Scandinone在制备预防及治疗恶性黑色素瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及化合物新应用技术领域，更具体地，涉及scandinone在制备抑制恶性黑色素瘤药物中的应用。

背景技术：

皮肤恶性黑色素瘤(cutaneousmalignantmelanoma,cmm)虽然只占皮肤恶性肿瘤的5％左右，但是其高度恶性，死亡比例约占80％。每年全世界大约有5万人死于恶性黑色素瘤，其起病隐匿，极易出现转移。部分患者在确诊时常常已经是晚期，此时患者的中位生存期常常低于1年。

近年来恶性黑色素瘤的发病率逐年升高，在我国发病率虽较低，但增长却较快，每年新发病例约2万人。目前对于晚期黑色素瘤治疗，包括放疗、化疗、免疫疗法、靶向治疗。其中，放疗主要针对原发灶切除后的转移病灶，但仅可提高局部控制率，不能提高总生存率；化疗是治疗晚期黑色素瘤重要的手段，目前常用的药物有达卡巴嗪、替莫唑胺、氮烯咪胺、顺铂、长春新碱等，化疗虽能延长患者生存期，但是具有明显毒副作用，且存在有效率低下的问题。例如经典的抗黑色素瘤药物达卡巴嗪，有报道称其有效率仅为7％～13％。2010年的美国临床肿瘤学会(americansocietyofclinicaloncology，asco)会议报道，易普利姆玛(ctla-4单克隆抗体)能够延长晚期黑色素瘤患者总生存率，成为晚期黑色素瘤治疗近30年来最大的进步，具有里程碑式的意义，是晚期黑色素瘤治疗革命性的变化，揭开了黑色素瘤靶向治疗的新篇章。目前，黑色素瘤的个体化靶向治疗和免疫治疗在临床治疗中起到了较好的疗效，但是却存在治疗费用高昂，极易出现耐药的缺点。因此积极探索有效的治疗药物依然是黑色素瘤研究热点之一。

技术实现要素：

本发明提供了scandinone在制备抑制恶性黑色素瘤药物中的应用。

本发明以体外培养黑色素瘤细胞株sk-mel-28为研究对象，从细胞增殖、细胞周期阻滞、克隆形成和侵袭等方面，探究scandinone对皮肤黑色素瘤细胞生物学行为的影响；进一步从细胞凋亡、细胞自噬方面探讨其抗肿瘤机理；并在信号传导、受体结合角度初步探索了此中药单体发挥作用的靶点，为该制剂抗皮肤黑色素瘤下一步研究提供实验和理论依据。

本发明通过以下方案获得上述技术目的：

本发明提供了scandinone在制备抑制恶性黑色素瘤药物中的应用。

所述scandinone的结构式如下所示：

所述scandinone的化学式如下所示：

8-(3,3-二甲基烯丙基)-4’-羟基-2”’，2”’-二甲基吡喃[6,7-b]异黄酮。

进一步地，所述药物包括药学上可接受的盐或辅料。

本发明以体外培养黑色素瘤细胞株sk-mel-28为研究对象，从细胞增殖、细胞周期阻滞、克隆形成和侵袭等方面，探究scandinone对皮肤黑色素瘤细胞生物学行为的影响；进一步从细胞凋亡、细胞自噬方面探讨其抗肿瘤机理；并在信号传导、受体结合角度初步探索了此中药单体发挥作用的靶点，为该制剂抗皮肤黑色素瘤下一步研究提供实验和理论依据。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供的scandinone为从药食两用的中药柘果提取，成分安全可靠。本发明发现了scandinone在抗恶性黑色素瘤上的新的应用，且其抑制效果好，拓宽了已知化合物scandinone的应用，可进一步开发成相应的抗恶性黑色素瘤药物。

