人sDR5-Fc重组融合蛋白作为胰腺炎治疗药物的应用的制作方法

本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及一种人sdr5-fc重组融合蛋白及其作为制备治疗胰腺炎的药物中的应用。

背景技术

胰腺炎是胰腺的一种炎症性疾病，有多种致病因素且在临床上的症状呈多样性。分泌于胰腺腺泡细胞、具有消化食物功能的胰腺原酶(尤其是胰蛋白酶)在某些病理情况下会在胰腺中被异常激活，而这些原酶在正常情况下是在小肠被激活。在胰腺中被激活的这些原酶能够引起胰腺自身消化，从而诱发急性胰腺炎。急性胰腺炎对机体生理功能扰乱大，对各重要脏器损害明显，故死亡率甚高，且目前还尚无特异性治疗措施，临床上目前也没有专门有效治疗急性胰腺炎的的药物。急性胰腺炎是临床常见病，发病率高。由于急性胰腺炎发病急，病情发展快而复杂，可从最初的胰腺组织的局部病变迅速发展成为全身炎症反应综合征(systematicinflammatoryresponsesyndrome,sirs)、脓毒症、脓毒症休克乃至多器官功能衰竭，甚至死亡，治疗非常棘手，虽然临床采用综合疗法进行治疗，但效果并不满意，总体死亡率仍然高达5％～13.6％，因此研究新的有效药物具有重要意义。

胰腺炎的常见病因有：胆道疾病、大量饮酒、暴饮暴食。胰腺炎的发病机制复杂，以往研究多集中在炎症因子、氧化应激、微循环障碍等方面。近年人们发现细胞凋亡在急性胰腺炎的发生发展过程中起重要作用，它参与了急性胰腺炎的组织损伤。

胰腺炎的基本治疗原则是：1)抑制减少胰液分泌。禁食，胃肠减压。使用抑胰酶制剂。2)抗休克、纠正水、电解质平衡。补充血容量，补充电解质、钙。3)抑酸、抗胆碱能药物应用。抑酸：间接抑制胰液分泌。抗胆碱能药：解痉止痛。镇痛药反复使用有成瘾性风险。4)抗生素应用：对重症胰腺炎，静脉使用广谱抗生素。

生长抑素：抑制胃酸、胃蛋白酶、胃泌素分泌影响胃肠道吸收及动力，减少内脏血流量，减少胰腺内、外分泌功能。不良反应有恶心、眩晕、面色潮红，注射速度过快时出现恶心、呕吐，短暂血糖下降。

加贝酯：非肽类蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶、激肽酶、纤维蛋白酶、凝血酶等酶活性，减轻胰腺损伤。不良反应有局部血管疼痛，浅静脉炎；皮疹、面色潮红；个别过敏休克。

乌司他丁能抑制相关酶的释放和活性，有效控制胰腺炎病情发展，减少胰腺炎并发症的发生。

非甾体类抗炎药：通过抑制环氧合酶活性，减少前列腺素生成，减轻炎症反应。胃肠道损害是这类药物最常见的副反应，包括消化不良症状和严重并发症(如胃十二指肠穿孔、梗阻及出血等)。

由此可见，目前治疗胰腺炎的药物种类较少，以对症治疗为主，疗效有限，往往不可避免药物的副作用，甚至产生严重不良反应。由于缺乏对于细胞病理生理早期重要事件发生的认识和理解，特异而又有效的治疗手段目前还很贫乏，亟需开发新的治疗药物。

死亡受体5(deathreceptor5,dr5)是肿瘤坏死因子受体家族的成员，在活化的外周血淋巴细胞、炎症组织、缺血组织中表达水平高。dr5受体与配体trail相结合后引起一系列信号级联反应，引发细胞凋亡。

人dr5蛋白是由411个氨基酸组成的跨膜蛋白。其中1～55位氨基酸是信号肽，84～179位氨基酸是含有2个富含半胱氨酸的重复功能区的链状结合区，184～206位氨基酸为跨膜区，胞内区含有死亡结构域。可溶性dr5(solubledr5,sdr5)为dr5不含跨膜区域的可溶性形式，因缺乏跨膜区域不能在细胞膜上表达而被分泌至细胞外。sdr5虽然保持与trail配体相结合的活性，但不能向细胞内传导凋亡信号，可阻断trail-dr5介导的细胞凋亡。且sdr5是人体自身蛋白，具有毒性小、无免疫原性的优点，极具作为胰腺炎的重要治疗药物的潜质。目前，sdr5对于胰腺炎是否存在治疗作用，国内外尚无报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，提供一种治疗胰腺炎的高效低毒的方法，本发明提供了一种人sdr5-fc重组融合蛋白，其序列如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示，或具有与seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.495％以上同源性并具有相同功能的重组融合蛋白。

本发明再一个方面提供了前述的人sdr5-fc重组融合蛋白在制备治疗或预防胰腺炎的药物中的应用。

本发明再一个方面提供了一种肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂在制备治疗或预防胰腺炎的药物中的应用。

其中，所述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体拮抗剂选自前述的人sdr5-fc重组融合蛋白。

在本发明的技术方案中所述胰腺炎为急性胰腺炎或慢性胰腺炎。

本发明再一个方面提供了一种治疗胰腺炎的药物组合物，其包含sdr5-fc重组融合蛋白序列或编码该蛋白序列的核苷酸序列及其药学上可接受的辅料。

本发明公开上述重组融合蛋白，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述重组融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；triton；十二烷基硫酸钠(sds)；poloxamer(如poloxamer188)；pluronics；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸等，其加入量应使重组融合蛋白颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括丙二醇、聚乙二醇、三元醇、高级糖醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为tris、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液之一。

