本发明涉及中药
技术领域：
，特别涉及一种促生长及强免疫的禽用中药生物制剂及其制备方法。
背景技术：
：随着养鸡业规模化、集约化的迅速发展，各种疾病也常有发生，兽药的使用也日益频繁。抗生素作为饲料添加剂被广泛的应用于动物生产，但同时也带来很多问题，例如耐药性的产生，畜禽产品中的抗生素残留，引起畜禽体内正常菌群失调等负面效应。雏鸡一般为7周龄以下的鸡，具有体温调节机制不健全、消化系统发育不健全，抵抗力弱，敏感性强等的生理特点。抵抗能力弱使雏鸡容易外邪入侵机体，从而导致发病。常见的一些细菌病如大肠杆菌病、鸡白痢等，严重影响雏鸡的生长发育，给养禽业带来很大的经济损失。为了适应消费者的需求，中药养鸡技术应运而生。中药不仅有预防治疗疾病、提高免疫及促生长发育等作用，而且相对于西药毒副作用小、不易产生耐药性、无残留、成本低。相关研究显示，合理开发利用中草药资源，用中药逐步取代常规的抗生素、促生长素和化学药物添加剂，对降低兽药残留，发展绿色养鸡业具有的生素、促生长素和化学药物添加剂，对降低兽药残留，发展绿色养鸡业具有的广阔的前景。中草药、酶制剂与益生素在动物生产方面的应用被人们预言为取代抗生素的必然之路。如果利用一些有益的微生物通过发酵中草药而制得集“中草药、酶制剂、益生素”与一体的产品将会更有力地推动畜牧业的发展。中药发酵历史悠久，早在四千多年以前，我国人民即已学会利用发酵技术来酿酒，其后又相继用来生产酱、醋、豆豉等食品。20世纪80年代现代生物技术开始被运用到发酵中，从现代科学角度探索发酵炮制的工艺及其机制，是一种典型的生物转化过程。现代中药发酵技术，又称中药生物转化技术，是在继承传统中药发酵炮制方法的基础上，结合现代微生态学、生物工程学、发酵工程技术等学科，形成的中药现代化制药新技术。植物中草药的细胞有细胞壁，细胞壁的主要组成成份有纤维、蛋白质等，常规的一些提取方法难以将其破坏，细胞里面的活性成分难以溶出，从而使中草药的有效成分提取不充分，提取率低。微生物发酵能产生各种酶类物质，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶等，可以破坏植物细胞壁，从而使细胞内活性成分大量析出，提高中草药有效成分提取率。技术实现要素：为解决以上技术问题，本发明提供的促生长及强免疫的禽用中药生物制剂及其制备方法，以解决利用微生物发酵提高中草药有效成分提取率，促进畜禽生长发育，增强免疫力，实现传统中药方剂与现代生物技术的有机结合的问题。本发明采用的技术方案如下：一种促生长及强免疫的禽用中药生物制剂，关键在于中药组合物经过微生物发酵制备而成；所述中药组合物由以下质量份数的原料组成：蒲公英2～6份，金银花2～5份，连翘2～5份，陈皮1～5份，厚皮1～5份，甘草1～5份。优选的，所述原料的质量份数为：蒲公英4份，金银花3份，连翘3份，陈皮2份，厚朴2份，甘草3份。优选的，所述微生物为枯草芽孢杆菌。一种促生长及强免疫的禽用中药生物制剂的制备方法，关键在于按以下步骤进行：步骤一、制备中药培养基：将蒲公英、金银花、连翘、陈皮、厚皮和甘草分别经过筛选、清洗、干燥后混合，得到中药混合物，将中药混合物粉碎成药材细粉，将所述药材细粉中加入蒸馏水，得到所述中药培养基；步骤二、活化微生物：将微生物置于液体培养基中接种培养，然后经过两次传代，得到所述活化微生物；步骤三、制备种子液：将步骤二中得到的活化微生物接种于液体培养基中，经过震荡培养得到所述种子液；步骤四、制备中药生物制剂：调整步骤一中得到的所述中药培养基的ph值，经过高温灭菌后冷却至室温，然后接入所述种子液，接着放入摇床振荡培养箱中经过震荡培养后得到所述中药生物制剂。优选的，所述步骤二具体为：将微生物的菌种接种到营养肉汤液体培养基中，在30-40℃的温度下培养12-30h后，传代两次；经过两次传代后的菌液用钩菌环将其接种于营养琼脂固体培养基，在30-40℃的温度下培养12-30h，然后挑取单个菌落于营养肉汤液体培养基中，在30-40℃的温度下培养12-30h，得到活化微生物种。