一种空心MnO2复合纳米材料、其制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种空心mno2复合纳米材料、其制备方法及其应用。

背景技术：

癌症是威胁人类健康的重大恶性疾病之一。虽然从上世纪50年代起，数十年中大量的人力、物力、财力被投入到癌症的预防和治疗中，但在这方面人类所取得的进展十分有限。

在最近几年，二氧化锰(mno2)纳米结构作为肿瘤微环境(tme)-响应的治疗诊断试剂的一种引起了大量的关注。研究发现mno2纳米结构在tme中存在的h⁺或谷胱甘肽(gsh)条件下可以分解，产生的mn²⁺离子显著的增强t1的磁共振成像，可以用于肿瘤特异性的成像与检测。与此同时，mno2纳米结构在tme中过氧化氢(h2o2)的存在下分解成水和氧气，产生的氧气可以改善肿瘤的乏氧。这种作用通过研究发现可以提高多种癌症治疗的效果，例如放射治疗和光动力治疗，因为在这些治疗过程中氧气具有重要的作用。mno2纳米颗粒能够降解成水溶性的mn²⁺离子并通过肾脏迅速的排泄出体外。与许多不可降解的无机纳米材料相比，这种材料在活体应用时不会有长期的毒性。之前报道的mno2纳米结构大多是纳米颗粒、纳米片或与纳米材料结合的纳米复合物，不能实现有效的药物装载和精确控制药物的释放。

当前，已经有文献报道基于mno2的纳米复合物用于癌症的治疗，但是具有以下几方面的缺点：(1)合成的步骤较为复杂，很难进行大批量的合成。(2)合成的mno2材料的形貌不可控，不利于实验的重复。(3)合成的mno2材料大部分是与其他无机材料相复合，不利于材料代谢出体外。然而，制备一种合成方法简单、可大批量生产、重复性好、容易代谢并将该颗粒同时用于制备癌症的成像诊断和治疗制剂未曾见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种空心mno2复合纳米材料、其制备方法及其应用，该制备方法简单，重复性较好且制备的空心mno2复合纳米材料容易代谢。

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

a)将正硅酸乙酯溶解在乙醇和碱性水溶液的混合溶液中，水解，得到实心二氧化硅纳米颗粒；

b)将所述实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液和高锰酸钾溶液混合，还原反应后再刻蚀，得到空心mno2纳米颗粒；

c)将所述空心mno2纳米颗粒表面依次修饰聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层，得到空心mno2复合纳米材料。

优选地，所述步骤a)中水解的温度为40～50℃，水解的时间为1.5～2.5h。

优选地，所述步骤b)中刻蚀的温度为55～65℃；刻蚀的时间为11～13h。

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料，包括空心mno2纳米颗粒；

及在所述空心mno2纳米颗粒表面逐层修饰的聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层；

所述空心mno2纳米颗粒的比表面积为350～400m²·g^-1；粒径为150～200nm。

优选地，所述空心mno2纳米颗粒、聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层的质量比为1:4～6:4～6:4～6。

