一种珍珠粉荧光纳米颗粒及其制备方法与流程

本发明涉及一种药品制备方法，具体涉及一种珍珠粉荧光纳米颗粒及其制备方法。

背景技术：

越来越多的女性内服、外用珍珠，以达到美容养颜的功效。珍珠入药内服，必须经过炮制加工，将其研磨为如面粉一样的极细粉末，否则可能对脏腑特别是脾胃产生损害。将珍珠研磨成细粉，可促进胃肠吸收，提高治疗效果。外用也是如此。

珍珠粉颗粒越细越容易被人体吸收。纳米珍珠粉是平均粒度小于100纳米的珍珠粉，其粒径为毛孔的万分之一，是毛细血管的末端的四分之一到八分之一。由于纳米珍珠粉粒径小、比表面积极大，所以其营养成分更容易被吸收。但是，由于珍珠具有坚硬的同心叠层结构，加工成纳米级珍珠粉难度相当大。

纳米珍珠粉常用的制备方法包括化学制备方法和物理制备方法。传统的物理制备方法容易使珍珠营养成分受到破坏，造成蛋白质的损失，且粒径大，内服或外用吸收率均较低，药效及美容效果受到很大的影响。

酶解法是一种化学方法，就是用酶类使该种酶的作用对象分解。酶是专一高效的催化剂，例如纤维素酶可以催化纤维素分解，蛋白酶可以催化蛋白质分解。近几年，夏潇潇等人采用食品工业用酶处理方法，研究了蛋白酶种类、酶解时间、加酶量与珍珠粉粒径分布范围的关系(碱性蛋白酶制备纳米珍珠粉工艺优化[j].工业微生物，2013，23(1))，酶解后约有60％珍珠粉粒径分布小于1μm。在该技术方案中，虽然珍珠粉粒径已满足国家标准的要求，但粒径依然较大。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种珍珠粉荧光纳米颗粒及其制备方法，采用模拟人体胃肠道消化酶处理珍珠粉，通过胃液消化和肠液消化把大的珍珠粉颗粒消化成纳米级的颗粒，获得更利于人体吸收的珍珠粉。

本发明采用的技术方案是：

一种珍珠粉荧光纳米颗粒的制备方法，包括以下三个步骤：

第一步珍珠粉的炮制：

取珍珠，洗净，称取，加入纯牛奶，加水稀释，于电磁炉上煮制后，干燥，在锅里炒至黄色；

第二步制备珍珠粉纳米颗粒：

制备出模拟胃液和/或肠液，利用模拟珍珠粉在胃中和/或肠道中的消化吸收过程，将珍珠粉颗粒逐步在模拟胃液中和/或模拟肠液中消化成纳米级的小颗粒。

在上述技术方案的基础上，还可采用如下技术特征进行进一步限定。

优选地，所述制备方法还包括第三步：利用微波法和超声法激发增强所述第二步中获得荧光纳米颗粒的荧光，从而获得荧光强度更强的珍珠粉荧光纳米颗粒。

优选地，在珍珠粉炮制步骤中，在煮制过程中保持微沸，不断搅拌，并不断添加清水保持锅内液体体积基本不变。

优选地，纯牛奶的重量是珍珠粉重量的3至5倍。

优选地，模拟胃液的配制比例为0.23±0.05gnacl，0.34±0.05g胃蛋白酶，0.73±0.05ml浓盐酸，定容于100±10ml双蒸馏水，ph约为1.2±0.1。

优选地，模拟肠液的制备方法为将0.68±0.05gkh2po4(磷酸二氢钾)溶于25±2ml双蒸水，振荡，完全溶解后加19±1ml、0.23mol/lnaoh和40±5ml的双蒸水，加胰蛋白酶1.0±0.1g，混匀，用0.2mol/lnaoh调ph到7.5±0.1，定容于100ml±10ml双蒸水。

优选地，所述第二步具体还包括如下步骤：

首先，将珍珠粉投入到在预先加入模拟人胃液的圆底烧瓶中，置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h；反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋在超纯水中透析2～3天，直到ph值接近中性；透析处理后的黄色液体再逐级离心分离提纯，最后以16000转/秒离心30min后提取上清液，4℃保存；

其次，将胃液消化离心沉淀的珍珠粉回收，并倒入适量超纯水轻轻混匀然后16000转/秒离心10min；

然后，以上方法重复两次，两次提取的黄色上清液混合后经旋转蒸发浓缩至25ml左右；接着把浓缩的液体放入微波炉以50hz微波5min后放入冷冻干燥机干燥，加入适量超纯水干燥碳颗粒超声1min后回收，在荧光检测仪下检测发荧光等情况后4℃保存。

优选地，所述第二步具体还包括如下步骤：

首先，将珍珠粉投入到在预先加入模拟人胃液的圆底烧瓶中，置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h；反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋在超纯水中透析2～3天，直到ph值接近中性；透析处理后的黄色液体再逐级离心分离提纯，最后以16000转/秒离心30min后提取上清液，4℃保存；