优选的，所述步骤三具体为：将步骤二中得到的活化微生物按照0.5％-5％的量接种于营养肉汤液体培养基中后，放置在摇床振荡培养箱中，在培养温度为30-40℃，培养转速为100-200r/min，培养时间为12-30h，得到种子液。优选的，所述步骤四中的ph值为4.0-7.0。优选的，所述步骤四中的高温灭菌条件为：温度为105℃，灭菌时间为20min。优选的，所述步骤四中种子液的接入量为中药培养基重量的0.5％-8％。优选的，所述步骤四中的震荡培养工艺条件为：温度为25℃-45℃，转速为120r/min-240r/min，培养时间为12h-84h。有益效果：与现有技术相比，本发明提供的促生长及强免疫的禽用中药生物制剂及其制备方法，本发明的原料含有蒲公英、金银花、连翘、陈皮、厚朴和甘草，通过微生物发酵后使药物有效成分的提取率升高，更容易吸收，药效更充分；本发明为纯中药制剂，原料来源广泛，成本低廉，并且无毒副作用，长期使用不会产生抗药性；传统中药剂适口性差、内服后有效成分不易从植物细胞中游离出来被机体充分吸收，生物利用度低，而煎剂在制备过程中对中药有效成分破坏性大，降低了药物应有的疗效；本发明采用的微生物发酵法，反应条件温和，可以最大限度的保护中药有效成分免遭破坏，同时，可使某些有效成分含量增加及产生新的药物成分，从而提高药物疗效、扩大适应症、减少服用剂量。具体实施方式为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附表和具体实施方式对本发明作详细说明。实施例1一种禽用中药生物制剂(1)禽用中药生物制剂原料的挑选：蒲公英，别名黄花地丁、婆婆丁、华花郎等，菊科多年生草本植物。味苦、甘，寒。归肝、胃经。功效：清热解毒，消肿散结，利尿通淋。应用：疮毒，乳痈，肺痈，目赤，咽痛，湿热黄疸，热淋。金银花，别名忍冬，忍冬科忍冬属植物。味甘，寒。归肺、心、胃经。功效：清热解毒，疏散风热。应用：温热发病，风热感冒，肺热咳嗽，咽喉肿痛，热毒血痢，乳房肿痛，痈肿疮毒。连翘，落叶灌木，香港俗称一串金，是木犀科连翘属植物。味苦，微寒。归肺、心、小肠经。功效：清热解毒，消肿散结。应用：温病发热，疮黄肿毒。陈皮，别名橘皮，为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮。味苦、辛，温。归肺、脾经。功效：理气健脾，燥湿化痰。应用：食欲减少，腹痛，肚胀，泄泻，痰湿咳嗽。厚朴，别名紫朴、紫油朴、温朴等，为木兰科、木兰属植物。味苦、辛，温。归脾、胃、肺、大肠经。功效：下气消胀，燥湿消痰。应用：宿食不消，食积气滞，肚胀便秘，痰饮咳喘。甘草，别名国老、甜草、乌拉尔甘草、甜根子，豆科、甘草属多年生草本。味甘，平。归心、肺、脾、胃经。功效：补脾益气，祛痰止咳，和中缓急，解毒，调和诸药，缓解药物毒性、烈性。应用：脾胃虚弱，倦怠无力，咳喘，咽喉肿痛，中毒，疮疡。(2)禽用中药生物制剂的配制比例：将禽用中药生物制剂中各原料分别按表1所述质量份数进行混合，得到不同混合比例的禽用中药生物制剂i～iii。表1不同混合比例(质量份数)的禽用中药生物制剂实施例2：禽用中药生物制剂的制备方法步骤一、制备中药培养基：将蒲公英2份、金银花2份、连翘2份、陈皮1份、厚皮1份和甘草1份分别经过筛选、清洗、干燥后混合，得到中药混合物，将该中药混合物粉碎成30目的药材细粉，向药材细粉中加入相当于该药材细粉10倍重量的蒸馏水，得到所述中药培养基；步骤二、活化微生物：将微生物的菌种接种到营养肉汤液体培养基中，在30-40℃的温度下培养12h后，传代两次；经过两次传代后的菌液用钩菌环将其接种于营养琼脂固体培养基，在30℃的温度下培养12h，然后挑取单个菌落于营养肉汤液体培养基中，在30℃的温度下培养12h，得到活化微生物种。