附图说明

图1scandinone对sk-mel-28细胞增值抑制曲线。

图2scandinone对sk-mel-28细胞和lo2细胞的抑制曲线。

图3scandinone对sk-mel-28克隆形成抑制图。

图4scandinone对sk-mel-28克隆形成抑制率。

图5不同浓度scandinone对sk-mel-28细胞侵袭力影响(×10)。

图6不同浓度scandinone对sk-mel-28细胞侵袭率影响。

图7scandinone对sk-mel-28细胞周期的影响(48h)。

图8scandinone导致sk-mel-28细胞周期改变。

图9不同浓度scandinone导致sk-mel-28细胞凋亡(×100)。

图10不同浓度scandinone导致sk-mel-28发生的凋亡率(48h)。

图11不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hprocaspase3、caspase9、parp、xiap的表达。

图12不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hprocaspase-3相对于内参蛋白β-tublin表达量(％)，注：＊表示0.01﹤p﹤0.05；＊＊表示0.001﹤p﹤0.01；＊＊＊表示p﹤0.001(同以下标注＊各图)。

图13不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hxiap相对于内参蛋白β-tublin表达量(％)。

图14不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hbcl-2、bax的表达。

图15不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hbcl-2相对于内参蛋白β-tublin表达量(％)。

图16不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hbax相对于内参蛋白β-tublin表达量(％)。

图17不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hakt/p-akt、mtor/p-mtor变化情况。

图18不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hakt相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图19不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hp-akt相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图20不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hmtor相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图21不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hp-mtor相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图22不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24herk/p-erk变化情况。

图23不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24herk相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图24不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hp-merk相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图25不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hjak/p-jak变化情况。

图26不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hjak相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图27不同浓度scandinone作用sk-mel-28细胞24hp-jak相对于内参蛋白β-tublin表达量。

图28scandinone作用sk-mel28darts结果。

图29scandinone和其他化疗药物对sk-mel-28细胞的ic50值(48h)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步的说明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：scandinone对sk-mel-28细胞存活、增殖、侵袭及细胞周期作用

1、细胞培养基的制备

(1)胎牛血清，经过56℃、30分钟灭活并分装保存于-20℃冰箱中。配制新鲜rpmi-1640培养基时，每90ml培养液加入胎牛血清10ml，使得血清在总培养液中的最终体积分数为10％。

(2)pbs缓冲液

缓冲液组成如下：na2hpo4·12h2o，3.56g；kh2po4，0.20g；kcl，0.20g；nacl，8.00g，将上述原料混合，加超纯水定容至1000ml，调节溶液ph至7.2-7.4之间，然后采用高压灭菌后4℃保存。

(3)d-hanks液：组成如下：kh2po4，0.06g；na2hpo4·2h2o，0.06g；nahco3，0.35g；kcl，0.40g；nacl，8.00g。将上述原料混合，加入超纯水搅拌溶解，定容至1000ml，随后采用高温高压灭菌，4℃保存备用。

(4)0.25％胰酶消化液500ml：

胰蛋白酶2.5g，加到1000mld-hanks液中，4℃下完全溶解，ph值调至7.6-7.8之间，使用0.22μm的滤膜除菌消毒，分装后4℃冰箱冻存。

(5)青霉素、链霉素储存液：

将80万单位青霉素干粉溶解于8mlpbs，配成浓度为100000u/ml青霉素溶液；100万单位硫酸链霉素溶解于10mlpbs，配成浓度为100000u/ml链霉素溶液，置于-20℃冰箱冻存备用。

2、细胞株的培养

(1)细胞复苏

①把液氮罐冻存细胞直接投入37℃-42℃温水中，在0.5-1分钟内完全迅速融化，使其快速复苏。

②取出冻存管，放置在离心机中以1000rpm转速，离心5分钟。

③遗弃上清液，用大约1ml含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液吹打重悬细胞，随后加入准备好的含有培养基的培养瓶中，置于10％co2、37℃培养箱中培养。

