一种基于METTL3的小干扰RNA及其药物和应用的制作方法

本发明涉及基因工程
技术领域：
，尤其涉及一种基于mettl3的小干扰rna及其药物和应用，具体为以特异靶序列mettl3为基础的小干扰rna及相关药物和应用。
背景技术：
：炎症反应是临床上非常常见的一种病理反应，他是指具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。炎症往往表现为红、肿、热、痛和功能障碍，也伴有发热、末梢血白细胞计数改变等全身反应。然而，人们的研究发现炎症的过度活化跟多种疾病的发生，发展息息相关。例如炎症的过度活化会引发癌症，阿尔兹海默症，以及动脉粥样硬化等严重威胁人类健康的疾病。越来越多的实验证据表明炎症的发生跟nf-κb信号通路的活化有着密切的关系，nf-κb信号通路的活性会激活其下游很多致炎因子的表达，从而进一步推动炎症反应的发生。近年来研究发现nf-κb在炎症性基本如类风湿性关节炎、炎性手腕疾病和哮喘，危重疾病如肺炎、ards等，还有肿瘤的发生、发展过程起着重要的作用。nf-κb信号通路的调控机制，能够改善病情和提高预后，甚至将为治疗这些疾病提供新的分子生物学手段。nf-κb是促炎症基因表达的枢纽之一，很多炎症介质基因的启动子和增强子存在一个或多个κb序列，如tnfα、il-1、il-2、il-6、il-8、gcsf、gm-csf、icam-1、vcam-1、elam-1等。nf-κb活化后参与这些基因的表达，而这些介质在一些疾病的发病中起着重要的作用。nf-κb抗凋亡、促细胞增殖和免疫激活功能是导致正常细胞恶变的潜在因素。rna干扰(rnainterference,rnai)技术是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-strandedrna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象，rna分子通过破坏特定的mrna，以抑制某种基因表达的生物学过程。它是一种在动植物种广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程，是生物基因组抵抗病毒之类的外来遗传原件入侵的一种生物保护机制。由于使用rnai技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术迅速成为基因功能研究和基因治疗研究领域最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。因此，探寻能够抑制炎症反应特别针对nf-κb信号通路的有效分子药物靶点，将对于这些疾病的治疗带来新的希望。技术实现要素：本发明提供一种基于mettl3的小干扰rna及其药物和应用，本发明小干扰rna及其药物可以作为一个抑制炎症的有效抑制剂用于治疗炎症引发的相关疾病。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种抑制炎症的药物，所述药物是以mettl3作为靶基因。本发明中，所述mettl3是一个甲基转移酶，它可以通过对腺苷酸进行甲基化修饰来调控rna的稳定性，从而影响rna的稳定性或蛋白翻译水平。第二方面，本发明提供一种用于调控nf-κb信号通路的药物，所述药物是以mettl3作为靶基因。本发明中，发明人通过大量的实验发现，所述mettl3可以作为一个调控炎症反应的关键蛋白，通过将mettl3当作靶基因制备药物，可以用于调控炎症反应，所述药物可以是根据mettl3为靶基因制备的抑制剂、沉默子或小干扰rna等药物，本领域技术人员可以根据mettl3为靶基因进行设计。第三方面，本发明提供一种小干扰rna，所述小干扰rna是根据mettl3的mrna序列进行设计。所述mettl3的mrna序列(seqidno.4)如下：aaatgacttttctgtcttgctcagctccaggggtcattttccggttagccttcggggtgtccgcgtgagaattggctatatcctggagcgagtgctgggaggtgctagtccgccgcgccttattcgagaggtgtcagggctgggagactaggatgtcggacacgtggagctctatccaggcccacaagaagcagctggactctctgcgggagaggctgcagcggaggcggaagcaggactcggggcacttggatctacggaatccagaggcagcattgtctccaaccttccgtagtgacagcccagtgcctactgcacccacctctggtggccctaagcccagcacagcttcagcagttcctgaattagctacagatcctgagttagagaagaagttgctacaccacctctctgatctggccttaacattgcccactgatgctgtgtccatctgtcttgccatctccacgccagatgctcctgccactcaagatggggtagaaagcctcctgcagaagtttgcagctcaggagttgattgaggtaaagcgaggtctcctacaagatgatgcacatcctactcttgtaacctatgctgaccattccaagctctctgccatgatgggtgctgtggcagaaaagaagggccctggggaggtagcagggactgtcacagggcagaagcggcgtgcagaacaggactcgactacagtagctgcctttgccagttcgttagtctctggtctgaactcttcagcatcggaaccagcaaaggagccagccaagaaatcaaggaaacatgctgcctcagatgttgatctggagatagagagccttctgaaccaacagtccactaaggaacaacagagcaagaaggtcagtcaggagatcctagagctattaaatactacaacagccaaggaacaatccattgttgaaaaatttcgctctcgaggtcgggcccaagtgcaagaattctgtgactatggaaccaaggaggagtgcatgaaagccagtgatgctgatcgaccctgtcgcaagctgcacttcagacgaattatcaataaacacactgatgagtctttaggtgactgctctttccttaatacatgtttccacatggatacctgcaagtatgttcactatgaaattgatgcttgcatggattctgaggcccctggcagcaaagaccacacgccaagccaggagcttgctcttacacagagtgtcggaggtgattccagtgcagaccgactcttcccacctcagtggatctgttgtgatatccgctacctggacgtcagtatcttgggcaagtttgcagttgtgatggctgacccaccctgggatattcacatggaactgccctatgggaccctgacagatgatgagatgcgcaggctcaacatacccgtactacaggatgatggctttctcttcctctgggtcacaggcagggccatggagttggggagagaatgtctaaacctctgggggtatgaacgggtagatgaaattatttgggtgaagacaaatcaactgcaacgcatcattcggacaggccgtacaggtcactggttgaaccatgggaaggaacactgcttggttggtgtcaaaggaaatccccaaggcttcaaccagggtctggattgtgatgtgatcgtagctgaggttcgttccaccagtcataaaccagatgaaatctatggcatgattgaaagactatctcctggcactcgcaagattgagttatttggacgaccacacaatgtgcaacccaactggatcacccttggaaaccaactggatgggatccacctactagacccagatgtggttgcacggttcaagcaaaggtacccagatggtatcatctctaaacctaagaatttatagaagcacttccttacagagctaagaatccatagccatggctctgtaagctaaacctgaagagtgatatttgtacaatagctttcttctttatttaaataaacatttgtattgtagttgggattctgaaaaaaaaaaaaaaaaaa.本发明中，通过根据mettl3基因序列进行设计小干扰rna，所述具体的靶序列可以根据mettl3基因选择其中一段长度为18-25nt的序列，本发明优选采用其中一段21nt的序列，所述小干扰rna作用于mettl3的靶序列如seqidno.1所示，所述seqidno.1所示的核酸序列如下：cgtcagtatcttgggcaagtt.根据本发明，所述小干扰rna的正义链的核酸序列如seqidno.2所示，所述小干扰rna的反义链的核酸序列如seqidno.3所示。所述seqidno.2-3所示的核苷酸序列如下：正义链(seqidno.2)：5’-cgucaguaucuugggcaaguu-3’；反义链(seqidno.3)：5’-aacuugcccaagauacugacg-3’.第四方面，本发明提供一种dna序列，编码如第三方面所述的小干扰rna的dna序列。第五方面，本发明提供一种表达载体，包含如第四方面所述的dna序列。第六方面，本发明提供如第三方面所述的小干扰rna、如第四方面所述的dna序列或如第五方面所述的表达载体用于制备调节细胞或生物体中mettl3基因表达的药物。