倍量的浓度为0.5-1%的氢氧化钾水溶液，文火加热至50-60℃后，保温20-30min，加入活性炭，静置3-5h后，过滤，收集滤液，得d品；
（5）d品与c品合并，浓缩至50-60℃下相对密度为1.1-1.2的浸膏，即得。
前述的灵芝的提取方法中，所述步骤（1）中，冷冻时间为11h。
前述的灵芝的提取方法中，所述步骤（2）中，a品常温下解冻后，用11倍量的浓度为75%的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1.5小时，滤过，滤渣备用，提取液减压回收乙醇，得浓缩液，即b品。
前述的灵芝的提取方法中，所述步骤（3）中，b品加水至体积每毫升与药材量每克之比为1：1.5，上大孔吸附树脂，加水洗脱7倍柱体积，再用50%乙醇洗脱7倍柱体积，收集洗脱液，回收乙醇，得醇提取液，即c品。
前述的灵芝的提取方法中，所述步骤（4）中，滤渣中加入20倍量的浓度为0.8%的氢氧化钾水溶液，文火加热至50-60℃后，保温25min，加入活性炭，静置4h后，过滤，收集滤液，得d品。
前述的灵芝的提取方法中，所述活性炭的加入量为滤渣重量的0.4-0.6倍。
前述的灵芝的提取方法中，所述活性炭的加入量为滤渣重量的0.5倍。
申请人对灵芝的提取方法进行了大量的研究，部分如下：
实验例多糖含量测定
1测定项目：
1.1灵芝1：按实施例1加工得到的灵芝浸膏，干燥，粉碎，得到灵芝粉。
灵芝2：将灵芝烘干后，直接粉碎得到的灵芝粉。
方法
2.1苯酚溶液的配制
精确称量分析纯苯酚晶体5g于250ml，加入蒸馏水60ml，放入50℃水浴中使其溶解，再于100ml容量瓶中定容，即得5%苯酚溶液。苯酚可以被空气氧化，所以苯酚溶液现配现用。
样品溶液的制备
2.2.1灵芝1样品溶液：取灵芝1，0.5g于500ml烧杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒温水浴槽中加热30分钟，过滤。重复以上操作两次，以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间，过滤后取滤液加蒸馏水定容至500ml。
灵芝2样品溶液：取灵芝3，0.5g于500ml烧杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒温水浴槽中加热30分钟，过滤。重复以上操作两次，以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间，过滤后取滤液加蒸馏水定容至500ml。
分光光度法测定多糖含量
2.3.1标准曲线的绘制。精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。取50ml洗净的容量瓶6只。分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml，加入蒸馏水定容，即得到浓度分别为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖标准溶液。测定时取1ml各浓度葡萄糖标准溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速入5％苯酚溶液以及98％浓硫酸适量，摇匀后放置于室温下显色20min。另取lml蒸馏水，同上加入苯酚溶液和浓硫酸，做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数r。
灵芝1多糖含量测定：取lml灵芝1样品溶液加入到20ml具塞比色管中，采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸，于特定波长处测定吸光度，将吸光度带入标准曲线方程，计算得出样品液浓度c。按下式计算出所取多糖含量，多糖含量(%)=cv/m，c为样品液浓度，v为样品液体积，m为取样的质量。
灵芝2多糖含量测定：取lml灵芝2样品溶液加入到20ml具塞比色管中，采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸，于特定波长处测定吸光度，将吸光度带入标准曲线方程，计算得出样品液浓度c。按下式计算出所取多糖含量，多糖含量(%)=cv/m，c为样品液浓度，v为样品液体积，m为取样的质量。
结果
3.1最大吸收波长的确定
取lml0.05mg/ml葡萄糖标准溶液，加入苯酚溶液和浓硫酸后反应一段时间后。在450-520nm波长区间进行光谱扫描，确定其最大吸收波长，发现在488nm波长处，所得吸光度值最大，无其他杂峰，则最佳测定波长选用488nm。
苯酚溶液用量的确定
取相同浓度的葡萄糖标准液1ml于6支20ml具塞比色管中，分别加入0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml的5％苯酚溶液，再依次加入5ml98％浓硫酸，混合摇匀。放置于20℃温度下显色30分钟，在488nm波长处测定吸光度值。当加入苯酚溶液1.0ml时，吸光度值最大，加入苯酚溶液过多反而会引起吸光度降低，所以实验中5%苯酚溶液的最佳加入量应当为1ml。
浓硫酸用量的确定
取相同浓度的葡萄糖标准溶液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各加入5％苯酚溶液lml，依次滴加浓硫酸4.0ml、4.5ml、5.0ml、5.5m、6.0ml。于488nm波长处测定其吸光度，发现硫酸加入量为5ml时所测得的吸光度值达到最大，加入硫酸过少则反应不够完全。加入硫酸过多可能导致其他副反应，导致测定结果降低，所以最佳硫酸加入量为5ml。
显色温度的确定