④待细胞贴壁后，把培养瓶中的培养基用滴管吸出丢弃，2mlpbs洗细胞两次后，加入5ml新鲜的培养基继续培养。

(2)细胞传代及培养

①细胞生长融合到80％以上时，于超净台中弃去原有培养液，pbs洗一遍，向瓶中加入适量0.25％胰蛋白酶于培养箱中消化1-2分钟。

②显微镜下观察细胞变皱缩、细胞间间隙增大，随即加入培养液，终止细胞消化，然后反复吹打细胞，形成单细胞悬液。

③吸取将适量单细胞悬液接种在新的培养瓶中，加入适量培养液继续培养细胞。

④稳定培养15天后开始实验。

(3)细胞计数

①用酒精棉球把血球计数板和盖玻片擦拭干净，放置在超净台晾干备用。

②小心把盖玻片盖在血球计数槽上，吸取10μl单细胞悬液沿盖玻片一侧缓慢加入，避免盖玻片有小气泡形成，并确保液体完全充满。

③将血球计数板置于显微镜下，用低倍镜进行观察细胞情况。

④适当调整好计数板位置，细胞计数器记录四个大格细胞数目，按以下公式计算细胞密度：

细胞悬液细胞数/ml＝(四个大格子的细胞数/4)×10⁴。

3、mtt法检测细胞增殖抑制率

(1)sk-mel-28(人高转移黑色素瘤细胞株)细胞及lo2培养至对数期，96孔板的每孔加入200μl细胞悬液，细胞密度为4000-5000个/孔。

(2)接种24h后，采取对半稀释的方法，加入用培养液稀释的异黄酮scandinone溶液，使每孔终浓度分别为0、0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000、30.0000μg/ml。设有空白组(无细胞)和对照组(无药物)，每组设3个复孔。

(3)分别作用24、48、72小时，吸去上清液，每孔加入10μl5mg/ml的mtt液体，放置于37℃培养箱内。

(4)mtt作用细胞4-6小时后吸去培养液，然后加入200μl的dmso溶液溶解沉淀，放于脱色摇床上摇匀5分钟后，用酶标仪检测570nm处的吸光值。

结果显示，在相同的作用时间下，随着scandinone药物浓度的增加，其对sk-mel-28细胞增值抑制逐渐增加；相同的scandinone浓度下，随着scandinone作用时间的延长，sk-mel-28细胞增值也出现明显的抑制(图1)。经过统计学分析，如表1所示，除了0.9375μm作用48小时之外，其余各组与对照组相比较均存在统计学差异(p﹤0.05)。为了验证scandinone的肝毒性，实验同时检查了不同浓度scandinone对正常肝细胞lo2的24小时增殖抑制，结果显示，其对人正常肝细胞lo2几乎没有影响(图2)。

表1不同浓度scandinone对sk-mel-28细胞增殖抑制率(n＝3)

*comparewith0group,p﹤0.05.

4、细胞克隆形成抑制实验

(1)取对数生长期的sk-mel-28细胞，胰酶消化，1000rpm离心5分钟，dmso完全培养基重悬细胞。

(2)设立dmso对照组和scandinone组，scandinone组终浓度分别为1μm、2μm，rpmi-1640(含10％胎牛血清)培养液稀释细胞悬液，然后接种在6孔培养板，每孔加入的细胞数量为300个，每组设3个复孔。

(3)含细胞的培养板置37℃、5％co2培养箱，培养14天，随后弃去培养液，用pbs小心浸洗2遍，加入75％乙醇固定30分钟，吸去固定液后，适量2％结晶紫染色30分钟后，用流水缓慢冲洗掉染色液，放置空气干燥，随后拍照。

(4)克隆形成率＝克隆数/接种数×100％

本实验显示，scandinone作用于sk-mel-28细胞14天，dmso空白对照组克隆形成数分别是52、46、60；1μmscandinone组形成克隆数为24、30、21；2μmscandinone组形成克隆数为6、8、5。scandinone可以明显降低克隆形成率。随着scandinone浓度增加细胞克隆数逐渐减少，克隆直径也逐渐缩小(图3)。三组克隆数经统计学卡方分析，f＝309.2，p﹤0.05(图4)。

5、transwell实验

(1)50μgmatrigel胶包被在transwell小室底部膜内表面，放置细胞培养箱成胶2小时。

(2)对数生长期的sk-mel-28细胞胰酶消化、离心，无血清rpmi-1640培养基重悬。将细胞密度调整为1×10⁶个/ml，取300μldmso及不同scandinone浓度处理的细胞悬液加入transwell上层小室，下室加入700μl含10％fbs的rpmi-1640的细胞培养基。