优选地，所述空心mno2复合纳米材料的平均孔径为3.5～4.5nm。

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料在制备用于治疗癌症的治疗剂中的应用；

所述空心mno2纳米材料为上述技术方案所述制备方法制备的空心mno2复合纳米材料或上述技术方案所述空心mno2复合纳米材料。

优选地，所述治疗剂中包括二氢卟酚e6和/或盐酸阿霉素。

优选地，所述二氢卟酚e6和盐酸阿霉素的装载量分别为17～89％和13～87％。

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：a)将正硅酸乙酯溶解在乙醇和碱性水溶液的混合溶液中，水解，得到实心二氧化硅纳米颗粒；b)将所述实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液和高锰酸钾溶液混合，还原反应后再刻蚀，得到空心mno2纳米颗粒；c)将所述空心mno2纳米颗粒表面依次修饰聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层，得到空心mno2复合纳米材料。该方法以实心二氧化硅球为模板，一次实验可以得到大量形貌可控的空心结构的mno2复合纳米材料，重复性好；在酸性条件下可以完全的分解，通过荧光成像和磁共振成像，证明该纳米颗粒在小鼠体内会分解产生mn²⁺离子并通过肾脏排出体外。另外，该制备方法制备的空心mno2复合纳米材料具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理环境下都具有很好的分散性，可以高效的装载药物试剂并在肿瘤部位特定的释放；能够实现可见光区的较强的荧光成像以及肿瘤部位特异性的t1磁共振成像；与anti-pd-l1联合使用之后，不仅可以对原始肿瘤进行有效的杀伤，还能明显的抑制远端肿瘤的生长。实验结果表明：该制备方法可以一次合成至少6g空心mno2复合纳米材料；tem表明其可重复实验；mno2纳米颗粒在中性或碱性条件下是稳定的，在弱酸性的环境中会分解成mn²⁺离子；二氢卟酚e6和盐酸阿霉素的装载量分别为17～89％和13～87％；注射纳米颗粒24h之后，肿瘤位置的t1磁共振信号有2倍的增强；h-mno2-peg/c&d加激光的联合治疗组在治疗结束的时候肿瘤的生长速度最慢并且体积最小，肿瘤的体积仅仅增加了2倍。

附图说明

图1为本发明实施例1中合成空心mno2纳米材料流程示意图；

图2为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料的透射电镜(tem)图；

图3为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料的高纬度环形暗场扫描的tem元素映射(hhaadf-stem)图；

图4为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料在不同溶液中的稳定性测试图；

图5为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料的孔径分布曲线与氮气吸附与脱附的等温线图；

图6为本发明实施例2中大规模合成的h-mno2-peg材料的透射电镜图；

图7为本发明实施例3制备的h-mno2-peg纳米在不同ph值下的稳定性测试图；

图8为本发明实施例4中药物在h-mno2-peg材料中的装载曲线以及在不同ph值下的释放情况；

图9为本发明实施例5中氮气或氧气环境下激光照射后，单纯的ce6或h-mno2-peg/c在4t1细胞中的光动力治疗效果图；

图10为本发明实施例6中h-mno2-peg/c&d在细胞水平联合治疗的效果图；

图11为本发明实施例7中h-mno2-peg/c&d在活体水平的荧光和t1磁共振成像；

图12为本发明实施例8中h-mno2-peg/c&d在活体水平联合治疗的效果图；

图13为本发明实施例9中h-mno2-peg/c&d与anti-pd-l1联合治疗后，对小鼠原始肿瘤以及远端肿瘤的治疗结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

a)将正硅酸乙酯溶解在乙醇和碱性水溶液的混合溶液中，水解，得到实心二氧化硅纳米颗粒；

b)将所述实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液和高锰酸钾溶液混合，还原反应后再刻蚀，得到空心mno2纳米颗粒；

c)将所述空心mno2纳米颗粒表面依次修饰聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层，得到空心mno2复合纳米材料。

本发明提供的制备方法简单，是以实心二氧化硅球为模板，一次实验可以得到大量形貌可控的空心结构的材料，具有简单的合成步骤、较好的可重复性以及较高的产率。

本发明将正硅酸乙酯溶解在乙醇和碱性水溶液的混合溶液中，水解，得到实心二氧化硅纳米颗粒。本发明优选将正硅酸乙酯滴加到所述乙醇和碱性水溶液的混合溶液中。在本发明中，所述碱性水溶液优选选自质量分数为30％的氨水。所述水解的温度优选为40～50℃，更优选为45℃；水解的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。本发明优选采用水浴加热的形式满足水解所需的温度。本发明优选将水解产物用水洗涤3次，得到实心二氧化硅纳米颗粒(ssio2)。

本发明以得到的实心二氧化硅球为模板，一次实验可以得到大量形貌可控的空心结构的材料，具有简单的合成步骤、较好的可重复性以及较高的产率。

得到实心二氧化硅纳米颗粒后，本发明将所述实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液和高锰酸钾溶液混合，还原反应后再刻蚀，得到空心mno2纳米颗粒(h-mno2材料)。

本发明将实心二氧化硅纳米颗粒分散在水中，得到实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液。本发明优选在超声的条件下将高锰酸钾溶液滴加到实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液中。还原反应的时间优选为11～13h，更优选为12h。

