本发明涉及纳米药物技术领域，特别是涉及金团簇在制备预防及治疗阿兹海默病的药物中的新的医药用途。
背景技术：
神经退行性疾病是人类健康的重大威胁之一，其共通的病理特征是神经细胞内存在蛋白质异常缠结及淀粉样纤维化变性，以及与之相关的神经细胞凋亡及神经功能损伤。阿兹海默病(ad)是其中最典型的一种，其临床表现以记忆与认知功能障碍以及人格和行为改变为特征，主要发病于老年人，且发病率随着年龄的增大而增大，65岁以上人群发病率为5％，而80岁以上人群则高达30％以上。因此，随着人类寿命的延长和人口老龄化的加剧，ad的患病人数持续增加，迄今已有超过四千万患者，预计2050年将达到1.5亿。仅美国，照顾ad病人的费用每年就已超过2000亿美元，为癌症的2倍，使其成为世界上最昂贵的疾病。然而，其病因迄今未知。在临床治疗方面，虽然已有几种药物被美国fda批准用于轻度或中度ad的治疗，但这些药物都属于神经递质调节类药物，仅能暂时改善患者的认知功能，停药之后会很快反弹，目前尚无任何药物能终止或逆转其病理进程。因此，开发新型ad预防与治疗药物具有重大意义。
研究发现：脑内老年斑的形成是ad的基本病理特征之一，作为其主要组成物质的β-淀粉样蛋白(aβ)是由36-43个氨基酸组成的多肽，是纤维化蛋白前体蛋白(app)的水解产物，其中aβ(1-40)的含量约占aβ总量的90％以上。当前研究已明确，虽然aβ有正常的生理功能，可通过调控胆碱酯酶的催化活性调控神经突触间的乙酰胆碱能信号传递，但aβ在脑内的过度聚集与纤维化可引起神经突触功能障碍，及后续的继发性炎症反应，导致神经元功能丧失和死亡。因此，研发能够抑制aβ的聚集及纤维化，阻断其神经毒性的物质是ad药物研发的重要思路之一。
金纳米粒子是尺寸为纳米级(研究中所用的金纳米粒子的金核直径通常大于3nm)的金颗粒，因其具有独特的光学和电学性质，良好的生物相容性，并易于表面修饰，广泛应用于生物传感器、医学成像和肿瘤检测等生物及医学相关领域。由于其化学惰性和巨大的比表面，以及具有低浓度下穿透血脑屏障的能力，金纳米粒子也作为药物载体用于药物定向输运、药物可控释放等方面的研究。近年来，有研究将金纳米粒子与对纤维化蛋白的聚集有抑制作用的特定配体(如杂多酸、特定序列的多肽等)结合，在抑制蛋白纤维化变性的体外实验中取得一定效果(y.h.liao,y.j.chang,y.yoshiike,y.c.chang,y.r.chen,small2012,8,3631；y.d.alvarez,j.a.fauerbach,j.v.pellegrotti,t.m.jovin,e.a.jares-erijman,f.d.stefani,nanoletters2013,13,6156；s.hsieh,c.w.chang,h.h.chou,colloidsandsurfacesb:biointerfaces,2013,112,525)，但细胞模型的结果表明，虽然金纳米粒子(金核尺寸5nm以上)与对纤维化蛋白损伤细胞具有保护作用的化合物共同使用时对细胞存活率提升存在一定协同作用(n.gao,h.sun,k.dong,j.ren,x.qu,chemistry-aeuropeanjournal2015,21,829)，但其单独使用时作用并不明显。ad动物模型层面的实验则未见报道。并且在这些研究中，金纳米粒子主要作为药物载体使用，而不是起效成分。
金团簇是一种超微金纳米粒子，金核直径小于3nm。其中仅含有数个至数百个金原子，导致常规金纳米粒子中所具有的金原子的面心立方堆积结构坍塌，能级发生分裂，从而表现出与3nm以上的常规金纳米粒子完全不同的类分子的性质：一方面，由于能级分裂，金团簇不具备常规金纳米粒子所具有的表面等离子体效应及衍生的光学性质，却表现出与半导体量子点相似的优异荧光发射性质；另一方面，金团簇的紫外可见吸收光谱中在520±20nm处的等离子体共振峰消失，而在560nm以上出现一个或多个新的吸收峰，而这类吸收峰在常规金纳米粒子中观察不到，因此紫外可见吸收光谱中等离子体共振吸收峰(520±20nm)的消失和560nm以上新吸收峰的出现是判断金团簇是否制备成功的重要标志(h.f.qian,m.z.zhu,z.k.wu,r.c.jin,accountsofchemicalresearch2012,45,1470)。金团簇还具有与常规金纳米粒子明显不同的磁学、电学、催化性质和光热效应，因而在单分子光电、分子催化、光热转变等领域具有广阔的应用前景。此外，金团簇由于优异的荧光发射性质在生物探针及医学成像领域也已获得应用。
此外，金团簇由于优异的荧光发射性质在生物探针及医学成像领域也已获得应用。例如，sandeepverma课题组将嘌呤修饰的金团簇作为绿色荧光探针用于细胞核成像，(j.r.wallbank,d.ghazaryan,a.misra,y.cao,j.s.tu,b.a.piot,m.potemski,s.wiedmann,u.zeitler,t.l.m.lane,s.v.morozov,m.t.greenaway,l.evaes,a.k.geim,v.i.falko,k.s.novoselov,a.mishchenko,acsappliedmaterials&interfaces2014,6,2185)，该类文献利用的是金团簇的荧光特性，而未涉及其本身的药用活性。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提出含金团簇的物质在制备预防和治疗阿兹海默病药物中的应用，所述含金团簇的物质包括金团簇及其外部包覆的配体y。
所述金团簇的金核直径小于3nm，优选0.5-2.6nm。
所述配体y包括但不局限于l(d)-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、其它含巯基的化合物中的一种或几种。
所述l(d)-半胱氨酸及其衍生物优选l(d)-半胱氨酸、n-异丁酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nibc)或n-乙酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nac)等。
所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物优选l-精氨酸-l-半胱氨酸(rc)、l-半胱氨酸-l-精氨酸(cr)、l-半胱氨酸-l-组氨酸二肽(ch)、l-组氨酸-l-半胱氨酸二肽(hc)、l-赖氨酸-l-半胱氨酸-l-脯氨酸三肽(kcp)、l-脯氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(pcr)、甘氨酸-l-丝氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸四肽(gscr)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-丝氨酸-l-精氨酸四肽(gcsr)或l-谷胱甘肽(gsh)等。
所述其它含巯基的化合物优选1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸(cap)、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、d-3-巯基缬氨酸、n-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸或十二硫醇等。