(3)每组3个复孔，37℃、5％co2培养。

(4)待培养18小时后取出transwell小室用pbs小心清洗2遍，用湿的棉球轻轻擦拭上室，去除非侵袭细胞；pbs洗2遍，吸干pbs。

(5)染色：在小室内和24孔板中分别加入0.3ml和0.7ml75％乙醇，固定细胞20分钟；吸除乙醇，分别在小室和24孔板中加入0.3ml和0.7ml的0.1％结晶紫，室温染色30分钟；吸出结晶紫，pbs冲洗3遍，流水小心冲洗，直至结晶紫染液冲洗干净，晾干。

(6)计数：显微镜下观察，随机取10个视野，计数细胞数、并进行拍照。

侵袭抑制率％＝(1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100％。

本研究通过异黄酮scandinone对sk-mel-28细胞增值抑制实验显示，较低浓度(0.9375μm、1.8750μm)的scandinone作用细胞24小时对细胞增殖的影响不明显。为了排除scandinone抑制细胞增殖作用对细胞侵袭实验的影响，侵袭实验采用scandinone浓度为1μm、2μm、3μm，作用时间为18小时。应用不同浓度scandinone处理sk-mel-28细胞，细胞穿到transwell小室下面的细胞数显著降低，呈现剂量依赖式(图5)。1μm处理后细胞侵袭抑制率为81％、2μm处理细胞后侵袭抑制率达58％，3μm处理细胞后侵袭抑制率达29％。经秩和检验x²＝11.1，p﹤0.05(图6)。

6、pi单染检测细胞周期

(1)对数期生长的sk-mel-28细胞，用rpmi-1640(含10％胎牛血清)培养液调整细胞悬液浓度为1×10⁴个/ml，随后接种在6孔培养板中，每孔加入含细胞的培养液2ml，每组2个复孔。

(2)接种完毕，放置在37℃、5％的co2培养箱，培养24小时后加入scandinone。使终浓度分别为0、3μmol/l，dmso组浓度小于0.4％。

(3)培养48小时后，重新消化并收集细胞，用冰的pbs洗涤细胞2次，70％乙醇固定细胞，置于4℃冰箱过夜。

(4)上机检测前2小时，1000rpm离心去除乙醇。pbs重悬洗涤2次细胞，加入0.1mlpbs重悬细胞，向样品中加入含rna酶的pi染色液，使其作用终浓度为50μg/ml，4℃避光染色30分钟。

(5)染色后将样品立即上流式细胞仪，用535nm激光激发，检测细胞dna含量，依据细胞dna的含量，通过流式细胞仪得出样品细胞g1、s和g2/m分布图，分析并处理结果。实验结果均采用spss16.0统计学软件进行统计分析。当双侧p值小于0.05时认为存在统计学意义。

流式细胞仪pi单染色分析显示：scandinone作用于sk-mel-28细胞48h后，3μm与0μm(对照组)相比，g1期细胞数量明显减少，由对照组75.60±0.934％降低至3μm的49.30±0.725％，而s期和g2期细胞百分比均增加。g2期由15.80±0.950％上升到27.00±0.566％，s期由8.59±0.930％上升到23.70±0.453％(图8)。提示scandinone使sk-mel-28细胞周期阻滞在g2/m期(图7)。

综上，本实验以高转移恶性黑色素瘤细胞株为载体，通过mtt实验，发现scandinone抑制黑色素瘤细胞系sk-mel-28增殖呈现时间和剂量依赖性，但对人正常肝细胞lo2几乎没有影响。且随着scandinone浓度的增加，sk-mel-28细胞穿到transwell小室下面细胞数量显著降低，呈现剂量依赖式。结果说明scandinone可以降低sk-mel-28细胞的侵袭能力。

通过流式细胞仪pi单染色分析3μmscandinone作用于sk-mel-28细胞48h后，与对照组相比，g1期细胞明显减少，s期和g2期细胞百分比增加。提示scandinone使sk-mel-28细胞周期阻滞在g2/m期，进而发挥抗黑色素瘤效果。