本发明优选将还原产物离心，得到的沉淀重新分散在水中，再在强碱性溶液中刻蚀，得到空心mno2纳米颗粒。在本发明中，所述强碱性溶液优选采用2mol/l的na2co3水溶液。所述刻蚀的温度优选为55～65℃，更优选为60℃；刻蚀的时间优选为11～13h，更优选为12h。本发明优选将空心mno2纳米颗粒用水洗涤3次。

得到空心mno2纳米颗粒后，本发明将所述空心mno2纳米颗粒表面依次修饰聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层，得到空心mno2复合纳米材料。

本发明优选将聚丙烯胺盐酸盐溶液分散在血清瓶中，所述聚丙烯胺盐酸盐溶液的质量浓度优选为4.5～5.5mg/ml，更优选为5mg/ml；所述聚丙烯胺盐酸盐的重均分子量优选为15000g/mol。

本发明优选在超声条件下在聚丙烯胺盐酸盐溶液中缓慢加入到空心mno2纳米颗粒的水溶液中；所述聚丙烯胺盐酸盐(pah)和空心mno2纳米颗粒的质量比优选为4.5～5.5:1，更优选为5:1。滴加完聚丙烯胺盐酸盐溶液后继续优选超声0.4～0.6h，然后在室温下优选搅拌5～7h。本发明优选将溶液在14800rpm下离心得到沉淀并用水洗涤三次，得到pah修饰的h-mno2材料(h-mno2-pah)，即所述聚丙烯胺盐酸盐以聚丙烯胺盐酸盐层的形式修饰在空心mno2纳米颗粒表面。

本发明将聚丙烯酸(paa)溶液分散在本领域技术人员熟知的血清瓶中；所述聚丙烯酸(paa)溶液的质量浓度优选为4.5～5.5mg/ml，更优选为5mg/ml；所述聚丙烯酸的重均分子量优选为1800g/mol。

本发明优选在超声条件下在聚丙烯酸(paa)溶液中缓慢滴加h-mno2-pah溶液；所述聚丙烯酸和h-mno2-pah的质量比优选为4.5～5.5:1，更优选为5:1。滴加完h-mno2-pah溶液后继续优选超声0.4～0.6h，然后在室温下优选搅拌5～7h。本发明优选将溶液在14800rpm下离心得到沉淀并用水洗涤三次，得到paa修饰的h-mno2-pah材料(h-mno2-paa)，即所述聚丙烯酸以聚丙烯酸层的形式复修饰在所述聚丙烯胺盐酸盐层表面。

本发明将h-mno2-pah溶液分散在血清瓶中，在超声的条件下滴加氨基化的聚乙二醇(mpeg-nh2)；所述氨基化的聚乙二醇为氨基化的支链状聚乙二醇；其重均分子量优选为5000g/mol。所述氨基化的聚乙二醇和h-mno2-pah的质量比优选为4.5～5.5:1，更优选为5:1。本发明优选将h-mno2-pah溶液与氨基化的聚乙二醇混合后的溶液采用2mol/l的na2co3溶液调节至ph值为8.0；然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)反应；所述反应优选在搅拌的条件下进行，所述反应的时间优选为11～13h，更优选为12h。反应结束后，本发明优选通过14800rpm离心分离得到h-mno2-peg并用水洗涤三次。

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料，包括空心mno2纳米颗粒；

及在所述空心mno2纳米颗粒表面逐层修饰的聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层；

所述空心mno2纳米颗粒的比表面积为350～400m²·g^-1；粒径为150～200nm。

本发明提供的空心mno2复合纳米材料包括空心mno2纳米颗粒。在本发明中，所述空心mno2纳米颗粒的比表面积为350～400m²·g^-1；粒径为150～200nm，优选为170～190nm，更优选为180nm。