第二方面，本发明提供了含金团簇的物质在制备与aβ的聚集及纤维化相关的疾病的药物中的应用，所述金团簇的金核直径小于3nm，所述配体y如上述。
所述含金团簇的物质的制备方法包括以下步骤：
(1)把haucl4溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯中的一种配成haucl4浓度为0.01～0.03m的溶液a；
(2)把配体y溶于溶剂中配成浓度为0.01～0.18m的溶液b，其中，配体y包括但不局限于半胱氨酸及半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸的寡肽(如二肽、三肽、四肽等)及其衍生物、其它含巯基的化合物(如：2-巯基-4-甲基-噻唑乙酸或1-[2s]-2-甲基-3-巯基-1-氧化丙基]-l-脯氨酸等)中的一种或多种；
(3)将步骤(1)的溶液a和步骤(2)的溶液b混合，haucl4和配体y的摩尔比为1:0.01～1:100，在冰浴下搅拌反应0.1～48h，滴加0.025～0.8m的nabh4溶液(优选nabh4水溶液、nabh4乙醇溶液、nabh4甲醇溶液)后，在冰水浴中继续搅拌反应0.1～12h，nabh4与配体y的摩尔比为1:0.01～1:100；
(4)反应结束后将步骤(3)的反应液以8000～17500r/min离心10～100min，即可得到不同平均粒径的金团簇沉淀；优选的，将步骤(3)的反应液用截留分子量为3k～30k的超滤管以8000～17500r/min梯度离心10～100min，即可得到不同平均粒径的金团簇；
(5)将步骤(4)得到的不同平均粒径的金团簇沉淀溶于水并装入透析袋中在室温下置于水中透析1～7天；
(6)将透析袋内的金团簇溶液冷冻干燥12～24h，得到含金团簇的物质。
步骤(2)中所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水、乙醇、正丙醇、戊烷、甲酸、乙酸、乙醚、丙酮、苯甲醚、1－丙醇、2－丙醇、1－丁醇、2－丁醇、戊醇、乙醇、乙酸丁酯、三丁甲基乙醚、乙酸异丙酯、二甲亚砜、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、2－甲基－1－丙醇、乙酸丙酯中的一种或多种；
所述含金团簇的物质为粉末或絮状物。
本发明提供的含金团簇的物质在抑制aβ聚集的体外实验表现出优异的抑制aβ聚集的效果，在aβ诱导的细胞ad模型实验中对改善细胞存活率表现出优异效果。在ad的转基因小鼠模型中，该含金团簇的物质可显著改善患病小鼠的认知行为能力，对小鼠海马区及脑皮质内aβ(1-40)和aβ(1-42)斑块的形成均有显著抑制作用。此外，本发明的含金团簇的物质在细胞及动物层面也具有良好的生物安全性，因此，本发明的含金团簇的物质对ad等神经退行性疾病的新药研发有重要意义。
另一方面，由于配体分子本身在体外抑制aβ聚集的实验中并未表现出抑制作用，在aβ损伤的ad细胞模型试验中对细胞存活率也无提升作用，这表明对ad的药效来自于金团簇本身，而不是配体。基于金团簇本身对ad的药用活性，有望研发出具竞争力的新药。
附图说明
图1为不同粒径的配体l-nibc修饰的金纳米粒子的紫外可见光光谱、透射电镜照片和粒径分布图；
图2为不同粒径的配体l-nibc修饰的金团簇的紫外可见光光谱、透射电镜照片和粒径分布图；
图3为不同粒径的配体l-nibc修饰的金团簇的红外光谱图；
图4为aβ(1-40)与均为配体l-nibc修饰的金纳米粒子或金团簇共同孵育48h后的afm形貌图；
图5为不同粒径、不同浓度的均为配体l-nibc修饰的金纳米粒子和金团簇的aβ纤维化动力学曲线图；
图6为不同粒径、不同浓度的均为配体l-nibc修饰的金纳米粒子或金团簇对aβ诱导的ad细胞模型细胞存活率影响图；
图7为配体cr修饰的金团簇(cr-auncs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；
图8为配体rc修饰的金团簇(rc-auncs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；
图9为配体1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸(即卡托普利(cap))修饰的金团簇(cap-auncs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；
图10为配体gsh修饰的金团簇(gsh-auncs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；
图11为配体d-nibc修饰的金团簇(d-nibc-auncs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；
图12为不同配体修饰金团簇对aβ(1-40)聚集及纤维化的抑制效果图；
图13为实施例5中的水迷宫实验装置示意图；
图14为含金团簇的物质对app/ps1双转基因c57bl/6小鼠模型认知行为学(给药第150天)影响图；
图15为含金团簇的物质对app/ps1双转基因c57bl/6小鼠模型鼠海马区及脑皮质aβ(1-40)表达(给药100天)的影响图；
图16为含金团簇的物质对app/ps1双转基因c57bl/6小鼠模型鼠海马区及脑皮质aβ(1-42)表达(给药100天)的影响图；
图17为含金团簇的物质对app/ps1双转基因c57bl/6小鼠模型鼠海马区及脑皮质aβ(1-40)表达(给药150天)的影响图；
图18为含金团簇的物质对app/ps1双转基因c57bl/6小鼠模型鼠海马区及脑皮质aβ(1-42)表达(给药150天)的影响图；
图19为不同粒径、不同浓度的含金团簇的物质对sh-sy5y神经母瘤细胞存活率的影响图。
具体实施方式
发明人在研究具有某些配体的金纳米粒子对aβ聚集的作用时发现：当金纳米粒子金核直径从大变小时，表面相同配体修饰的金纳米粒子对aβ的聚集从促进作用转变为抑制作用，当其粒径足够小转变为金团簇时，可实现aβ的聚集的完全抑制。而这一效应中起抑制作用的并不是配体，而是金团簇本身。
通常，研究中所用的金纳米粒子金核直径在3nm以上，而当金核直径小于3nm时被称为金团簇，紫外可见吸收光谱中等离子体共振吸收峰(520±20nm)的消失和560nm以上新吸收峰的出现是判断金团簇是否制备成功的标志。金团簇不能脱离配体单独在溶液中稳定存在，其与含巯基的配体通过au-s键结合，形成配体修饰的金团簇(或称金团簇)。
已有文献公开的配体修饰的金团簇有l-谷胱甘肽(gsh)、n-乙酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nac)、n-异丁酰基-l(d)-半胱氨酸(l(d)-nibc)等修饰的金团簇等，其制备过程见文献(h.f.qian,m.z.zhu,z.k.wu,r.c.jin,accountsofchemicalresearch2012,45,1470；c.gautier,t.bürgi,journaloftheamericanchemicalsociety2006,128,11079)；其应用集中于催化、手性识别、分子检测、生物传感、药物运输、生物成像等领域(g.li,r.c.jin,accountsofchemicalresearch2013,46,1749；h.f.qian,m.z.zhu,z.k.wu,r.c.jin,accountsofchemicalresearch2012,45,1470；j.f.parker,c.a.fields-zinna,r.w.murray,accountsofchemicalresearch2010,43,1289；s.h.yau,o.varnavski,t.goodson,accountsofchemicalresearch2013,46,1506)。