实施例2：scandinone对sk-mel-28细胞凋亡的作用

1、细胞培养同实施例1。

2、hoechest33342染色：

试剂配制：hoechest33342粉末25mg，瞬时离心，注入生理盐水10ml，配成浓度2.5mg/ml的工作液，分装到ep管中，避光，-20℃保存备用。

(1)取对数生长期的sk-mel-28细胞，用rpmi-1640培养液(含10％胎牛血清)重悬细胞，以每孔1×10⁵个细胞数量加入到6孔培养板。

(2)24小时后加入scandinone溶液，分别设置dmso对照组和加药组，scandinone组终浓度分别为3、6、9μm，37℃、5％co2培养箱培养24小时。

(3)吸除培养基，pbs洗涤2遍，固定液固定10分钟，晾干。

(4)hoechst33342避光染色15分钟，流水冲洗干净，晾干，显微镜拍照。

3、annexinv-pi双染测定细胞凋亡比例：

(1)取对数生长期的sk-mel-28细胞，rpmi-1640培养液(含10％小牛血清)重悬细胞，分别加入最终浓度为6μm、9μm、12μm的scandinone溶液，同时设立dmso对照组，培养48小时。

(2)收集细胞，1200rpm，离心5min，弃去上清，pbs洗2遍。

(3)加入500μlbindingbufffer悬浮细胞，再加入5μlannexinv-fitc及5μlpi，混匀，避光。

(4)在室温放置15分钟，上流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

本实验显示，当用dmso处理sk-mel-28细胞，细胞均呈淡淡的蓝色荧光，表示细胞存活良好，未出现明显凋亡细胞；用3μmscandinone处理sk-mel-28细胞24小时后，出现少许亮荧光细胞，表示细胞开始出现凋亡，随着scandinone浓度增加到6μm、9μm，亮荧光染色细胞明显增加，表示凋亡细胞明显增加(图9)。

4、免疫印迹(westernblot)

4.1溶液配制：

(1)10％的sds(十二烷基硫酸钠)：

100g的sds加入去离子水溶解，用浓盐酸把ph值调至7.2，定容至1000ml，常温条件下保存。

(2)10％的aps(过硫酸铵)：

取100mg过硫酸铵溶解于1ml去离子水，现用现配。

(3)1.5mtris·hcl(ph8.8)：

181.5g的trisbase溶解于900ml去离子水，浓盐酸调节溶液ph值到8.8，定容到1000ml，4℃冰箱保存。

(4)1mtris·hcl(ph6.8)：

121.1g的trisbase溶解于900ml去离子水，浓盐酸调节溶液ph值到6.8，定容到1000ml，4℃冰箱保存。

(5)1m二硫苏糖醇(dtt)：

3.09gdtt溶解于20ml浓度为0.01m的乙酸钠溶液(ph为5.2)，过滤除菌分装，储存于-20℃冰箱。

(6)30％的丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺290g；n，n-亚甲双丙烯酰胺10g；称取上述物质，加入去离子水充分溶解后定容至1000ml，0.45μm滤器除菌，避光条件下4℃冰箱保存。

(7)5×电泳缓冲液buffer：加入trisbase15g；甘氨酸，72g；sds，5g；将上述原料混合，加入去离子水溶解，定容至1000ml，4℃保存。

(8)1×转移缓冲液bμffer：trisbase，5.8g；甘氨酸，2.9g；sds，0.37g；甲醇，200ml；将以上原料溶解于去离子水，定容至1000ml，4℃保存。

(9)1×tbst洗膜液：tris·hcl(1m,ph8.0)，20ml；5mnacl，60ml；tween-20(吐温)，2ml；将以上原料溶解于去离子水，定容至2000ml，4℃保存。

(10)6×sds-pageloadingbuffer(聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液)：4×trishcl/sds(ph6.8)，7ml；sds，1g；dtt，0.93g；溴酚蓝，1.2mg；甘油，3.0ml；将以上原料混合，用去离子水溶解定容至10ml，-20℃保存。