分别取一定浓度葡萄糖标准液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％浓硫酸5ml，分别放于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃温度下显色30min，在489nm波长处测定其吸光度。在各温度下，测得的吸光度基本不变，所以温度对反应吸光度基本无影响，在室温下就能够完全反应。
显色时间的确定
分别取一定浓度葡萄糖标准液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％浓硫酸5ml，分别于室温下显色10min、20min、30min、40min、50min，在488nm波长处测定其吸光度。发现，反应10分钟吸光度值较小，显色时间从20到50分钟，样品溶液的吸光度基本不变，所以反应时间控制在20分钟以上就基本能够反应完全。所以反应时间控制在20分钟以上就能达到最佳效果。
综合以上测定结果，得出苯酚硫酸法最佳测定条件参数：1m样品液，5％苯酚溶液加入量为1ml，98％浓硫,酸加入量为5ml，显色温度室温即可，显色时间为20分钟以上，最大吸收波长为488nm。
标准曲线的绘制
精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。取50ml洗净的容量瓶6只，分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml。加入蒸馏水定容，即得到浓度分别为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、00.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖标准溶液。测定时取1ml各浓度葡萄糖标准溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速加入5％苯酚溶液以及98％浓硫酸适量，摇匀后放置于室温下显色20min。另取lml蒸馏水，同上加入苯酚溶液和浓硫酸，做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数r。准确称量葡萄糖0．0520g。标准曲线方程为y=9.0803x-0.0385，相关系数r值为0.9984，线性较好，线性范围10.5-63.0ug/ml。
重复性试验
采用苯酚硫酸法平行取样品溶液测定5次，得到rsd=1.18％，说明精密度较高，能满足定量分析的要求。
加标回收率
分别准确移取灵芝1样品溶液、灵芝2样品溶液各0.5ml于20ml具塞比色管中，分别准确移取0.005mg/ml、0.010mg/ml的标准溶液，0.5ml加入样液中，测定多糖含量计算平均回收率。平均回收率为97.64%，97.50%。rsd为1.2%，1.1%。回收率高，说明此法结果准确率高。
含量测定结果
分别取灵芝1、灵芝2，平行分成6份，制成灵芝1样品溶液、灵芝2样品溶液，按上述方法进行测定，记录数据，结果取平均值。得到结果见表1。
表1灵芝多糖含量测定结果
由表可知，本发明提取工艺得到的灵芝中多糖的含量较高。灵芝品质好。
与现有技术相比，本发明对灵芝的具体提取工艺进行了改进，使得灵芝的有效成分多糖容易测出，且测出的多糖含量高，使得灵芝的药效好。
实施例1。
一种灵芝的提取方法，具体包括以下步骤：
（1）取干燥的灵芝子实体，切碎，于-25℃-20℃下冷冻11h，得a品；
（2）a品常温下解冻后，用11倍量的浓度为75%的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1.5小时，滤过，滤渣备用，提取液减压回收乙醇，得浓缩液，即b品；
（3）b品加水至体积每毫升与药材量每克之比为1：1.5，上大孔吸附树脂，加水洗脱7倍柱体积，再用浓度为50%乙醇洗脱7倍柱体积，收集洗脱液，回收乙醇，得醇提取液，即c品；
（4）滤渣中加入20倍量的浓度为0.8%的氢氧化钾水溶液，文火加热至50-60℃后，保温25min，加入活性炭，静置4h后，过滤，收集滤液，得d品；所述活性炭的加入量为滤渣重量的0.5倍；
（5）d品与c品合并，浓缩至50-60℃下相对密度为1.1-1.2的浸膏，即得。
实施例2.
（1）取干燥的灵芝子实体，切碎，于-25℃-20℃下冷冻12h，得a品；
（2）a品常温下解冻后，用12倍量的浓度为80%的乙醇溶液加热回流提取3次，每次2小时，滤过，滤渣备用，提取液减压回收乙醇，得浓缩液，即b品；
（3）b品加水至体积每毫升与药材量每克之比为3：1，上大孔吸附树脂，加水洗脱10倍柱体积，再用浓度为70%乙醇洗脱10倍柱体积，收集洗脱液，回收乙醇，得醇提取液，即c品；
（4）滤渣中加入25倍量的浓度为1%的氢氧化钾水溶液，文火加热至50-60℃后，保温30min，加入活性炭，静置5h后，过滤，收集滤液，得d品；所述活性炭的加入量为滤渣重量的0.6倍；
（5）d品与c品合并，浓缩至50-60℃下相对密度为1.1-1.2的浸膏，即得。
实施例3.
（1）取干燥的灵芝子实体，切碎，于-25℃-20℃下冷冻10h，得a品；
（2）a品常温下解冻后，用10倍量的浓度为70%的乙醇溶液加热回流提取2次，每次1小时，滤过，滤渣备用，提取液减压回收乙醇，得浓缩液，即b品；
（3）b品加水至体积每毫升与药材量每克之比为1：3，上大孔吸附树脂，加水洗脱4倍柱体积，再用浓度为30%乙醇洗脱4倍柱体积，收集洗脱液，回收乙醇，得醇提取液，即c品；
（4）滤渣中加入15倍量的浓度为0.5%的氢氧化钾水溶液，文火加热至50-60℃后，保温20min，加入活性炭，静置3h后，过滤，收集滤液，得d品；所述活性炭的加入量为滤渣重量的0.4倍；
（5）d品与c品合并，浓缩至50-60℃下相对密度为1.1-1.2的浸膏，即得。