本发明围绕金团簇对ad的影响进行研究，至少包括：首先以具有不同配体(对aβ的聚集没有抑制作用的配体)不同尺寸的金团簇为对象，通过抑制aβ聚集聚集的体外实验、aβ诱导的ad细胞模型实验、ad转基因小鼠模型实验三个层面的研究，并结合金团簇的细胞毒性、小鼠急性毒性实验、小鼠体内分布实验等，提供了配体修饰的金团簇，发现其在制备治疗ad的药物中的应用，并与金纳米粒子的实验结果对比，阐明直径大于3nm的金纳米粒子在这一用途中效果不佳，不能用于制备治疗ad的药物，而配体修饰的金团簇可以用作制备治疗ad的药物。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
下列实施例中所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。
实施例1：制备配体修饰的金团簇
本实施例介绍制备配体修饰的金团簇的方法，包括以下步骤：
(1)把haucl4溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯中的一种配成溶液a，其中haucl4的浓度为：0.01～0.03m；
(2)把配体y溶于溶剂中配成溶液b，其中，配体y的浓度为：0.01～0.18m；配体y包括但不局限于l(d)-半胱氨酸及其他半胱氨酸衍生物，如n-异丁酰基-l-半胱氨酸(l-nibc)、n-异丁酰基-d-半胱氨酸(d-nibc)、n-乙酰基-l-半胱氨酸、n-乙酰基-d-半胱氨酸等；含半胱氨酸的寡肽及其衍生物,包括但不局限于含半胱氨酸的二肽、三肽、四肽及其它肽，如：l-半胱氨酸-l-精氨酸二肽(cr)、l-精氨酸-l-半胱氨酸二肽(rc)、l-半胱氨酸l-组氨酸(ch)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(gcr)、l-脯氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸三肽(pcr)、l-谷胱甘肽(gsh)、甘氨酸-l-丝氨酸-l-半胱氨酸-l-精氨酸四肽(gscr)、甘氨酸-l-半胱氨酸-l-丝氨酸-l-精氨酸四肽(gcsr)等；及其他含巯基的化合物，如1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、d-3-巯基缬氨酸、十二硫醇等中的一种或多种；溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水、乙醇、正丙醇、戊烷、甲酸、乙酸、乙醚、丙酮、苯甲醚、1－丙醇、2－丙醇、1－丁醇、2－丁醇、戊醇、乙醇、乙酸丁酯、三丁甲基乙醚、乙酸异丙酯、二甲亚砜、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、2－甲基－1－丙醇、乙酸丙酯中的一种或多种；
(3)将溶液a和溶液b混合，使得haucl4和配体y的摩尔比为1:(0.01～100)，在冰浴下搅拌反应0.1～48h，滴加0.025～0.8m的nabh4的水、乙醇或甲醇溶液，在冰水浴中继续搅拌反应0.1～12h，nabh4与配体y的摩尔比为1:(0.01～100)；
(4)反应结束后将反应液用截留分子量为3k～30k的超滤管以8000～17500r/min梯度离心10～100min，即可得到不同平均粒径的配体修饰的金团簇沉淀(具体的梯度离心如实施例2中(4)中所述，因不同截留分子量的超滤管的滤膜的孔径直接决定了能通过的金团簇的尺寸)，此步骤也可省略，即在步骤(3)结束后直接进入步骤(5)，得到的是不同尺寸混合的金团簇；
(5)将步骤(4)得到的不同平均粒径的金团簇沉淀溶于水并装入透析袋中在室温下置于水中透析1～7天；
(6)透析后，冷冻干燥12～24h，得到的粉末状或絮状物质即为配体修饰的金团簇。
经检测(具体检测方法参见实施例2)，用以上方法得到的粉末或絮状物质，其粒径均小于3nm(一般分布在0.5-2.6nm)，其紫外-可见吸收光谱在560nm以上出现一个或者多个吸收峰，在520nm没有明显吸收峰，确定获得的粉末或絮状物为金团簇。
实施例2：不同配体修饰的金团簇的制备与确认
以配体l-nibc为例，详述配体l-nibc修饰的金团簇的制备与确认。
(1)称取1.00g的haucl4溶于100ml甲醇配成浓度为0.03m的溶液a；
(2)称取0.57g的l-nibc，溶于100ml冰醋酸(乙酸)配成浓度为0.03m的溶液b；
(3)取1ml溶液a分别与0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml的溶液b混合(即haucl4与l-nibc摩尔比分别为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)，冰浴搅拌下反应2h，溶液颜色由亮黄色变为无色，迅速加入新配制的0.03m(称取11.3mgnabh4溶于10ml乙醇配制得到)的nabh4水溶液1ml，溶液颜色变为深褐色后持续反应30min，加入10ml丙酮终止反应。
(4)反应结束后将反应液采用差速离心法得到不同粒径的l-nibc修饰的金团簇粉末，具体方法：反应结束后将反应液转移至截留分子量为30k的容积为50ml的超滤管中，用10000r/min的转速离心20min，取内管中的截留物溶于超纯水中即得到粒径为2.6nm左右的粉末，然后将外管中的混合溶液转移至截留分子量为10k的容积为50ml的超滤管中，用13000r/min的转速离心30min，取内管中的截留物溶于超纯水中即得到粒径为1.8nm左右的粉末，然后继续将外管中的混合溶液转移至移至截留分子量为3k的容积为50ml的超滤管中，用17500r/min的转速离心40min，取内管中的截留物溶于超纯水中即得到粒径为1.1nm左右的粉末。
(5)将通过梯度离心法得到的三个不同粒径的粉末沉淀，分别除去溶剂，并将粗品用n2吹干后溶于5ml超纯水，装入透析袋(截留分子量为3kda)，置于2l超纯水中，隔天换水，透析7天，冷冻干燥后备用。
对以上制备得到的粉末(配体为l-nibc的金团簇)进行表征实验，同时以配体同为l-nibc的金纳米粒子作为对照。配体为l-nibc的金纳米粒子的制备方法参照文献(w.yan,l.xu,c.xu,w.ma,h.kuang,l.wangandn.a.kotov,journaloftheamericanchemicalsociety2012,134,15114；x.yuan,b.zhang,z.luo,q.yao,d.t.leong,n.yanandj.xie,angewandtechemieinternationaledition2014,53,4623)中的介绍。
1、透射电子显微镜观察形貌
把待测粉末(实施例2中制得的l-nibc修饰的金团簇样品和配体同为l-nibc的金纳米粒子样品)用超纯水稀释到2mg/l作为样品，然后采用悬滴法制样，具体方法为：取5μl样品滴到超薄碳膜网上，自然挥发直至水滴消失，然后在jem-2100fstem/eds型场发射高分辨透射电子显微镜上观察金团簇的形貌。
四个配体为l-nibc的金纳米粒子样品的透射电子显微镜形貌照片见图1中的b幅、e幅、h幅、k幅；三个配体为l-nibc的金团簇样品的透射电子显微镜形貌照片见图2中的b幅、e幅、h幅。
图2的照片表明l-nibc修饰的金团簇样品粒径均匀，分散性好，l-nibc修饰的金团簇的平均直径(指金核直径)分别为1.1nm、1.8nm和2.6nm，与图2中c幅、f幅、i幅结果相吻合。而相比较的配体为l-nibc的金纳米粒子样品粒径较大，其平均直径(指金核直径)分别为3.6nm、6.0nm、10.1nm、18.2nm，与图1中c幅、f幅、i幅、l幅结果相吻合。
2、紫外-可见吸收光谱
把待测粉末用超纯水溶解到浓度为10mg·l-1，在室温下测定其紫外可见吸收光谱。扫描范围为190-1100nm，样品池为光程为1cm的标准石英比色皿，参比池盛放超纯水。
结果四个配体为l-nibc的金纳米粒子样品的紫外-可见吸收光谱见图1中的a幅、d幅、g幅、j幅，粒径的统计分布对应见图1中的c幅、f幅、i幅、l幅；三个配体为l-nibc的金团簇样品的紫外-可见吸收光谱见图2中的a幅、d幅、g幅，粒径的统计分布对应见图2中的c幅、f幅、i幅。
由图1可以看出，由于表面等离子体效应，配体为l-nibc的金纳米粒子在520nm左右出现吸收峰，吸收峰的位置与粒径大小相关，其中3.6nm的紫外吸收峰在516nm处，6.0nm的紫外吸收峰在517nm处，10.1nm的紫外吸收峰在520nm处，而18.2nm的吸收峰则红移到523nm处，四个样品在560nm以上均无任何吸收峰。
图2中可以看到，实施例2三个不同粒径的配体为l-nibc的金团簇样品的紫外吸收光谱中520nm附近的表面等离子体效应吸收峰消失，而在560nm以上出现两个明显的吸收峰，吸收峰的位置随金团簇的粒径不同而略有不同。这是因为金团簇由于面心立方结构的坍塌，表现出类分子的性质，导致金团簇的态密度不再连续，产生能级分裂，等离子体共振效应消失，同时在长波方向出现新的吸收峰。由此可以判断实施例2得到的三个不同粒径的粉末样品均为配体修饰的金团簇。
3、傅里叶变换红外光谱
红外光谱在布鲁克公司生产的vertex80v型傅里叶变换红外光谱仪上采用固体粉末高真空全反射模式测定，扫描范围为4000-400cm-1，扫描64次。以实施例2中制得的l-nibc修饰的金团簇样品为例，测试样品为l-nibc修饰的三个不同粒径的金团簇的干燥粉末，对照样品为纯l-nibc粉末。结果见图3。
图3为l-nibc修饰的不同粒径的金团簇的红外光谱，对比纯的l-nibc(最上面的曲线),l-nibc修饰的不同粒径的金团簇在2500-2600cm-1之间的s-h伸缩振动均完全消失,而其他l-nibc的特征峰仍可观察到，证明l-nibc分子成功的通过金硫键锚定到金团簇表面。该图还表明配体修饰的金团簇的红外光谱与其尺寸无关。
用上述类似的方法制备其它配体y修饰的金团簇，只是溶液b的溶剂、haucl4与配体y的投料比、反应时间和nabh4加入量稍作调整，如：l-半胱氨酸、d-半胱氨酸、n-异丁酰基-l-半胱氨酸(l-nibc)、n-异丁酰基-d-半胱氨酸(d-nibc)做配体y时，选择乙酸作为溶剂；二肽cr、二肽rc、1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸做配体y时，选用水作为溶剂，等等；其余步骤类似，不再一一赘述。
本发明按上述方法制备得到一系列配体修饰的金团簇，所用的配体及制备过程的参数见表1。
表1本发明不同配体修饰金团簇的制备参数
采用上述相同的方法确认表1所列各实施例样品，图7-图11分别是配体cr、rc、1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸(缩写：cap)、gsh和d-nibc修饰的金团簇相应的紫外光谱(图7-图11中的a幅)、红外谱图(图7-图11中的b幅)、透射电镜照片(图7-图11中的c幅)和粒径分布(图7-图11中的d幅)。
结果表明：表1得到的不同配体修饰的金团簇直径均在3nm以下，紫外光谱也表现为520±20nm处的峰消失，大于560nm以上范围出现吸收峰，只是该吸收峰的位置随配体及粒径的不同而略有变化。同时，傅里叶变换红外光谱也显示配体的巯基红外吸收峰(位于图7-图11中b幅的虚线之间)消失，而其他红外特征峰均保留，说明各配体分子均成功锚定到金团簇表面，表明本发明成功获得了表1所列配体修饰的金团簇。
实施例3：体外aβ聚集动力学实验
本实施例通过体外aβ聚集动力学实验来验证配体修饰的金团簇的功能，并将其与配体修饰的金纳米粒子及单独使用配体分子时对aβ聚集动力学的影响比较，证明其功能来自于金团簇，而不是来自于配体。实验采用tht荧光标记法表征aβ(1-40)纤维化聚集动力学。
硫磺素t(thioflavint,简写：tht)是一种专门染淀粉样纤维的染料。当其与多肽或蛋白单体共同孵育时，其荧光基本不发生变化，而当其碰到具有纤维结构的淀粉样多肽或蛋白时，会立即与淀粉样多肽或蛋白发生耦合，其荧光强度会呈指数级迅速增强。正是因为这个特性，tht被广范用于监测多肽或者蛋白淀粉样变性的标记物。aβ(1-40)的纤维化过程也是一种成核控制的聚合过程，因此，通过tht荧光标记法测得的aβ(1-40)纤维的生长曲线主要分为三个阶段：起始期、增长期和平台期。起始期主要是aβ(1-40)发生构象转变形成错误折叠进而聚集成核的阶段；增长期是aβ(1-40)单体沿纤维轴向方向累加到核或者寡聚体上形成纤维并快速增长的阶段；平台期是aβ(1-40)分子全部形成了成熟的长纤维，即纤维不再生长的阶段。tht荧光标记法可以方便的监测aβ(1-40)分子的纤维化聚集的动力学过程。
1)aβ(1-40)单体的前处理
将冻干的淀粉样多肽aβ(1-40)粉末(invitrogencorp.)溶于六氟异丙醇(hfip)中得到浓度为1g/l的aβ(1-40)溶液，封口后在室温下孵育2-4小时，然后在通风橱中用高纯氮气(n2，99.9％)以适当的气流速度将六氟异丙醇吹干(大约耗时1小时左右)，最后将吹干后的aβ(1-40)溶于200μl二甲亚砜(dmso)中，密封后置于-20℃冰箱中保存备用，保存时间不得超过一周。使用前将淀粉样多肽的dmso溶液用大量的磷酸盐缓冲液(pbs，10mm，ph＝7.4)稀释至aβ(1-40)浓度为20μm，得到aβ(1-40)的pbs缓冲溶液。所有实验用的aβ(1-40)溶液均为新鲜配置，现配现用。
2)样品的制备和检测
将配体修饰的金团簇和金纳米粒子分别加入到20μm的aβ(1-40)的pbs缓冲溶液中，形成不同浓度、不同粒径的不同配体修饰的金团簇样品和相应的不同配体修饰的金纳米粒子样品。采用tht荧光标记法，在96孔板中37℃下连续孵育，用酶标仪每隔10分钟监测一次荧光强度。通过tht的荧光强度变化来表征aβ(1-40)聚集的动力学过程。
实验组采用实施例2制备的粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm的三种l-nibc修饰的金团簇，对照组采用粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的四种l-nibc修饰的金纳米粒子，以及未与金团簇或金纳米粒子结合的l-nibc分子。对每种粒径的金团簇或金纳米粒子，所用的浓度均有6个，分别是：0ppm(不含金团簇、金纳米粒子或l-nibc，用于对照)、0.1ppm、1.0ppm、5.0ppm、10.0ppm和20.0ppm，l-nibc单独使用时，所用的浓度有2个，分别是：1.0ppm、10.0ppm。