4.2实验方法

(1)蛋白提取

①胰酶消化收集细胞，pbs洗涤2遍，微量移液器尽量洗干净pbs。

②按照10μl/cm²细胞生长面积，加入相应体积的细胞裂解液(含pmsf)，于4℃裂解15-20分钟。

③蛋白刮刮取蛋白，所有液体转移至ep管。

④4℃，12000rpm离心15-20分钟，吸取含蛋白溶液的上清至新ep管，置于-20℃冰箱保存。

(2)蛋白的定量与变性

①蛋白浓度测定：应用bca蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。

②蛋白样品的变性：以上收集得到的蛋白体积加入6×上样缓冲液，使得上样缓冲液最终浓度为1×，之后100℃变性10分钟，于-20℃冰箱保存或上样跑胶。

(3)电泳和转膜

①制胶：浓缩胶浓度为5％，分离胶的浓度6％-15％之间，凝固之后的聚丙烯酰胺凝胶暂存于4℃冰箱。

②电泳：变性后的蛋白样品加入浓缩胶上样孔，预留一孔加入蛋白预染marker。调节电压调至80v，待蛋白条带电泳至浓缩胶与分离胶界面时，将电压调整到120v，直到溴酚蓝到达分离胶底部，停止电泳。

③转膜：甲醇浸泡0.45μm的pvdf膜，海绵和滤纸夹住凝胶和膜，应用湿转法转膜，电流设定为110ma，4℃条件下转膜3小时。

(4)抗体孵育和发光

①封闭pvdf膜：使用1×tbst配制5％脱脂牛奶，煮沸待降至室温，pvdf膜浸泡于配好的牛奶中2小时，完成封闭。

②一抗孵育：用配好的一抗稀释液稀释一抗(比例为1:500-1:1000)，4℃下孵育过夜。

③二抗孵育：用tbst洗pvdf膜3次，每次10分钟。再加入相应的二抗(用5％脱脂牛奶稀释至1:5000)，室温条件下，水平摇床孵育2小时或4℃孵育过夜。

④化学显影发光：用tbst洗pvdf膜3次，每次10分钟。在pvdf膜的表面滴加适量化学发光液，于暗室内使用胶片将蛋白条带显影，冲洗胶片得到蛋白条带，做好标记并保存。

实验结果均采用spss16.0统计学软件进行两样本t检验统计分析。当双侧p值小于0.05时认为存在统计学意义。

本实验通过annexinv-fitc/pi流式细胞术显示，当dmso处理sk-mel-28细胞48小时，细胞凋亡率为3.2％；6μm的scandinone处理sk-mel-28细胞48小时，细胞凋亡率为39.4％；9μm的scandinone处理sk-mel-28细胞48小时，细胞凋亡率为73.1％；12μm的scandinone处理sk-mel-28细胞48小时，细胞凋亡率为86.2％。实验结果证实，scandinone能明显诱导sk-mel-28细胞发生凋亡，而且随着scandinone浓度增加，细胞的凋亡率呈剂量依赖性增加(图10)。

本专利使用westernblot法对0μm、3μm、6μm和9μm的scandinone作用sk-mel-28细胞24小时，内源性凋亡上游启动因子caspase-9和下游执行因子procaspase-3、凋亡抑制蛋白xiap及死亡底物parp表达及活化情况进行分析。结果发现，caspase-9蛋白在应用3μmscandinone时切割条带并不明显，随着scandinone浓度的增加，在6μm和9μm时出现切割条带，而且随着剂量增加，下方切割条带明显增加(图11)。parp在3μm、6μm和9μm的scandinone作用时均出现明显的切割条带。研究同时应用，alphaimager2200图像分析软件，以β-tublin蛋白表达灰度值为标准，计算出procaspase-3蛋白表达相对量。结果显示，在3μmscandinone作用时其相对表达量是28.0％(t＝12.34，p﹤0.05)，scandinone浓度增加到6μm时相对表达量是13％(t＝18.19，p﹤0.05)，9μm时相对表达量降低为7.5％(t＝22.75，p﹤0.05)，procaspase-3表现出剂量依赖式的下降(图12)。xiap蛋白在3μmscandinone作用时，其相对内参蛋白表达量是77.6％(t＝4.48，p＝0.01﹤0.05)，scandinone浓度增加到6μm时，相对表达量降低到66.5％(t＝5.74，p＝0.004﹤0.05)、9μm时相对表达量则降低为45.6％(t＝10.69，p﹤0.05)，表现出剂量依赖式的下降(图13)。