本发明提供的空心mno2复合纳米材料包括修饰在所述空心mno2纳米颗粒表面的聚丙烯胺盐酸盐层。所述聚丙烯胺盐酸盐的重均分子量为15000g/mol。

本发明提供的空心mno2复合纳米材料包括修饰在所述聚丙烯胺盐酸盐层表面的聚丙烯酸层。所述聚丙烯酸的重均分子量为1800g/mol。

本发明提供的空心mno2复合纳米材料包括复修饰在所述聚丙烯酸层表面的氨基化的聚乙二醇层。所述聚乙二醇的重均分子量为5000g/mol。

在本发明中，所述空心mno2纳米颗粒、聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层的质量比优选为1:4～6:4～6:4～6，更优选为1:5:5:5。

本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料在制备用于治疗癌症的治疗剂中的应用；

所述空心mno2纳米材料为上述技术方案所述制备方法制备的空心mno2复合纳米材料或上述技术方案所述空心mno2复合纳米材料。

在本发明中，所述治疗剂优选包括二氢卟酚e6和/或盐酸阿霉素。

在本发明中，所述二氢卟酚e6和盐酸阿霉素的装载量优选分别为17～89％和13～87％。

本发明提供的空心mno2复合纳米材料具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理环境下都具有很好的分散性，可以高效的装载药物试剂并在肿瘤部位特定的释放；能够实现可见光区的较强的荧光成像以及肿瘤部位特异性的t1磁共振成像；对小鼠进行尾静脉注射，通过荧光和磁共振成像发现纳米颗粒能够在肿瘤部位有效的富集，可以催化肿瘤部位的过氧化氢，改善肿瘤的乏氧，提高光动力治疗的效果并最终实现高效的联合治疗。研究还发现该纳米颗粒可以引起小鼠一系列的免疫反应，在与anti-pd-l1联合使用之后，不仅可以对原始肿瘤进行有效的杀伤，还能明显的抑制远端肿瘤的生长；在酸性条件下可以完全的分解，通过荧光成像和磁共振成像，证明了该纳米颗粒在小鼠体内会分解产生mn²⁺离子并通过肾脏排出体外，证明该纳米颗粒在活体水平是完全可代谢的。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种空心mno2复合纳米材料、其制备方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1:制备空心mno2材料(h-mno2-peg)：

(1)将14ml乙醇，2ml水和500μl氨水(30％)混合搅拌并在45℃水浴条件下缓慢滴加100μl正硅酸乙酯反应2h，之后用水洗涤三次，得到实心的二氧化硅纳米颗粒(ssio2)。

(2)将40mg的ssio2分散在10ml的水中，在超声条件下将高锰酸钾(300mg)的水溶液逐滴滴加到溶液中，在搅拌12h之后，通过14800rpm离心获得沉淀，将沉淀用水洗涤三次并重新分散在水中。

(3)将(2)中得到的材料溶解在2mol/lna2co3的水溶液中，在60℃下反应12h，得到空心介孔的二氧化硅颗粒(h-mno2)并用水洗涤三次。

(4)将10ml聚丙烯胺盐酸盐(pah，mw＝15000)高分子溶液(5mg/ml)分散在血清瓶中，在超声条件下缓慢加入5mlh-mno2(2mg/ml)水溶液。滴加完后继续超声0.5h，然后在室温下搅拌6h。将溶液在14800rpm下离心得到沉淀并用水洗涤三次，获得pah修饰的h-mno2材料(h-mno2-pah)。

(5)将10ml聚丙烯酸(paa,mw＝1800)高分子溶液(5mg/ml)分散在血清瓶中，在超声条件下缓慢滴加5mlh-mno2-pah溶液(2mg/ml)。滴加完后继续超声0.5h，然后在室温下搅拌6h。将溶液在14800rpm下离心得到沉淀并用水洗涤三次，获得paa修饰的h-mno2-pah材料(h-mno2-paa)。

(6)将10mlh-mno2-paa溶液(5mg/ml)分散在血清瓶中，在超声条件下缓慢滴加250mg氨基化的支链状聚乙二醇(mpeg-5k-nh2，mw＝5000)，用2mol/l的na2co3将反应溶液ph值调节到8.0，加入50mg的edc并搅拌12h。反应结束后，通过14800rpm离心分离得到h-mno2-peg并用水洗涤三次。