结果见图4和图5。
图4分别显示aβ(1-40)与各实验组和对照组共同孵育48h后的afm形貌图，其中，a幅为仅有aβ(1-40)单独孵育48h后的afm形貌图，b幅为aβ(1-40)与l-nibc共同孵育48h后的afm形貌图，c幅和d幅分别为aβ(1-40)与平均粒径为6.0nm和3.6nm的金纳米粒子(用l-nibc修饰)共同孵育48h后的afm形貌图，e幅为aβ(1-40)与平均粒径为1.8nm的金团簇(用l-nibc修饰)共同孵育48h后的afm形貌图。
图5中a幅为不同浓度l-nibc存在时的aβ(1-40)纤维化动力学曲线，b幅-e幅分别为不同浓度下粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的金纳米粒子存在时的aβ(1-40)纤维化动力学曲线，f幅-h幅分别为不同浓度下粒径为2.6nm、1.8nm和1.1nm的金团簇存在时的aβ(1-40)纤维化动力学曲线。图5中a幅-h幅中□代表0ppm(即无金纳米粒子和金团簇)，○代表0.1ppm，△代表1ppm，▽代表5ppm，◇代表10ppm，☆代表20ppm的金纳米粒子或金团簇与aβ(1-40)一起孵育时，aβ的纤维化动力学曲线。
从图4可以看到作为对照的a幅里面布满了aβ纤维；b幅里也布满了aβ纤维；c幅中虽然纤维有所减少，但还是能看到较长的纤维，d幅中虽然看不到长纤维，但依然存在大量的aβ短纤维。这说明，l-nibc对aβ(1-40)纤维的形成无明显影响，l-nibc修饰的小尺寸金纳米粒子的加入虽然可以延缓aβ(1-40)的纤维化进程，但无法实现完全抑制，因短纤维在更长时间后会继续生长成长纤维。图4的e幅可以看到其中既无长纤维也无短纤维，说明l-nibc修饰的金团簇能够完全抑制aβ(1-40)的纤维化进程。
图4为定性实验，图5为定量实验，图5的结果表明，l-nibc的加入对aβ(1-40)的纤维化动力学无明显影响(图5的a幅)；对金纳米粒子，当颗粒直径大于或等于10.1nm时，l-nibc修饰的金纳米粒子的加入使得aβ聚集动力学的增长期和平台期时间皆提前(当金纳米粒子的浓度为20ppm时，aβ聚集动力学的增长期提前至12h，平台期时间提前至16h)，说明此时l-nibc修饰的金纳米粒子能加速aβ的聚集(图5的b幅和c幅)；而当金纳米粒子颗粒尺寸小于或等于6.0nm(图5的d幅和e幅)时，则能延迟aβ开始聚集的时间(当l-nibc修饰金纳米粒子的浓度为20ppm时，aβ聚集动力学的增长期延迟至54h)，说明此时金纳米粒子对aβ的聚集有一定抑制作用。但从图5中看到，即使在很大浓度时(20.0ppm)l-nibc修饰的金纳米粒子的加入也无法实现完全抑制(指不出现增长期，荧光曲线完全为平)的效果。另一方面，l-nibc修饰的金纳米粒子加入后，由于tht的荧光发射峰位于515nm处，而l-nibc修饰的金纳米粒子的等离子体共振吸收峰位于520nm附近，因此此处观察到的tht荧光强度的下降是金纳米粒子的等离子体共振效应对tht荧光的部分淬灭，而不能归因于l-nibc修饰金纳米粒子对aβ(1-40)聚集的抑制作用。
图5的f幅-h幅表明所有的l-nibc修饰的金团簇均能大幅度抑制aβ的聚集(推迟增长期开始的时间，当l-nibc修饰的金团簇的浓度为5ppm时，20μm的aβ聚集动力学的增长期开始的时间即可延迟至50h之后)，而且当l-nibc修饰的金团簇的浓度达到10ppm及以上时，均能完全抑制aβ的聚集(不出现增长期，荧光曲线完全为平)。至于完全抑制所需的l-nibc修饰的金团簇最低浓度与配体的种类和金团簇直径有关，其中颗粒尺寸为1.1nm、1.8nm和2.6nm的l-nibc修饰的金团簇所需的最低浓度分别为5.0ppm，5.0ppm和10.0ppm。此外，由于l-nibc修饰的金团簇不存在等离子体共振效应，因而对tht的荧光无淬灭作用，因此，此处观察到的荧光强度的降低完全是由于l-nibc修饰的金团簇对aβ(1-40)聚集的抑制作用。图5的定量结果与图4的定性结果完全吻合。
本实验表明：当l-nibc修饰的金纳米粒子尺寸小于或等于6.0nm时，对aβ的聚集及纤维化有一定的抑制作用，但作用有限；l-nibc修饰的金团簇具有完全抑制aβ聚集及纤维化的功能，由于l-nibc分子本身不能影响aβ的聚集及纤维化(结合图4的b幅与图5的a幅)，因此，这一功能来自于金团簇，而不是作为配体的l-nibc。这为形成与aβ的聚集及纤维化相关的疾病的药物打下了基础，可归为本发明定义的含有金团簇的物质。
本实施例还对表1所列其他不同配体修饰的金团簇的功能进行了验证，例如，图12的a幅-h幅分别是cr、n-乙酰基-l-半胱氨酸(l-nac)、gsh、1-[(2s)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-l-脯氨酸(商品名：卡托普利)、d-nibc、rc、l-半胱氨酸和d-半胱氨酸修饰的金团簇(用量均为10ppm)对aβ(1-40)的聚集和纤维化的抑制作用效果图。对不同配体修饰的金团簇也观察到类似现象，并能做出相同的结论：这些配体本身不能影响aβ的聚集及纤维化，配体修饰的尺寸大于3nm的金纳米粒子对aβ的聚集及纤维化抑制作用有限，更大的金纳米粒子甚至对aβ的聚集及纤维化有促进作用；而配体修饰的金团簇对aβ聚集及纤维化具有优异的抑制作用，当浓度达到5-10ppm以上时，则可实现完全的抑制效果，完全抑制所需的最低浓度根据配体的不同和金团簇颗粒尺寸的不同而略有差别。这些配体修饰的金团簇同样归为本发明定义的含金团簇的物质。
实施例4：aβ诱导的ad细胞模型实验
本实施例实验以细胞存活率为指标，通过cck-8法检测的结果，反映配体修饰的金团簇或金纳米粒子样品对抗aβ(1-40)的毒性作用的效果，以说明配体修饰的金团簇或金纳米粒子在淀粉样蛋白错误折叠致病机制中是否具有神经保护效果。实验所用的细胞为sh-sy5y神经母瘤细胞株，aβ诱导的ad细胞模型的构建根据文献(r.liu,h.barkhordarian,s.emadi,c.b.park,m.r.sierks,neurobiologyofdisease2005,20,74)中的描述进行。具体方法为：
1)取对数生长期的sh-sy5y细胞(细胞传至第六代)，用完全培养基(mem培养基+10％fbs+1％青霉素-链霉素)稀释成密度为5×104/ml的细胞悬液，每孔200μl接种于96孔板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。待细胞贴壁后，加入样品。
2)加入由维持培养基(mem培养基+2％fbs+1％青霉素-链霉素)配制的不同粒径、浓度分别为0.04ppm、0.4ppm、4ppm、20ppm、40ppm和80ppm的配体修饰的金团簇样品或配体修饰的金纳米粒子样品100μl。在培养箱孵育2h后，加入浓度为80μm的aβ(1-40)100μl，置培养箱中孵育24h。这样，配体修饰的金团簇或配体修饰的金纳米粒子的终浓度分别为0.01ppm、0.1ppm、1ppm、5ppm、10ppm和20ppm，而aβ(1-40)的终浓度为20μm。同时设置不含sh-sy5y细胞的空白对照组、含有sh-sy5y细胞但不添加配体修饰的金团簇或配体修饰的金纳米粒子及aβ(1-40)的阴性对照组、含有sh-sy5y细胞的只加入aβ(1-40)(终浓度为20μm)的细胞模型对照组，以及含有sh-sy5y细胞、aβ(1-40)(终浓度为20μm)和l-nibc(终浓度为20ppm)的配体对照组。去除培养液，每孔加入100μl含10％cck-8的维持培养基孵育4h，于450nm波长处测定各孔吸光度值，用来反映配体修饰的金团簇对aβ(1-40)损伤的预保护及治疗作用。