本研究分别选取促凋亡蛋白bcl-2和抗凋亡蛋白bax进行分析，westernblotting免疫印迹检测，观察scandinone对sk-mel-28细胞这两个蛋白表达影响(图14)。采用alphaimager2200图像分析软件，以β-tublin蛋白表达灰度值为标准，计算出bcl-2、bax蛋白表达相对量。结果显示，bcl-2蛋白在3μmscandinone作用时，其相对表达量是69.4％(t＝3.54，p＝0.024﹤0.05)，scandinone浓度增加到6μm时，相对表达量降低到44.1％(t＝6.74，p﹤0.05)，9μm时相对表达量则降低为24.1％(t＝8.69，p﹤0.05)。表现出剂量依赖式的下降(图15)。bax蛋白在3μmscandinone作用时，其相对表达量是内参蛋白的1.04倍(t＝0.166，p＝0.88﹥0.05)，scandinone浓度增加到6μm时，相对表达量则上升到内参蛋白的1.82倍(t＝6.84，p＝0.002﹤0.05)、9μm时相对表达量则是内参蛋白的2.87倍(t＝17.4，p﹤0.05)。表现出剂量依赖式的上升(图16)。

实施例3：scandinone对sk-mel-28细胞生存通路影响

1、细胞培养同实施例1。

2、免疫印迹同实施例2。

统计学方法同实施例2，本研究以akt和mtor为目标蛋白，应该不同浓度scandinone(0μm、3μm、6μm、9μm)处理sk-mel-28细胞，分别对其总蛋白及磷酸化蛋白水平进行westernblotting免疫印迹检测，观察scandinone对sk-mel-28细胞此两个蛋白表达影响(图17)，alphaimager2200图像分析软件，以β-tublin蛋白表达灰度值为标准，计算出蛋白表达相对量。

实验结果显示，应该scandinone处理sk-mel-28细胞24小时后，akt总蛋白表达量基本不变(图18)，而磷酸化akt随着scandinone浓度的增加，呈现剂量依赖性下降，p-akt蛋白表达相对β-tublin的灰度值比值，从0μmscandinone时的0.536，下降为3μm的0.336(t＝7.91，p＝0.001﹤0.05)，到6μm、9μm时的0.295(t＝8.10，p﹤0.05)、0.209(t＝12.93，p﹤0.05)，经统计学分析，各组间存在统计学差异，并且差异显著(图19)。mtor是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为akt下游目标蛋白之一，在细胞生长和凋亡中发挥极为重要的作用。实验结果显示，当scandinone作用于sk-mel-28细胞后mtor蛋白表达及活化情况与akt蛋白相似，p-mtor呈现剂量依赖式的下降，从0μmscandinone时的0.646，下降为3μm的0.447(t＝4.97，p＝0.007﹤0.05)，到6μm、9μm时的0.248(t＝8.95，p﹤0.05)、0.187(t＝12.31，p﹤0.05)，经统计学分析，各组间存在显著统计学差异(图20)。而mtor总蛋白表达量基本不变(图21)。

本实验以erk为目标靶蛋白，进行westernblotting免疫印迹检测(图22)，以alphaimager2200图像分析软件初步分析，scandinone对sk-mel-28黑色素瘤erk蛋白的影响。结果显示，应用scandinone处理sk-mel-28细胞24小时后，erk总蛋白表达量基本不变(图23)，而erk蛋白磷酸化水平随着scandinone浓度的增加，呈现剂量依赖性下降，p-erk蛋白表达相对β-tublin的灰度值比值，从0μm时的1.673倍，下降为3μm的1倍(t＝9.25，p﹤0.05)，到6μm、9μm时的0.753倍(t＝16.77，p﹤0.05)、0.786倍(t＝13.99，p﹤0.05)，经统计学分析，各组间存在显著统计学差异(图24)。