第七方面，本发明提供如第三方面所述的小干扰rna、如第四方面所述的dna序列或如第五方面所述的表达载体用于制备调控nf-κb信号通路的药物。第八方面，本发明提供一种治疗疾病的药物，包含如第三方面所述的小干扰rna、如第四方面所述的dna序列或如第五方面所述的表达载体。根据本发明，所述疾病为肿瘤疾病和/或心血管疾病；优选地，所述肿瘤疾病选自但不限于胃癌、肝癌或肺癌中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明中的mettl3作为抑制炎症的靶标，具有调控nf-κb信号通路的功能；(2)本发明根据mettl3制备的sirna，易合成，成本低，对mettl3特异性好，可以特异性的抑制mettl3的表达，从而调控nf-κb信号通路，达到抑制炎症的效果；(3)本发明sirna和药物能够有效抑制肿瘤疾病和心血管病，对于开发新的抗肿瘤基因药物和肿瘤药物具有重要指导作用，将会取得巨大的社会效益和经济价值。附图说明图1为mettl3以及nf-κb下游所调控的基因的mrna表达水平，其中，图1(a)为荧光定量pcr检测mrna结果，图1(b)为westernblot检测蛋白的结果；图2为荧光显微镜观察的huvecs细胞上粘附的thp-1的数目，其中，图2(a)为阴性对照组sigfp的结果，图2(b)为阴性对照组sigfp用tnfα处理了1小时后的结果，图2(c)为本发明simettl3(小干扰rna)的结果，图2(d)为本发明simettl3(sirna)用tnfα处理了1小时后的结果。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1：特异性靶向mettl3基因的sirna的设计合成在公共的sirna设计网站(网址为：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/seq/search)上输入mettl3的mrna序列，按照网站指示预测可以敲低mettl3mrna表达的sirna序列。根据网站的预测结果，所述小干扰rna根据mettl3的靶序列进行设计，所述seqidno.1所示的核酸序列如下：cgtcagtatcttgggcaagtt.比对多个网站的给出的预测结果，选择在至少同时在两个网站均被预测到的的序列合成了sirna。所述sirna的正义链和反义链序列分别为：正义链(seqidno.2)：5’-cgucaguaucuugggcaaguu-3’；反义链(seqidno.3)：5’-aacuugcccaagauacugacg-3’.设置阴性对照，所述阴性对照的序列如下：sigfp正义链：gcaagcugacccugaaguuca；sigfp反义链：ugaacuucagggucagcuugc.将得到的sirna及阴性对照序列交由上海生工生物有限公司合成。实施例2：sirna转染后的mrna表达水平采用实时定量pcr(q-pcr)鉴定转染了实施例1中的sirna后的mrna表达水平，主要检测的基因包括：mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8具体方法如下：1)rna的提取(1)往六孔板中各加入500μl的trizol细胞裂解液(视细胞量而定)，用枪吹吸至不再粘稠后，吸入1.5ml的ep管中；(2)往各ep管中加100μl氯仿(trizol体积的1/5)，充分剧烈震荡后(变浑浊)静置5min，12000rpm，10min离心(离心后分三层，rna在最上层，中间层为蛋白，最下层为有机相)；(3)取上清于新的ep管中，加入等体积的异丙醇，震荡混匀，于-20℃放置10min，使rna沉淀完全，12000rpm，10min离心；(4)去上清留沉淀，加500μl75％的乙醇洗涤，12000rpm，5min离心，去上清，重复洗涤一次；(5)去上清，室温下放置5-10min晾干，加20μldepc水，室温下溶解30min。2)测rna浓度(1)取2μlrna+198uldepc水，混匀，于分光光度计中测od230、od260和od280；(2)rna浓度(单位ug/ul)计算：od260×40ng/μl×100÷1000ng/ug。3)消化dna具体20μl体系如下：(例如消化5μg)试剂用量(μl)rnsin0.4dnase110×rq缓冲液2rna5μg/rna浓度depc水补足到20放入pcr仪中，具体条件如下：(1)37℃，30min，dnase消化dna；(2)68℃，10min，使dnase失活。4)逆转录具体20μl体系：(逆转1μg)先加12μl体系，具体如下：试剂用量(μl)rna4随机引物(25μm)210×rq缓冲液2depc水6混匀后放入pcr仪，具体条如下：70℃，10min，打开复杂的rna结构；然后立即放冰上3-5min，用于结合随机引物；在以上体系中再加8μl体系，具体如下：试剂用量(μl)dntp(10mm)15×rt缓冲液4m-mlv逆转录酶0.5depc水2.5混匀后放入pcr仪中，具体条件如下：(1)30℃，10min；(2)42℃，1h；(3)70℃，15min。