以实施例2的l-nibc修饰的金团簇为例，以l-nibc修饰的金纳米粒子作为对比，结果见图6。
图6中a幅-c幅分别表示在不同浓度下粒径为1.1nm、1.8nm、2.6nm的l-nibc修饰的金团簇对aβ诱导的ad细胞模型中细胞存活率的影响；d幅-f幅分别表示在不同浓度下粒径为3.6nm、6.0nm、10.1nm的l-nibc修饰的金纳米粒子对aβ诱导的ad细胞模型中细胞存活率的影响。
由图6可知，单独l-nibc的加入对细胞的存活率无任何改善作用。l-nibc修饰的不同尺寸的金团簇(平均尺寸分别为1.1、1.8和2.6nm)在用量很低(如0.1-1ppm)的情况下，即可使aβ诱导的ad细胞模型的细胞存活率从接近60％提高至接近95％以上(p均小于0.05，图6中的a幅-c幅)。l-nibc修饰的平均直径3.6nm的金纳米粒子随着所用浓度的增加对ad细胞模型的细胞存活率有所提高(图6中的d幅)，但均不明显(p>0.05)。而平均直径为6.0nm和10.1nm的l-nibc修饰的金纳米粒子对细胞存活率均无作用(图6中的e幅、f幅)。以上结果说明，l-nibc修饰的金团簇对aβ诱导的ad细胞模型有显著的药效，而l-nibc修饰的金纳米粒子无明显的药效。
本实施例还对表1所列其它配体修饰的不同尺寸的金团簇进行了实验，结果也均可使aβ诱导的ad细胞模型的细胞存活率显著提高。说明至少在细胞模型层面，不同配体修饰的金团簇对阿兹海默病均具有优异的治疗效果，可归为本发明定义的含有金团簇的物质，并用于阿兹海默病治疗。
实施例5：ad转基因小鼠模型实验
实验一：
1)分别称取1.0g表1所列的配体修饰的金团簇，溶于100ml水中，作为母液放于4℃环境中冷藏备用，每次使用前取少量用水稀释后使用。
2)取180只b6/j-tg(appswe,psen1de9)85dbo/mmnju品系的转基因小鼠(购自南京大学模式动物研究所)，随机分成三组，每组60只：对照组、低剂量给药组和高剂量给药组。从小鼠100日龄时，对照组每日正常喂养，低剂量给药组每日一次口服灌胃200μl浓度为0.5g/l的金团簇水溶液，高剂量给药组每日口服灌胃200μl浓度为2g/l的金团簇水溶液。
3)将对照组、低剂量给药组和高剂量给药组小鼠分别随机分为7批：分别在鼠龄为140天、160天、180天、200天、230天、260天和290天时，采用迷宫实验、开放场实验以及新物体识别实验等研究小鼠的学习和记忆行为的变化。其中，前4批实验每组6只，后3批实验每组6-8只(考虑到小鼠饲养过程中有一定死亡率，以下同)。
4)以上每批小鼠开展行为学研究后，检测血液中aβ的含量：采用眼眶静脉丛采血，用血清elisa方法检测aβ及aβ聚集体的含量。
5)以上每批小鼠检测血液中aβ的含量后，检测海马区aβ淀粉样沉积分布：眼球采血后麻醉，经心灌流固定，取全脑，蔗糖梯度沉降，冰冻切片，用免疫组化法检测海马区aβ淀粉样沉积的分布。
结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇能显著改善ad转基因小鼠的认知行为，抑制其脑内老年斑形成，抑制其病情的发展，可作为含有金团簇的物质用于对抗阿兹海默病。
实验二：
1.分别称取1.0g表1所列的配体修饰的金团簇，溶于100ml水中，作为母液放于4℃环境中冷藏备用，每次使用前取少量用水稀释后形成金团簇溶液使用，每两周配制一次母液。
2.取90只b6/j-tg(appswe,psen1de9)85dbo/mmnju品系的转基因小鼠(购自南京大学模式动物研究所)，随机分成三组：模型对照组、低剂量给药组和高剂量给药组，每组30只(考虑到该品系转基因小鼠饲养过程中约有30％的死亡率，为保证后期实验时有足够的小鼠，因此最初小鼠的个数多于后期实验的小鼠个数)。从小鼠100日龄时，模型对照组每日正常喂养，低剂量给药组和高剂量给药组采用腹腔静脉注射方式根据小鼠体重按5mg/kg体重和20mg/kg体重的剂量分别给予金团簇溶液，每两日给药一次。
3.利用水迷宫实验测试小鼠的认知行为学。morris水迷宫实验是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的实验，主要用于测试实验动物对空间位置和方向感知的学习记忆能力，被广泛应用于评价阿兹海默病药物开发及评价研究中，其中小鼠寻台潜伏期越短以及撤台后穿越平台次数越多，在目标象限线游泳路程及目标象限停留时间越长则表明小鼠对空间位置和方向感的记忆能力越好。模型小鼠给药150天后采用morris水迷宫实验测试小鼠的行为学，实验方法参照文献(c.v.vorhees,m.t.williams,natureprotocols2006,1,848)。具体如下：
(1)定位航行实验：morris水迷宫测试系统由圆形水池和自动录像及分析系统两部分组成，水池上方有摄像机与计算机连接(如图13)。水迷宫由直径为120cm，高60cm的圆形水池以及直径为9cm的站台构成，液面高出站台0.5cm，水位维持在22±0.5℃。使用白色色素将水染为乳白色。定位航行实验用于测量小鼠在水迷宫中的学习和记忆能力，历时4天。如图13所示，将水迷宫按东(e)西(w)南(s)北(n)四个方向十字交叉划分为4个象限。平台放置在sw象限中部，整个实验过程中平台位置固定不变。训练时，每天从不同象限1/2弧度处将小鼠头朝向池壁，靠近外壁轻轻放入水中。通过摄像跟踪系统记录小鼠爬到隐藏平台上的时间(寻台潜伏期)或到达60s时即停止实验。小鼠在平台上后让其在平台上停留30s，倘若小鼠60s内未找到平台(此时寻台潜伏期计为60s)，则实验者引导小鼠爬上平台，并让其停留30s。每只小鼠试验后移开并轻轻擦干。每只动物每天训练4次，训练之间间隔15-20min，连续训练4天。
(2)空间探索实验：第4天训练完毕后，第5天移走平台，将小鼠由ne弧的中点(平台最远端点)面朝池壁轻轻放入水中，用摄像机记录小鼠60s内的运动轨迹，软件分析小鼠的穿台次数,目标象限停留时间和目标象限游泳路程。
4.免疫组织化学实验检测鼠海马区和脑皮质aβ(1-40)和aβ(1-42)的淀粉样沉积分布。大脑皮质和海马出现aβ在神经元外病理性沉积是ad的主要病理特征。其中，aβ(1-40)和aβ(1-42)是脑内老年斑的重要组成成分，具有神经毒性，可导致进行性认知功能障碍和记忆力减退。本实验采用免疫组织化学法检测了海马区及脑皮质内aβ(1-40)和aβ(1-42)斑块形成的变化。