其次，将胃液消化离心沉淀的珍珠粉回收，并倒入适量超纯水轻轻混匀然后16000转/秒离心10min；以上方法重复两次，最后把沉淀物溶于肠液置于油浴锅中37℃、磁力搅拌回流12h；反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋在超纯水中透析2～3天，直到ph值接近中性；最后以16000转/秒离心30min后提取上清液4℃保存；

然后，两次提取的黄色上清液混合后经旋转蒸发浓缩至25ml左右；接着把浓缩的液体放入微波炉以50hz微波5min后放入冷冻干燥机干燥，加入适量超纯水干燥碳颗粒超声1min后回收，在荧光检测仪下检测发荧光等情况后4℃保存

本发明的有益效果：

采用该方法所获得的珍珠粉颗粒达到10纳米以下，更利于人体吸收；具有荧光性质，可作为跟踪检测时的靶向；表面富含官能性有机基团，使得其不仅具有良好的分散性和水溶性，而且易于功能化修饰和生物偶联标记，同时还具有很好的生物相容性。

附图说明

图1示出了本发明所述一种纳米珍珠粉荧光颗粒制备方法的步骤图。

图2示出采用本发明所获得的纳米珍珠粉荧光颗粒的原子力显微镜图像。

图3示出了采用本发明所获得的纳米珍珠粉荧光颗粒的荧光光谱测试图。

具体实施方式

本发明的技术方案的原理与珍珠粉在人体中的消化和吸收具有密切的相关性。

本发明中的纳米珍珠粉荧光颗粒的制备方法是模拟珍珠粉在人体胃肠道里的药理作用，通过胃液消化和肠液消化把大的珍珠粉颗粒消化成纳米级的珍珠颗粒，然后被肠道吸收进入血液发挥药理作用。

如图1所示，一种荧光纳米珍珠粉制备方法，包括珍珠粉的炮制、制备珍珠粉纳米颗粒以及制备荧光颗粒三个步骤。下面阐述本发明的三个具体实施方案。

具体实施方案1

第一步珍珠粉的炮制

取珍珠，洗净，称取100g，加入300g-500g的纯牛奶，加水调整至900-1000ml，于电磁炉上煮制3-5小时后，干燥，在锅里炒至黄色。煮制过程中保持微沸，不断搅拌，并不断添加清水保持锅内液体体积基本不变。

第二步制备荧光纳米颗粒

(1)模拟人胃、肠液的配制

a、胃液的配制：0.18gnacl，0.29g胃蛋白酶，0.68ml浓盐酸，定容于90ml双蒸馏水，ph值约为1.2±0.1；

b、模拟肠液的配制：将0.58gkh2po4溶于18ml双蒸水，振荡，完全溶解后加18ml、0.23mol/lnaoh和35ml的双蒸水，加胰蛋白酶0.9g，混匀，用0.2mol/lnaoh调ph到7.5±0.1，定容于90ml双蒸水。胰蛋白酶购自于sigma公司。胰蛋白酶的活力为10010u/mgprot。胃蛋白酶购自于sigma公司，胃蛋白酶的活力为2330u/mgprot。

(2)珍珠粉荧光纳米颗粒的制备

首先，将1g珍珠粉投入到在预先加入模拟人胃液的圆底烧瓶中，置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋(型号为mwco1000)在超纯水中透析2～3天(期间不断换水)，直到ph值接近中性。透析处理后的黄色液体再逐级离心分离提纯，最后以16000转/秒离心30min后提取上清液，4℃保存。其次，将胃液消化离心沉淀的珍珠粉回收，并倒入适量超纯水轻轻混匀然后16000转/秒离心10min。以上方法重复两次，最后把沉淀物溶于肠液置于油浴锅中37℃、磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋(mwco1000)在超纯水中透析2～3天(期间不断换水)，直到ph值接近中性。最后以16000转/秒离心30min后提取上清液4℃保存。然后，两次提取的黄色上清液混合后经旋转蒸发浓缩至25ml左右。接着把浓缩的液体放入微波炉以50hz微波5min后放入冷冻干燥机干燥，然后加入适量超纯水干燥碳颗粒超声1min后回收，在荧光检测仪下检测发荧光等情况后4℃保存。

第三步利用微波法或超声法激发荧光增强上述制得的荧光纳米颗粒的荧光强度。

具体实施例2

第一步珍珠粉的炮制实验

取珍珠，洗净，称取100g，加入300g-500g的纯牛奶，加水调整至1000ml，于电磁炉上煮制3-5小时后，干燥，在锅里炒至黄色。煮制过程中保持微沸，不断搅拌，并不断添加清水保持锅内液体体积基本不变。