图1为本发明实施例1制备的h-mno2-peg复合纳米材料负载二氢卟酚e6(ce6)和盐酸阿霉素(dox)的合成示意图；

图2为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料的透射电镜(tem)图；图2说明了合成的纳米颗粒形貌是球状并且是空心的结构，h-mno2-peg的尺寸为150nm，该纳米层的厚度约为15nm。

图3为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料的高纬度环形暗场扫描的tem元素映射(hhaadf-stem)图；图3进一步确认了h-mno2-peg纳米层的空心结构以及多种元素的组成。

图4为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料在不同溶液中的稳定性测试图；不同的溶液包括水、盐酸缓冲液以及细胞培养基，由图4可以看出：h-mno2-peg纳米材料在不同溶液中都能够很好的分散并且材料的粒径没有随着时间的推移而产生变化，其水合半径约为180nm。

图5为本发明实施例1制备的h-mno2-peg纳米材料的孔径分布曲线与氮气吸附与脱附的等温线图；在图5中，根据比表面积测定仪测量得到h-mno2-peg的比表面积和平均的孔径分别为360m²·g^-1和3.94nm，如此高的比表面积说明h-mno2-peg纳米颗粒是空心结构，另一方面由于材料的孔径较大，可以作为一个药物载体高效的装载药物。

实施例2：h-mno2-peg纳米颗粒大规模合成实验

为了进一步研究材料的合成产率与可重复性，设计了以下实验：

根据实施案例1中的合成步骤(1)，得到2gssio2并将其分散在300ml水中，在超声条件下将高锰酸钾(15g)的水溶液逐滴滴加到水中。搅拌12h之后，通过14800rpm离心获得沉淀，将沉淀用水洗涤三次并将其溶解在2mol/lna2co3的水溶液中，在60℃下反应12h，得到空心介孔的mno2颗粒(h-mno2)并用水洗涤三次。

图6为本发明实施例2中大规模合成的h-mno2-peg材料的透射电镜图；在图6中，根据实验结果可以发现一次合成的实验可以得到6g的材料，证明该材料可以进行大规模的合成。对该合成的材料进行tem的表征，结果发现大规模合成材料的形貌和尺寸没有发生明显的变化，表明该纳米材料可以进行大规模的合成并且具有形貌可控、高产率以及可重复性等优势。

实施例3：h-mno2-peg纳米颗粒在不同ph值下的稳定性

h-mno2-peg纳米颗粒在不同时间点与多种ph值的pbs(5.5，6.5和7.4)孵育。在特定的时间里，溶液通过紫外-可见光谱仪测量和tem表征，检验材料的降解情况。

mno2纳米颗粒在中性或碱性条件下是稳定的，但是在弱酸性的环境中会分解成mn²⁺离子。因此，本申请记录了在不同的时间里，h-mno2-peg纳米颗粒与不同ph值(7.4，5.5)的磷酸缓冲液孵育之后的tem图，见图7，图7为本发明实施例2制备的h-mno2-peg纳米在不同ph值下的稳定性测试图。图7中7a表明h-mno2-peg纳米层在ph值7.4的pbs中培养8h之后形貌没有明显的变化，证明h-mno2-peg在中性的环境中是稳定的。然而h-mno2-peg在酸性的溶液中显示随时间变化而分解，这主要是由于mno2分解成mn²⁺离子。mno2特征吸收峰在ph值为7.4下变化不大，但是在ph值为6.5和ph值为5.5条件下迅速的降低，这一结果进一步说明了h-mno2-peg超灵敏的ph响应的降解行为。

实施例4：h-mno2-peg纳米颗粒的药物装载与释放

将10ml的h-mno2-peg(0.2mg/ml)溶液与不同浓度的二氢卟酚e6(ce6)和盐酸阿霉素(dox)混合反应12h。之后14800rpm离心分离得到h-mno2-peg/c&d纳米颗粒并用水洗涤三次。