具体方法如下：小鼠连续给药100天和150天后，每组取10-12只小鼠做海马及脑皮质免疫组织化学检测，其中给药第150天后的小鼠为做完水迷宫实验的小鼠。小鼠采用5％水合氯醛(10μl/g)腹腔注射麻醉后，在实验台上固定四肢，开胸，充分暴露心脏。注意开胸过程中不能剪到肝脏。经左心室先以0.1mol/l的pbs缓冲液50ml冲洗5min以除去血液，再用含4％多聚甲醛的0.1mol/l的pbs缓冲液灌注固定6min。灌注固定完毕取脑，置于4％多聚甲醛中4℃后固定过夜。将组织依次用10％、20％和30％的蔗糖溶液梯度脱水后-80℃保存备用。将组织进行石蜡包块参考小鼠脑图谱，中脑海马和脑皮质切片(厚度8μm)，用于免疫组化染色。其步骤如下：冰冻切片8μm，室温放置30min后，4℃丙酮固定20min，pbs洗3次(每次5min)，然后用3％过氧化氢孵育10min，消除内在过氧化物酶活性。pbs洗3次(每次5min)后用10％正常山羊血清室温封闭40min(用于做aβ(1-42)免疫组化的切片在封闭前用10％蚁酸孵育10min修复抗原活性)。倾去血清，滴加抗aβ(1-40)(ab20068，1:20稀释)或抗aβ(1-42)工作液体(ab12267，1:200稀释)，室温孵育2h。pbs洗3次(每次5min)。滴加辣根酶标记链霉卵白素(pbs稀释)的二抗工作液，室温孵育1h。pbs洗3次(每次5min)后硫酸镍胺加强dab蓝色反应法显色10min，当阳性产物呈深蓝色而背底清晰时用蒸馏水冲洗3次终止显色。后用苏木素复染1min，自来水冲洗干净后于通风处晾干，用中性树胶封片。共聚焦显微镜下观察并计数整个海马区域和脑皮质区域aβ斑块的数量，每个样本分左右脑室，2张切片做平行实验，取平均值做统计分析。所有数据采用spss软件(spss21)处理，采用t检验或单因素方差分析，p<0.05表示差异有统计学意义。
以实施例2中l-nibc修饰的平均尺寸为1.8nm的金团簇为例，给药150天后的水迷宫实验结果如图14所示。结果表明，在定位航行试验训练的第1-2天，模型对照组小鼠与高、低剂量给药组小鼠的寻台潜伏期无统计学差异(p>0.05，n＝10-12/组)(图14的a幅)。随着训练时间延长，高剂量给药组小鼠在第3天和第4天寻台潜伏期明显低于模型组小鼠(p<0.01和p<0.05)，低剂量给药组小鼠寻台潜伏期虽低于模型组小鼠但无统计学差异(p>0.05，见图14的a幅)。小鼠定位航行实验结束后，撤掉平台进行空间搜索实验。结果发现，高剂量给药组的小鼠穿台次数和目标象限的游泳路程相对于模型对照组显著提高(p均小于0.05)，在目标象限的停留时间也显著增加(p＝0.05)。而低剂量给药组小鼠的穿台次数、目标象限游泳路程和目标象限停留时间相对于模型对照组虽也有提升，但结果无显著性(p>0.05)(图14的b-d幅)。以上结果表明金团簇给药150天可显著提高了app/ps1小鼠对空间位置和方向感的学习和记忆能力，并且该作用呈剂量依赖性。
免疫组织化学实验检测鼠海马区和脑皮质aβ(1-40)和aβ(1-42)的淀粉样沉积分布的实验结果如图15-图18所示。
图15的a幅、b幅和c幅分别是给药100天时高剂量给药组、低剂量给药组和模型对照组的aβ(1-40)的海马区及脑皮质的典型免疫组织化学切片结果，图15的d幅是统计结果。实验结果表明，与模型对照组比较，给药100天时，高剂量给药能显著降模型小鼠海马区内aβ(1-40)斑块形成(44.6±12.2％，p<0.05)，而对脑皮质内aβ(1-40)斑块形成无显著影响(p>0.05)。低剂量给药对海马区及脑皮质内aβ(1-40)斑块形成均无显著影响(p>0.05)。图16是则是相应的aβ(1-42)的结果，结果表明，高剂量给药能显著降低脑皮质aβ(1-42)斑块形成(减少了61.5±11.4％，p<0.05)，而未显著性降低海马区内aβ(1-42)斑块形成(p>0.05)。低剂量给药对海马区及脑皮质aβ(1-42)斑块形成均无显著影响(p>0.05)。这些结果说明，给药100天时，金团簇对aβ(1-40)和aβ(1-42)斑块的形成均已表现出显著抑制作用，且这一作用呈明显的剂量依赖关系。
随着给药时间延长，小鼠年龄增加，相比给药100天的模型对照组小鼠，给药150天时模型对照组小鼠海马区及大脑皮质内aβ(1-40)和aβ(1-42)斑块的形成显著增多，分别为aβ(1-40)海马区增加57.2±7.2％(p<0.05)，脑皮质增加49.1±19.6％(p<0.05)，aβ(1-42)海马区增加74.4±7.0％(p<0.05)，脑皮质增加65±11.1％(p<0.05)，表明模型小鼠随着年龄增加，记忆及认知功能受到的影响可能越大。图17的a幅、b幅和c幅分别是给药150天时高剂量给药组、低剂量给药组和模型对照组的aβ(1-40)的海马区及脑皮质的典型免疫组织化学切片结果，图17的d幅是统计结果。结果表明，高剂量给药组小鼠海马区和脑皮质区内aβ(1-40)均明显减少(海马区减少59.0±11.1％，p<0.05；脑皮质减少36.4±4.5％，p<0.05)，而低剂量给药对小鼠海马区aβ(1-40)斑块形成无显著影响(p>0.05)，而显著性降低了脑皮质内aβ(1-40)斑块量(降低26.9±2.1％，p<0.05)。这表明金团簇对150天时aβ(1-40)斑块的形成有显著抑制作用，且这一作用也呈现剂量依赖关系。另外，通过spss软件分析aβ(1-40)斑块数量与150天水迷宫实验中的小鼠穿台次数的相关性时发现，海马及皮质区域内aβ(1-40)斑块的量均与小鼠平台穿越次数呈显著负相关(海马区：r＝-0.848，p<0.01；脑皮质：r＝-0.802,p<0.05)。该结果进一步支持金团簇给药所致海马和脑皮质区域内aβ(1-40)斑块减少与金团簇给药提高小鼠记忆和学习能力存在相关性。
图18则是相应的给药150天的aβ(1-42)的结果。结果表明，金团簇高剂量给药明显抑制了小鼠海马区及脑皮质内aβ(1-42)斑块的形成(海马区降低51.1±6.7％，p<0.05；脑皮质降低62.8±4.6％，p<0.05)。低剂量给药对小鼠海马区及脑皮质内aβ(1-42)斑块形成无明显影响(p>0.05)。这表明金团簇对150天时aβ(1-42)斑块的形成有显著抑制作用，且这一作用也呈现剂量依赖关系。spss相关性统计分析发现海马及皮质内aβ(1-42)斑块数量与小鼠穿台次数也均呈显著负相关(海马区：r＝-0.794，p<0.05；脑皮质：r＝-0.802，p<0.05)。这也进一步支持了金团簇给药所致海马和脑皮质区域内aβ(1-42)斑块减少与金团簇给药提高小鼠记忆和学习能力的相关性。
综上所述，金团簇对显著改善ad模型小鼠的认知行为能力，对小鼠海马区及脑皮质内aβ(1-40)和aβ(1-42)斑块的形成均有显著抑制作用，从而抑制患病小鼠病情的发展，可作为含有金团簇的物质用于ad的预防与治疗。
表1所列的其它不同配体修饰的金团簇也有相似作用，在此不一一赘述。
实施例6：生物安全性评价
1、采用sh-sy5y细胞株评价细胞层面含金团簇的物质的生物安全性。
具体方法如下：收集细胞繁殖处于对数期的sh-sy5y细胞(细胞传至第六代)，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μl，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，将细胞培育板(96孔平底板边缘孔用细胞培养液填充)置于细胞培育箱中，在5％co2，37℃环境中孵育24h让细胞贴壁。将96孔板取出，酒精消毒后置于生物安全柜内，吸出原细胞培养液，分别加入用细胞培养液稀释至1ppm、10ppm、50ppm，100ppm、200ppm、500ppm的表1所列的配体修饰的金团簇溶液，对照组(无金团簇)加入等量的新鲜细胞培养液，然后放入细胞培育箱中继续孵育48h,实验组和对照组每组均设6个复孔。培养48h后，离心除去培养液，用pbs冲洗2-3遍后，在每孔加入100μl新鲜培养液和20μl噻唑蓝(mtt)溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h后终止培养，取出96孔板，离心(1000r/min)10min，吸出上清液，每孔加入200μldmso，置于摇床上低速振荡10min至孔内颜色均匀使结晶物充分溶解；用酶标仪测量在490nm处各孔的吸光值。以上操作都必须在无菌环境中执行，所有步骤除检测外均在生物安全柜内完成，实验用品在使用前必须用高温蒸汽灭菌锅消毒处理。