步骤三、制备种子液：将活化微生物接种于营养肉汤液体培养基中，活化微生物接入量相当于营养肉汤液体培养基重量0.5％，然后放置在摇床振荡培养箱中，在培养温度为30℃，培养转速为100r/min，培养时间为12h，得到种子液；步骤四、制备中药生物制剂：将步骤一中得到的所述中药培养基的ph值调整到4.0，经过105℃高温灭菌20min后，冷却至室温，然后接入中药培养基重量的0.5％的种子液，接着放入摇床振荡培养箱中，，在培养温度为25℃，培养转速为120r/min，培养时间为12h，得到所述中药生物制剂i。实施例3：禽用中药生物制剂的制备方法步骤一、制备中药培养基：将蒲公英6份、金银花5份、连翘5份、陈皮5份、厚皮5份和甘草5份分别经过筛选、清洗、干燥后混合，得到中药混合物，将该中药混合物粉碎成80目的药材细粉，向药材细粉中加入相当于该药材细粉5倍重量的蒸馏水，得到所述中药培养基；步骤二、活化微生物：将微生物的菌种接种到营养肉汤液体培养基中，在40℃的温度下培养30h后，传代两次；经过两次传代后的菌液用钩菌环将其接种于营养琼脂固体培养基，在40℃的温度下培养30h，然后挑取单个菌落于营养肉汤液体培养基中，在40℃的温度下培养30h，得到活化微生物种；步骤三、制备种子液：将活化微生物接种于营养肉汤液体培养基中，活化微生物接入量相当于营养肉汤液体培养基重量5％，然后放置在摇床振荡培养箱中，在培养温度为40℃，培养转速为200r/min，培养时间为30h，得到种子液；步骤四、制备中药生物制剂：将步骤一中得到的所述中药培养基的ph值调整到7.0，经过105℃高温灭菌20min后，冷却至室温，然后接入中药培养基重量的8％的种子液，接着放入摇床振荡培养箱中，，在培养温度为45℃，培养转速为240r/min，培养时间为84h，得到所述中药生物制剂ii。实施例4：禽用中药生物制剂的制备方法步骤一、制备中药培养基：将蒲公英4份、金银花3份、连翘3份、陈皮2份、厚皮2份和甘草3份分别经过筛选、清洗、干燥后混合，得到中药混合物，将该中药混合物粉碎成40目的药材细粉，向药材细粉中加入相当于该药材细粉10倍重量的蒸馏水，得到所述中药培养基；步骤二、活化微生物：将微生物的菌种接种到营养肉汤液体培养基中，在37℃的温度下培养24h后，传代两次；经过两次传代后的菌液用钩菌环将其接种于营养琼脂固体培养基，在37℃的温度下培养24h，然后挑取单个菌落于营养肉汤液体培养基中，在37℃的温度下培养24h，得到活化微生物种；步骤三、制备种子液：将活化微生物接种于营养肉汤液体培养基中，活化微生物接入量相当于营养肉汤液体培养基重量1％，然后放置在摇床振荡培养箱中，在培养温度为37℃，培养转速为180r/min，培养时间为24h，得到种子液；步骤四、制备中药生物制剂：将步骤一中得到的所述中药培养基的ph值调整到5.0，经过105℃高温灭菌20min后，冷却至室温，然后接入中药培养基重量的2％的种子液，接着放入摇床振荡培养箱中，在培养温度为35℃，培养转速为210r/min，培养时间为24h，得到所述中药生物制剂iii。实施例5：禽用中药生物制剂的制备方法步骤一、制备中药培养基：将蒲公英4份、金银花3份、连翘3份、陈皮2份、厚皮2份和甘草3份分别经过筛选、清洗、干燥后混合，得到中药混合物，将该中药混合物粉碎成40目的药材细粉，向药材细粉中加入相当于该药材细粉10倍重量的蒸馏水，得到所述中药培养基；步骤二、活化微生物：将微生物的菌种接种到营养肉汤液体培养基中，在37℃的温度下培养24h后，传代两次；经过两次传代后的菌液用钩菌环将其接种于营养琼脂固体培养基，在37℃的温度下培养24h，然后挑取单个菌落于营养肉汤液体培养基中，在37℃的温度下培养24h，得到活化微生物种；步骤三、制备种子液：将活化微生物接种于营养肉汤液体培养基中，活化微生物接入量相当于营养肉汤液体培养基重量1％，然后放置在摇床振荡培养箱中，在培养温度为37℃，培养转速为180r/min，培养时间为24h，得到种子液；步骤四、制备中药生物制剂：将步骤一中得到的所述中药培养基的ph值调整到7.0，经过105℃高温灭菌20min后，冷却至室温，然后接入中药培养基重量的2％的种子液，接着放入摇床振荡培养箱中，在培养温度为37℃，培养转速为150r/min，培养时间为48h，得到所述中药生物制剂iv。