本发明中sdr5-fc重组融合蛋白在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.01～3000mg/天。

本发明中人sdr5-fc重组融合蛋白对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠发挥保护作用，降低雨蛙素诱导的小鼠胰腺炎症反应。该物质能够通过降低急性胰腺炎过程中胰腺组织水肿、血清淀粉酶从而降低炎症反应，对胰腺炎具有显著的保护作用，该物质可用于制备药品用于急慢性胰腺炎的防治，降低临床急性胰腺炎的发生率和炎症程度。

有益效果

1、本发明为胰腺炎的治疗提供了新的研究方向和治疗手段。在胰腺炎中，无论致病原因是什么，必然会涉及细胞的凋亡。trail-dr5通路参与多种因素导致的急、慢性胰腺炎，因此适应范围广泛。

2、且sdr5-fc融合蛋白来源于人体自身的蛋白组分，安全性高，毒副作用更小。

附图说明

图1小鼠胰腺系数水平比较(平均值±sd)。使用t检验，治疗组小鼠胰腺系数显著性低于模型组，p<0.05。

图2小鼠胰腺组织胰蛋白酶活力水平比较(平均值±sd)。使用t检验，治疗组小鼠胰蛋白酶活力显著性低于模型组，p<0.01。

图3小鼠血清淀粉酶活力水平比较(平均值±sd)。使用t检验，治疗组小鼠血清淀粉酶活力显著性低于模型组，p<0.01。

具体实施方式

为了有助于理解本发明，下面提供描述了一系列实验结果的实施例。当然，不能将与本发明有关的实验解释为特别限制本发明，而且认为在本领域技术人员技术范围内的目前已知或进一步发展的本发明的这类改变属于本文所述以及后面要求保护的本发明范畴。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种试剂和样品，除另有说明均为市售产品。

实施例1重组sdr5-fc表达序列的设计和重组

发明人经过长期的经验积累，构建融合蛋白，将人sdr5与fc进行多种方式的融合，质谱分析结果显示目的蛋白n端不稳定，会出现多个氨基酸剪切，据此设计并制备多条氨基酸序列seqidno.1～4，其中seqidno.1的蛋白所含剪接异构体比例最低，在37度下为1％，而seqidno.2为31％；seqidno.3为49％；seqidno.4为52％，均显著性高于seqidno.1的剪接异构体比例，因此seqidno.1的蛋白纯度最优，最稳定。

seqidno.1

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seqidno.4：

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所述seqidno.1-4融合蛋白的氨基端是人死亡受体5可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白1(igg1)的fc片段。

所述的人死亡受体5可溶片段具有如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.8所示的氨基酸序列，或具有与seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7或seqidno.895％以上同源性并具有相同功能的蛋白。

所述的人免疫球蛋白1(igg1)的fc片段的氨基酸序列如seqidno.9所示。

人死亡受体5可溶片段与人免疫球蛋白1的fc片段之间直接连接。

seqidno.5：

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seqidno.9：

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实施例2：人sdr5-fc抗体融合蛋白治疗胰腺炎。

将60只昆明小鼠随机分为正常组、模型组和9mg/kgsdr5-fc治疗组(seqidno.1或seqidno.2或seqidno.3或seqidno.4)，每组10只，雌性各半。造模前禁食14小时，正常饮水。采用雨蛙素联合脂多糖(lipopolysaccharide,lps)致小鼠急性胰腺炎模型：用剂量为100μg/kg的雨蛙素对小鼠进行腹腔注射，连续6次，每隔1小时1次，在最后一次注射雨蛙素后立即腹腔注射10mg/kg的lps，完成造模。

正常组小鼠给予10ml/kg生理盐水；模型组小鼠在造模后，给予10ml/kg生理盐水；治疗组在造模后，给予9mg/kgsdr5-fc，给药体积为10ml/kg。造模后18小时，所有小鼠颌下静脉采血，脱臼处死小鼠，取胰腺组织，进行组织病理学观察，计算胰腺系数：胰腺系数＝胰腺湿重(mg)/小鼠体重(g)，检测胰腺组织胰蛋白酶(trypsin)和血清淀粉酶(amylase)活力，并进行统计学分析。

正常组小鼠饮水、活动良好，没有出现任何异常反应，胰腺组织没有明显异常，胰腺结构界限清晰，颜色正常，无水肿、充血。模型组小鼠胰腺组织体积增大，界限结构模糊，明显肿胀和充血。sdr5-fc治疗组胰腺轻微肿胀，界限结构较清晰，颜色接近正常组，出血少。sdr5-fc治疗组小鼠胰腺系数、胰组织胰蛋白酶水平和血清淀粉酶水平均显著低于模型组，接近正常组小鼠。表明sdr5-fc重组融合蛋白能有效治疗胰腺炎。具体试验结果参见附图1-3，通过附图可以看出治疗组小鼠胰腺系数显著性低于模型组，p<0.05。治疗组小鼠胰蛋白酶活力显著性低于模型组，p<0.01。治疗组小鼠血清淀粉酶活力显著性低于模型组，p<0.01。

除了本文所示和描述的这些内容之外，本发明的各种改进对于本领域技术人员而言可由前面的描述显而易见，而且它们属于以下的权利要求书范围。

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65707580

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859095

metcysarglyscysargthrglycysproargglymetvallysval

100105110

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115120125

<210>8

<211>116

<212>prt

<213>融合蛋白

<400>8

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151015

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202530

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65707580

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100105110

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<210>9

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<213>融合蛋白

<400>9

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151015

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202530

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505560

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65707580

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859095

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145150155160

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195200205

sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys

210215220

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225230