5)qrt-pcr将逆转完的cdna加20μldepc水，进行反应，具体qrtpcr20μl反应体系如下：试剂用量(μl)2×pcrdna聚合酶1040×缓冲液0.5上游引物(2.5μm)2下游引物(2.5μm)2模板(25ng/μl)4depc水1.5具体引物如下：具体pcr条件如下：结果如图1(a)所示，可以看出，sirna抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8的mrna表达情况明显低于sigfp抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8的mrna表达情况，可以看出，通过检测mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8基因的mrna表达情况，可见，通路nf-κb及其下游所调控的跟炎症发生相关的致炎因子的表达都被显著的抑制了。实施例3：sirna转染后鉴定蛋白表达水平采用westernblot鉴定蛋白的表达水平，具体步骤如下：(1)收集蛋白样品：将六孔板中的细胞每孔用200μl的1x蛋白上样缓冲液裂解，然后收集到1.5ml的离心管中；(2)电泳：将事先配置好的8％的聚丙烯酰胺凝胶放到电泳槽中，进行55ma大概一个小时的电泳；(3)转膜：将跑好的胶从玻璃板上取下来跟实现准备好的pvdf膜紧密贴合在一块后，用上下个六张滤纸将胶和pvdf膜夹在中间，然后放到半干转膜仪上进行大概一个小时的转膜；(4)封闭：将刚转完的pvdf膜，放到1％的脱脂奶粉中进行一个小时的封闭；(5)一抗孵育：将pvdf膜跟我们需要检测的蛋白的相应抗体进行4℃过夜的孵育；(6)二抗孵育：将一抗孵育完的膜进行洗涤之后，加入二抗进行一个小时的室温孵育；(7)显影：二抗孵育的膜经过洗涤之后，利用二抗上所带的辣根过氧化酶跟ecl反应可以化学发光的原理进行显影，观察蛋白表达水平的变化。结果如图1(b)所示，可以看出，sirna抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8蛋白表达情况明显低于sigfp抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8蛋白表达情况，可见，通路nf-κb及其下游所调控的跟炎症发生相关的致炎因子的表达都被显著的抑制了。实施例4：验证单核细胞粘附情况炎症被活化后会促使内皮细胞分泌一些相关的粘附因子从而促进单核细胞和内皮细胞之间的粘附作用，所以通过验证细胞之间的粘附作用来验证炎症的抑制，具体步骤如下：(1)将内皮细胞huvecs种到6孔板上，过夜，待密度达到80％时，利用lipofectaminetmrnaimax(invitrogen公司)转染试剂按照标准步骤将对照组sigfp和敲低mettl3的sirna分别转染到huvecs中，3小时后换成新鲜的培养基；(2)转染8小时后，对细胞进行tnfα的处理，同时将单核细胞thp-1用cmfda进行荧光基团的标记，1小时后给huvecs换成新鲜的培养基，同时用rpmi培养基洗涤thp-1细胞3次；(3)将thp-1细胞分别加入到对照组和敲低mettl3的huvecs中，放到培养箱孵育1小时；(4)用培养huvecs细胞的ecm培养基洗涤未粘附到huvecs上的thp-1细胞3次；(5)在荧光显微镜下对粘附到huvecs上的thp-1细胞进行计数。结果如图2(a)-图2(d)所示，从图中可以看出，跟对照组sigfp相比，mettl3的sirna(simettl3)抑制剂可以显著的抑制thp-1和huvecs细胞之间的粘附作用，进一步证明了simettl3对炎症反应的抑制效应。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>深圳大学<120>一种基于mettl3的小干扰rna及其药物和应用<130>2017<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>1cgtcagtatcttgggcaagtt21<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>2cgucaguaucuugggcaaguu21<210>3<211>21<212>rna<213>人工合成序列<400>3aacuugcccaagauacugacg21<210>4<211>2038<212>dna<213>人工合成序列<400>4aaatgacttttctgtcttgctcagctccaggggtcattttccggttagccttcggggtgt60ccgcgtgagaattggctatatcctggagcgagtgctgggaggtgctagtccgccgcgcct120tattcgagaggtgtcagggctgggagactaggatgtcggacacgtggagctctatccagg180cccacaagaagcagctggactctctgcgggagaggctgcagcggaggcggaagcaggact240cggggcacttggatctacggaatccagaggcagcattgtctccaaccttccgtagtgaca300gcccagtgcctactgcacccacctctggtggccctaagcccagcacagcttcagcagttc360ctgaattagctacagatcctgagttagagaagaagttgctacaccacctctctgatctgg420ccttaacattgcccactgatgctgtgtccatctgtcttgccatctccacgccagatgctc480ctgccactcaagatggggtagaaagcctcctgcagaagtttgcagctcaggagttgattg540aggtaaagcgaggtctcctacaagatgatgcacatcctactcttgtaacctatgctgacc600attccaagctctctgccatgatgggtgctgtggcagaaaagaagggccctggggaggtag660cagggactgtcacagggcagaagcggcgtgcagaacaggactcgactacagtagctgcct720ttgccagttcgttagtctctggtctgaactcttcagcatcggaaccagcaaaggagccag780ccaagaaatcaaggaaacatgctgcctcagatgttgatctggagatagagagccttctga840accaacagtccactaaggaacaacagagcaagaaggtcagtcaggagatcctagagctat900taaatactacaacagccaaggaacaatccattgttgaaaaatttcgctctcgaggtcggg960cccaagtgcaagaattctgtgactatggaaccaaggaggagtgcatgaaagccagtgatg1020ctgatcgaccctgtcgcaagctgcacttcagacgaattatcaataaacacactgatgagt1080ctttaggtgactgctctttccttaatacatgtttccacatggatacctgcaagtatgttc1140actatgaaattgatgcttgcatggattctgaggcccctggcagcaaagaccacacgccaa1200gccaggagcttgctcttacacagagtgtcggaggtgattccagtgcagaccgactcttcc1260cacctcagtggatctgttgtgatatccgctacctggacgtcagtatcttgggcaagtttg1320cagttgtgatggctgacccaccctgggatattcacatggaactgccctatgggaccctga1380cagatgatgagatgcgcaggctcaacatacccgtactacaggatgatggctttctcttcc1440tctgggtcacaggcagggccatggagttggggagagaatgtctaaacctctgggggtatg1500aacgggtagatgaaattatttgggtgaagacaaatcaactgcaacgcatcattcggacag1560gccgtacaggtcactggttgaaccatgggaaggaacactgcttggttggtgtcaaaggaa1620atccccaaggcttcaaccagggtctggattgtgatgtgatcgtagctgaggttcgttcca1680ccagtcataaaccagatgaaatctatggcatgattgaaagactatctcctggcactcgca1740agattgagttatttggacgaccacacaatgtgcaacccaactggatcacccttggaaacc1800aactggatgggatccacctactagacccagatgtggttgcacggttcaagcaaaggtacc1860cagatggtatcatctctaaacctaagaatttatagaagcacttccttacagagctaagaa1920tccatagccatggctctgtaagctaaacctgaagagtgatatttgtacaatagctttctt1980ctttatttaaataaacatttgtattgtagttgggattctgaaaaaaaaaaaaaaaaaa2038当前第1页12