二、分别对本发明制备的禽用中药生物制剂i～iv进行药效测定，以禽用中药生物制剂iii为例：(1)总黄酮含量测定a.对照品溶液的制备取芦丁对照品9.7mg，精密称量，置于50ml量瓶中，加适量的甲醇溶解，再加蒸馏水至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1ml含芦丁0.194mg)。b.标准曲线的绘制精密量取对照品溶液0.0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3ml，分别置10ml容量瓶中，各加蒸馏水至3ml，加5％亚硝酸钠溶液0.4ml，混匀，放置6min；再加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液4.0ml，再加蒸馏水至刻度，摇匀，放置15min，以0.0为空白。用紫外分光光度计510nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，计算得回归方程。c.平行测试3个样品，取其算术平均值。(2)总多糖含量测定a.葡萄糖标准溶液和苯酚溶液的配制取105℃烘干至恒重的葡萄糖标准品精密称取10.0mg于100ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配制成浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。称取苯酚40g，加锌粉0.5g和nahc0320mg蒸馏(空气冷凝)，收集182℃的馏分。称取5.0g馏分于100ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，配制成5％的苯酚溶液。b.葡萄糖标准曲线的绘制分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6ml葡萄糖标准溶液于试管中，加水至1.6ml，然后加入6％苯酚1.0ml和浓硫酸5.0ml，摇匀，以2ml蒸馏水做参比，室温放置25min后在490nm测定吸光度值，绘制葡萄糖标准曲线，并求出回归方程。c.平行测试3个样品，取其算术平均值。表2中药生物制剂的药效测定结果组别总黄酮mg/g总多糖mg/g中药生物制剂iii83.1526.11中药生物制剂iv69.03-未发酵中药-20.76从上表中可以看到，中药生物制剂iii中总黄酮的含量比中药生物制剂iv中总黄酮的含量提高了20.46％，采用实施例4的发酵条件得到的中药生物制剂iii比采用实施例5的发酵条件得到的中药生物制剂iv，有效成分总黄酮的提取更加充分；采用苯酚-硫酸法测定中药生物制剂iii的多糖含量比未发酵处理中药的多糖含量提高25.77％，发酵处理使中药组合物的多糖含量显著提高，也使其有效成分总黄酮的提取更加充分。(3)临床疗效研究a.研究对象：取1日龄健康红羽肉鸡180只，随机分为6组，分别为空白对照组(空白组)、菌液对照组(菌液组)、中药生物制剂试验组(即未经灭菌处理的)ⅰ、ⅱ、ⅲ组和中药生物制剂灭菌试验组(ⅳ组)，每组设3个重复，每个重复10只。采用笼养，料槽、饮水器充足，自由采食、饮水，24h光照，整个试验时长46天，分为2个阶段(0～21日龄、21～46日龄)。