以实施例2的l-nibc修饰的金团簇为例，结果见图19，其中a幅-c幅分别是粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm，终浓度分别为1ppm、10ppm、50ppm，100ppm、200ppm、500ppm的金团簇对sh-sy5y细胞存活率的影响。可以看到，在相当高的浓度(如100ppm)下，l-nibc修饰的金团簇的加入对细胞存活率几乎无影响，在更高浓度(如200和500ppm)下，l-nibc修饰的金团簇的加入会造成较小程度的细胞损伤(细胞死亡率小于20％)。由于100ppm已远大于药物的起效浓度(0.1～1ppm或更低)，因此，可以认为l-nibc修饰的金团簇在细胞层面具有很高的安全性。
表1所列的其它配体修饰的不同尺寸的金团簇也有相似的效果，在此不一一赘述。
2、采用小鼠急性毒性实验评价含金团簇的物质的急性毒性。
具体方法如下：对于表1所列的不同配体修饰的的金团簇(以实施例2中l-nibc修饰的平均直径为1.8nm的金团簇为例)，取60只成年小鼠，分成四组，每组15只，分别为对照组及三个实验组。其中对照组正常喂养，而三个实验组在正常饮食的情况下，按每天0.1g/kg体重、0.3g/kg体重和1g/kg体重的量采用口服灌胃的方法喂食金团簇，持续一星期。停止喂食金团簇后再继续正常饲养30天。观察小鼠的异常反应。
在小鼠实验中，三种不同浓度的不同尺寸的金团簇摄入对小鼠的存活及活动性均无影响。即使是1g/kg体重的高剂量摄入，小鼠依然保持健康。
表1所列的其它不同配体修饰的金团簇也有类似结果，在此不一一赘述。从以上结果可以得到结论，金团簇是非常安全的。
实施例7：含金团簇的物质在小鼠体内组织分布及代谢分布
实验一：
操作步骤：80只小鼠随机分成四组，每组20只，采用口服灌胃的方式喂食表1所列的配体修饰的金团簇，每组金团簇喂食的量分别是100mg/kg、20mg/kg、5mg/kg和1mg/kg。喂食金团簇后再将每组的20小鼠随机分成4组，每组5只，分别按喂食后2h、6h、24h和48h的时间点处死小鼠，分离心、肝、脾、肺、肾和脑组织。将各组织称重，然后加入2ml水进行组织匀浆，匀浆后加入2ml王水涡旋混匀，再放在振荡器上振荡72h后，加入2wt％的稀硝酸溶液定容到10ml，15000rpm离心15min。吸取上清液4ml，用原子吸收光谱法测定组织液中金元素的含量。
结果表明金团簇可通过血脑屏障到达大脑，并随着时间的延长能排出体外因而在体内无明显蓄积，因此，本发明提供的含有金团簇的物质在制备治疗ad的应用中有良好前景。
实验二：
操作步骤：80只小鼠随机分成四组，每组20只，采用腹腔静脉注射的方式对小鼠给予表1所列的配体修饰的金团簇，每组金团簇(以l-nibc修饰的平均直径为1.8nm的金团簇为例)的用量相对于小鼠的体重分别是100ppm、20mgppm、5ppm和1ppm。注射金团簇后再将每组的20小鼠随机分成4组，每组5只，分别按喂食后2h、6h、24h和48h的时间点处死小鼠，分离心、肝、脾、肺、肾和脑组织。将各组织称重，然后加入2ml水进行组织匀浆，匀浆后加入2ml王水涡旋混匀，再放在振荡器上振荡24h后，加入2wt％的稀硝酸溶液定容到5ml，15000rpm离心15min。吸取上清液1ml，用原子吸收光谱法的石墨炉法测定组织液中金元素的含量。
针对表1所列的其它不同配体的金团簇均采用上述实验步骤开展实验。
结果表明2h后，大脑中的金元素含量达到初始给药浓度的1％-10％，6h后，脑内含量能维持在相似的水平，24h后其脑内含量显著下降，48h时除100ppm给药量的样本外，均降低至检测限附近或以下。以上结果说明，含金团簇的物质在动物层面也具有良好的生物安全性，能穿透血脑屏障，并在体内无明显蓄积。
综上所述，以上实验结果说明了以下几点(以下提及的“金纳米粒子”和“金团簇”均指有配体修饰)：
(1)在抑制aβ聚集的体外实验(实施例3)中，发现金纳米粒子对aβ聚集动力学的影响与尺寸相关。当颗粒直径大于或等于10.1nm时，金纳米粒子的加入能加速aβ的聚集，而当粒子尺寸小于或等于6.0nm时，则对aβ的聚集有抑制作用，但无法实现aβ聚集的完全抑制。但当所用的为金团簇(平均直径小于3nm)时，所有的金团簇均能在体外大幅度抑制aβ的聚集，而且这一作用与金团簇的浓度有关。当金团簇的浓度达到5-10ppm时，就能完全抑制aβ的聚集，完全抑制所需的最低浓度与配体的种类和金团簇直径有关。当金团簇的浓度达到5-10ppm时，就能完全抑制aβ的聚集。
(2)在aβ诱导的细胞ad模型实验中(实施例4)，发现当采用小尺寸的金纳米粒子(如平均直径3.6nm或6.0nm的金纳米粒子)时，对aβ诱导的细胞ad模型细胞存活率的提升均无显著作用，说明金纳米粒子在细胞层面对ad未表现出明显药效，因而不能直接作为有效成分用于制备治疗ad的药物。然而，对本发明所用的各种不同配体修饰的不同尺寸的金团簇(平均直径均小于3nm)，发现在金团簇用量很低(如0.1-1ppm)的情况下，可使模型细胞存活率从50％-65％提高至95％以上。说明细胞层面，金团簇的药效显著。由于所用的配体本身均对aβ的聚集及细胞模型均无作用(实施例4)，因此，可以推出金团簇的药效来自于其自身的结论，这为金团簇的应用提出了新的思路。
(3)进一步地，本发明采用了ad的转基因小鼠模型(实施例5)进一步验证金团簇的药效，说明所用的金团簇对改善小鼠认知行为能力、运动行为能力、抑制脑内老年斑的形成均有显著作用，能作为相关疾病的预防或治疗药物。
(4)进一步评价生物安全性的实验中(实施例6)，金团簇在100ppm重量百分比浓度下与神经细胞共同培养时对细胞的存活率无明显影响，超过100ppm(远大于药物起效的浓度)时，细胞存活率略有下降。由于金团簇的起效浓度(0.1-1ppm)远低于100ppm，因此，可以认为金团簇在细胞层面具有优异的生物安全性。而在小鼠急性毒性实验中，采用每天一次1g/kg体重(相当于1000ppm)给药量连续服用七天，小鼠未表现出不良反应。在小鼠体内分布及药代动力学实验(实施例7)中，2h后，大脑中的金元素含量达到初始给药浓度的1％-10％，6h后，脑内含量能维持在相似的水平，24h后其脑内含量有显著下降，48h时除100ppm给药量的样本外，均降低至检测限以下。以上结果说明，含金团簇的物质在动物层面也具有良好的生物安全性，能穿透血脑屏障，并在体内无明显蓄积。以上结果说明，含金团簇的物质在动物层面也具有良好的生物安全性，能穿透血脑屏障，并在体内无明显蓄积，因此在制备治疗ad的药物的应用中有良好前景。
(5)相对于现有技术，本发明所用的配体并非针对aβ及其聚集行为特殊设计，且对比实验表明所用的配体对aβ的聚集无明显作用(实施例3)，但由于金团簇的尺寸小于aβ蛋白本身的尺寸，因此可通过尺度效应与弱分子间相互作用的结合大幅度抑制aβ的聚集。aβ诱导的ad细胞模型与转基因动物模型中的优异效果更验证了含金团簇的物质应用于制备治疗ad的药物中的可行性。因此，可以推测，含金团簇的物质除影响蛋白纤维化外，还能在更深的层面影响神经退行性疾病的进程，这将对神经退行性疾病的新药研发有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。