jak属于非受体型酪氨酸激酶，其异常激活在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭与转移等方面发挥重要作用。westernblotting免疫印迹检测分析该通路中jak激酶的活性，对了解scandinone是否影响sk-mel-28黑色素瘤jak/stat通路具有重要意义(图25)。研究结果显示，应用不同浓度的scandinone作用sk-mel-28细胞24小时，jak总蛋白表达量基本不变(图26)，随着scandinone浓度的增加，jak磷酸化水平逐渐下降。p-jak蛋白表达相对β-tublin的灰度值比值，在0μm时为1.344，3μm时为1.179(t＝1.27，p＝0.27﹥0.05)，到6μm、9μm时分别的1.001(t＝3.06，p＝0.03﹤0.05)、0.832(t＝5.26，p＝0.006﹤0.05)，经统计学分析，3μm组与空白对照之间没有差异；而6μm组和9μm组与空白对照组之间存在显著统计学差异(图27)。

实施例4：scandinone对sk-mel-28细胞结合靶标探索

1、细胞培养同实施例1。

2、免疫印迹同实施例2。

3、darts实验：

(1)将生长状态良好的sk-mel-28细胞种于10cm培养皿中，细胞生长24h后加入600ul裂解液，裂解细胞，并刮取细胞收集于1.5mlep管中。

(2)测蛋白浓度，采用bca法测定总管蛋白浓度，最适蛋白浓度在2000-5000μg/ml之间。

(3)向测完蛋白浓度的总蛋白中加入10×tncbuffer，然后将总蛋白均等分为两份于两只1.5mlep管中，在两只ep管上分别标记a管(dmso对照组)和b管(药物处理组)，各管蛋白体积为297μl。

(4)a管加入3μldmso，b管加入3μlscandinone(2mm)，置于360度摇床，室温，孵育1小时。

(5)使用1×tncbuffer稀释链霉蛋白酶(10mg/ml)，使其在总体系中的浓度比为1:2000，然后分别加入各个处理组。置于360度摇床，室温，孵育30min。

(6)充分混匀后，金属浴煮蛋白5min。准备上样跑胶。

westernblotting结果显示，实验样品不加入链霉蛋白酶时，不论加不加scandinone药物，sk-mel-28细胞中egfr和akt蛋白均正常表达；当加入链霉蛋白酶，如果不加入scandinone，egfr蛋白量表达量下降，加入scandinone后，egfr蛋白表达量明显增加，说明scandinone可以结合egfr，egfr对链霉蛋白酶降解产生抵抗。对于akt而言，无论加不加scandinone均不影响链霉蛋白酶对其降解(图28)，说明scandinone没有结合akt。从实验结果中进一步证实了scandinone通过结合egfr发挥作用。

根据药物与靶标的亲和性、表达量、结构稳定性等特征，多种用于小分子药物靶标寻找的方法被开发利用。药物结合蛋白稳定性实验就是基于药物结合的靶标具有抗酶解特性开发的技术，scandinone通过结合egfr发挥药物作用，进一步可以解释，scandinone所引起的egrf信号通路：ras/raf/mek/erk；pi3k/akt/mtor；jak/stat途径中关键靶蛋白的磷酸化水平下降，进而导致的肿瘤细胞发生线粒体依赖的凋亡及细胞周期阻滞，引起细胞的死亡，证实scandinone发挥的抗肿瘤特性。

实施例5：scandinone与其他抗肿瘤药物对sk-mel-28细胞抑制活性的ic50对比：

已有研究报道，黑色素瘤sk-mel-28细胞株对常规化疗药物5fu和cisplatin产生耐药性(dong,yang,elliott,&mcmasters,2002)，各自ic50(48h)为105.2μm和36.3μm。结合上述文献检索，参照dong,yang,elliott,&mcmasters,2002中的处理方法，我们采用mtt法检测了不同浓度scandinone和不同时间点对sk-mel-28细胞的增殖抑制的影响。如表2所示，scandinone对sk-mel-28细胞的ic50值呈现时间依赖性。其中，scandinone处理48小时后的ic50(6.3μm)显著低于依托泊苷(ic50＝11.8μm)、5-fu(ic50＝105.2μm)和顺铂(36.3μm)等常规化疗药物(图29)。

表2scandinone对sk-mel-28细胞的ic50值