8日龄时接种新-流二联苗，21日龄时接种传染性法氏囊活疫苗，采用点眼滴鼻的方式接种。各组处理为：空白组采用词料中添加0.5％的蒸馏水进行喂养、菌液组采用词料中添加0.5％的菌液进行喂养，发酵中药灭菌组采用词料中添加0.5％的灭菌处理的中药生物制剂iii进行喂养，中药生物制剂试验组ⅰ、ⅱ、ⅲ分别采用词料中添加i0.25％、0.5％、1.0％的中药生物制剂ii进行喂养。b.生长性能指标测定：每天记录饲喂饲料量，剩余饲料量，洒落饲料量，并计算出每天的实际采食量。分别在1日龄、21日龄、46日龄早晨空腹进行称重。计算各阶段平均日采食量、平均日增重、料重比。实际采食量＝饲喂饲料量－剩余饲料量－洒落饲料量平均日采食量＝总实际采食量/试验天数平均日增重＝(阶段末重－阶段始重)/阶段天数料重比＝阶段实际总采食量/阶段总增重表3中药生物制剂对肉鸡生长性能指标影响注：不同的小写字母表示差异显著(0.01＜p＜0.05)，不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)从上表结果显示，在0～21日龄阶段各试验组的肉鸡总采食量、平均日采食量、平均日增重与空白组比较，差异极显著(p＜0.01)，试验组的料重比均低于空白组，差异极显著(p＜0.01)；试验ⅱ组的肉雏鸡的平均日增重和料重与其它试验组比较差异极显著(p＜0.01)，其平均日增重与空白组比较增加27.3％，料重比与空白组比较降低12.1％。试验ⅱ组、ⅲ组的总采食量、平均日采食量与菌液组比较，差异极显著(p＜0.01)。试验ⅱ组的平均日增重、料重比与菌液组比较，差异极显著(p＜0.01)。在21～46日龄阶段，试验各组除ⅰ组外，其它试验组肉鸡的总采食量和平均日采食量与空白组比较，差异极显著(p＜0.01)。各试验组肉鸡的平均日增重与空白组比较，差异极显著(p＜0.01)；试验ⅰ组肉鸡的平均日增重与空白组比较增加8.7％，试验ⅱ组增加7.0％，试验ⅲ组增加5.7％，试验ⅳ组增加19.8％。各试验组的料重比与空白组比较，差异显著(0.01＜p＜0.05)，其中试验ⅱ组的料重比最小，比空白组降低18.2％。试验ⅰ、ⅱ、ⅲ组的总采食量、平均日采食量、平均日增重与菌液组比较，差异极显著(p＜0.01)。试验ⅰ、ⅱ、ⅲ组的总采食量、平均日采食量、平均日增重均低于菌液组。试验ⅱ、ⅲ组的料重比与菌液组比较，差异显著(0.01＜p＜0.05)，且都低于菌液组。c.免疫脏器指数：将46日龄鸡采血后致死，取脾脏、法氏囊称重，计算免疫脏器指数。免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/宰前空腹活重(100g)表4中药生物制剂对肉鸡免疫脏器指数的影响组别脾脏指数法氏囊指数ⅰ组0.157±0.032ab0.145±0.036ⅱ组0.162±0.024a0.125±0.018ⅲ组0.115±0.026b0.136±0.019ⅳ组0.166±0.031a0.157±0.058菌液组0.127±0.028ab0.167±0.085空白组0.117±0.051b0.129±0.018注：不同的小写字母表示差异显著(0.01＜p＜0.05)从上表结果显示，试验ⅱ组和ⅳ组肉鸡的脾脏指数与空白组比较，差异显著(0.01＜p＜0.05)，与菌液组比较，差异不显著(p＞0.05)；但除ⅲ组外，其它试验组肉鸡的脾脏指数都高于空白组。试验ⅰ、ⅱ、ⅳ组的脾脏指数均高于菌液组。各试验组肉鸡的法氏囊指数与空白组和菌液组比较，差异都不显著(p＞0.05)，其中除试验ⅱ组外，其它试验组肉鸡的法氏囊指数都高于空白组，各试验组的法氏囊指数都低于菌液组。综合上述结果可以得到中药生物制剂iii对肉鸡的免疫器官发育都有一定的促进作用。最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。当前第1页12