第二步制备荧光纳米颗粒

(1)模拟人胃、肠液的配制

a、胃液的配制：0.23gnacl，0.34g胃蛋白酶，0.73ml浓盐酸，定容于100ml双蒸馏水，ph值约为1.2±0.1；

b、模拟肠液的配制：将0.63gkh2po4溶于20ml双蒸水，振荡，完全溶解后加19ml、0.23mol/lnaoh和40ml的双蒸水，加胰蛋白酶1.0g，混匀，用0.2mol/lnaoh调ph到7.5±0.1，定容于100ml双蒸水。胰蛋白酶购自于sigma公司。胰蛋白酶的活力为10010u/mgprot。胃蛋白酶购自于sigma公司，胃蛋白酶的活力为2330u/mgprot。

(2)珍珠粉荧光纳米颗粒的制备

首先，将1g珍珠粉投入到在预先加入模拟人胃液的圆底烧瓶中，置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋(mwco1000)在超纯水中透析2～3天(期间不断换水)，直到ph值接近中性。透析处理后的黄色液体再逐级离心分离提纯，最后以16000转/秒离心30min后提取上清液，4℃保存。其次，将胃液消化离心沉淀的珍珠粉回收，并倒入适量超纯水轻轻混匀然后16000转/秒离心10min。以上方法重复两次，最后把沉淀物溶于肠液置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋(mwco1000)在超纯水中透析2～3天(期间不断换水)，直到ph值接近中性。最后以16000转/秒离心30min后提取上清液4℃保存。然后，两次提取的黄色上清液混合后经旋转蒸发浓缩至25ml左右。接着把浓缩的液体放入微波炉以50hz微波5min后放入冷冻干燥机干燥，然后加入适量超纯水干燥碳颗粒超声1min后回收，在荧光检测仪下检测发荧光等情况后4℃保存。

具体实施例3

第一步珍珠粉的炮制

取珍珠，洗净，称取100g，加入400g的纯牛奶，加水调整至950ml，于电磁炉上按3-5个小时煮制后，干燥，在锅里炒至黄色。煮制过程中保持微沸，不断搅拌，并不断添加清水保持锅内液体体积基本不变。

第二步制备纳米颗粒

(1)模拟人胃、肠液的配制

a、胃液的配制：0.28gnacl，0.39g胃蛋白酶，0.78ml浓盐酸，定容于110ml双蒸馏水，ph约为1.2±0.1；

b、模拟肠液的配制：将0.72kh2po4溶于22ml双蒸水，振荡，完全溶解后加20ml、0.23mol/lnaoh和45ml的双蒸水，加胰蛋白酶1.1g，混匀，用0.2mol/lnaoh调ph到7.5±0.1，定容于110ml双蒸水。胰蛋白酶购自于sigma公司。胰蛋白酶的活力为10010u/mgprot。胃蛋白酶购自于sigma公司，胃蛋白酶的活力为2330u/mgprot。

(2)珍珠粉荧光纳米颗粒的制备首先，将1g珍珠粉投入到在预先加入模拟人胃液的圆底烧瓶中，置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋(mwco1000)在超纯水中透析2～3天(期间不断换水)，直到ph值接近中性。透析处理后的黄色液体再逐级离心分离提纯，最后以16000转/秒离心30min后提取上清液，4℃保存。其次，将胃液消化离心沉淀的珍珠粉回收，并倒入适量超纯水轻轻混匀然后16000转/秒离心10min。以上方法重复两次，最后把沉淀物溶于肠液置于37℃油浴锅中，磁力搅拌回流12h。反应完后，离心分离除去未反应物，取上面黄色上清液，转入到透析袋(mwco1000)在超纯水中透析2～3天(期间不断换水)，直到ph值接近中性。最后以16000转/秒离心30min后提取上清液4℃保存。然后，两次提取的黄色上清液混合后经旋转蒸发浓缩至25ml左右。接着把浓缩的液体放入微波炉以50hz微波5min后放入冷冻干燥机干燥，然后加入适量超纯水干燥碳颗粒超声1min后回收，在荧光检测仪下检测发荧光等情况后4℃保存。

对经上述方法制备的荧光纳米珍珠粉进行动态光散射测量，具体说明如下：

1.珍珠粉荧光颗粒形貌表征

利用原子力显微镜(atomicforcemicroscopy，afm)技术可以直接获得样品的三维图像，根据图2图像分析可以直接得到颗粒的三维尺寸，均在5nm以下。

2.荧光光谱性质的表征

荧光光谱性质用f-45000荧光光谱仪进行表征。如图3所示，激发波长从300到380nm时荧光强度逐渐增加，说明样品碳颗粒本身发出荧光。

综上所述，经本发明获得珍珠粉纳米颗粒尺寸低于10nm，更利于吸收，同时具有荧光特性，可作为跟踪检测时的靶向。

上述是对本发明的具体说明，并非用于限定本发明。本发明的保护范围由其权利要求所限定。