为了将h-mno2-peg应用于光动力治疗，不同浓度的光敏分子ce6可以在超声条件下与材料孵育，混合溶液在室温下搅拌12h后除去未装载上的ce6之后，通过紫外-可见光谱可以计算出ce6的装载效率。图8为实施例4中药物在h-mno2-peg材料中的装载曲线以及在不同ph值下的释放情况，在图8中(a)看出，当ce6:mno2的孵育质量比为3:1时，ce6可以达到88.9％的高装载量。另一方面，dox作为一种常见的抗癌药物也可以装载到h-mno2-peg纳米层的空心结构中。h-mno2-peg与不同浓度的dox在黑暗中混合反应12h之后，通过紫外-可见光谱可以计算出药物的装载效率。结果表明dox的装载是随着加入到反应溶液中dox的量逐渐增加，最大有效装载效率可以达到86.1％。

图8中(b)表明ce6和dox可以同时装载到h-mno2-peg纳米层的空心结构中，得到两种药物共同装载的h-mno2-peg/c&d纳米颗粒。h-mno2-peg/c&d在不同ph值的溶液中药物的释放也进行了研究。如图8中(c)，在ph值为7.4的溶液中，ce6和dox这两种药物的释放都十分的缓慢，分别为23％和21％。然而在弱酸性的ph值下(ph值为6.5和ph值为5.5)，ce6(49％和73％)和dox(62％和95％)都会快速的释放，这主要是由于h-mno2-peg纳米颗粒在酸性条件下会分解成mn²⁺离子，因此可以促进药物的释放。

实施例5：h-mno2-peg/c纳米颗粒的光动力治疗效果

在光动力治疗中，4t1小鼠乳腺癌细胞在96孔板中与不同浓度的h-mno2-peg/c或单纯的ce6培育2h之后，96孔板移动到一个透明的盒子中分别通30min的氧气和氮气。之后细胞分别在氧气和氮气的环境下，在660nm激光下照射30min。细胞之后用新鲜的培养基继续培养24h，之后用mtt检测细胞的相对活性。

图9为实施例5中氮气或氧气环境下激光照射后，单纯的ce6或h-mno2-peg/c在4t1细胞中的光动力治疗效果图；图9表明在氧气的条件下，单纯的ce6和h-mno2-peg/c对细胞都有明显的杀伤作用，存活率分别为14％和4％。作为对照，在氮气环境下，单纯ce6的光动力治疗对细胞的杀伤效果非常有限。但是h-mno2-peg/c组在氮气的乏氧条件下，也能有效的诱导细胞凋亡，这主要是由于mno2可以催化h2o2并在肿瘤细胞中原位产生额外的氧气。因此不同于传统的光动力治疗需要在正常含氧量的条件下才能发挥作用，装载了ce6的h-mno2-peg纳米颗粒甚至可以在乏氧的环境下作为有效的光动力治疗试剂。

实施例6：h-mno2-peg/c&d纳米颗粒在细胞水平的联合治疗

在细胞的联合治疗中，4t1细胞与不同浓度的h-mno2-peg/c或h-mno2-peg/c&d在96孔板中培养2h，之后不需要激光照射或在660nm的激光照射下照射30min(5mw·cm^-2)。在继续培养1h之后，细胞转移到新鲜的培养基中并在mtt测试之前继续培养24h。

图10为实施例6中h-mno2-peg/c&d在细胞水平联合治疗的效果图，图10表明，和单纯的光动力(h-mno2-peg/c加光照)或化疗(h-mno2-peg/c&d)治疗组相比，在不同的药物浓度下联合治疗组(h-mno2-peg/c&d加光照)可以更加有效的杀伤细胞，存活率为5％，表明了这两种治疗方式协同治疗的效果。

实施例7：h-mno2-peg/c&d纳米颗粒在活体的成像

活体荧光成像是通过maestro活体荧光成像系统获得。磁共振成像是通过3.0t的临床磁共振成像扫描仪收集的，它含有小动物成像的线圈。我们通过静脉注射h-mno2-peg/c&d之后(mno2＝10mg·kg^-1，ce6＝4.7mg·kg^-1和dox＝4.5mg·kg^-1)，在4t1荷瘤的balb/c小鼠模型上，通过活体荧光成像和t1磁共振成像追踪纳米颗粒在小鼠体内的分布。

图11为实施例7中h-mno2-peg/c&d在活体水平的荧光和t1磁共振成像；图11中(a)所示，ce6的荧光在肿瘤部位逐渐的增强并在8h达到最高峰，表明h-mno2-peg/c&d在肿瘤部位有效的富集。在注射24h之后，通过小鼠体外的主要器官和肿瘤成像也进一步证实了材料在肿瘤部位的有效富集(图11中(b)所示)。除此之外，在小鼠的肾脏也发现很强的ce6荧光信号，证明载体在降解之后可以通过肾脏迅速的代谢。

在静脉注射h-mno2-peg/c&d之后，4t1荷瘤小鼠的磁共振图像进行了处理。图11中(c)表明：在注射纳米颗粒24h之后，肿瘤位置的t1磁共振信号有2倍的增强。表明h-mno2-peg/c&d在肿瘤位置的有效富集，这与荧光成像的结果一致。而且成像结果发现这些小鼠的肾脏有很强的t1信号(图11中(d)和(e)所示)，相对于对照组小鼠，t1的信号值增强了6倍，表明h-mno2-peg/c&d在分解成mn²⁺离子之后会快速的通过肾脏代谢。因此荧光与磁共振成像都说明h-mno2-peg/c&d纳米载体一方面通过肿瘤增强的渗透性和高滞留性(epr)作用可以在肿瘤位置有效的被动富集，另一方面载体会逐渐的分解成离子并能快速的肾脏代谢。

实施例8：h-mno2-peg/c&d纳米颗粒在活体水平的联合治疗

4t1荷瘤小鼠分别静脉注射200μl的pbs，单纯的ce6+dox，h-mno2-peg/c，h-sio2-peg/c&d以及h-mno2-peg/c&d(mno2＝10mg·kg^-1，sio2＝25mg·kg^-1，ce6＝4.7mg·kg^-1和dox＝4.5mg·kg^-1)。激光照射组是在660nm激光照射下进行(5mw·cm^-2，1h)。每组实验是五只小鼠，肿瘤的尺寸在两个星期中隔天测量。肿瘤的体积通过下面的公式计算：宽度²×长度/2。组织和肿瘤的切片是通过标准的h&e染色并在显微镜下观察。

肿瘤的尺寸在两个星期内检测，在第十四天收集每组小鼠的肿瘤并称重。图12为实施例8中h-mno2-peg/c&d在活体水平联合治疗的效果图，图12中(a)所示，单纯药物加激光组(第二组)没有明显的抑制肿瘤的生长，相对于原始肿瘤的体积生长了11倍，说明较低剂量的单纯药物在肿瘤部位不能有效的滞留。h-mno2-peg不加激光组对肿瘤的生长也没有明显的作用(第三组)，肿瘤体积增加了10倍。h-mno2-peg/c加激光组(第四组)，或是h-mno2-peg/c&d不加激光组(第五组)，它们都只能部分的延缓肿瘤的生长，其肿瘤的体积分别增加了7倍和8倍。h-sio2-peg/c&d加激光的联合治疗组可以比较显著的抑制肿瘤生长，肿瘤体积只生长了5倍。但是h-mno2-peg/c&d加激光的联合治疗组在治疗结束的时候肿瘤的生长速度最慢并且体积最小，肿瘤的体积仅仅增加了2倍。最重要的是本申请的联合治疗组的治疗效率要比预计的叠加作用更加的好(图12中(b)所示)。

实施例9：h-mno2-peg/c&d纳米颗粒与anti-pd-l1抗体联合治疗

为了研究双边的肿瘤模型，4t1细胞皮下注射在小鼠的左侧(原始肿瘤)和右侧(远端肿瘤)。一个星期之后，将小鼠分别静脉注射200μl的pbs，或h-mno2-peg/c&d(mno2＝10mg·kg^-1，ce6＝4.7mg·kg^-1和dox＝4.5mg·kg^-1)或h-mno2-peg/c&d+anti-pd-l1。注射12h之后，原始的肿瘤在660nm激光下照射(5mw·cm^-2，1h)，之后在激光照射完的1，3，5，7天分别注射750μg·kg^-1的anti-pd-l1抗体。原始和远端的肿瘤尺寸与小鼠的体重每两天检测一次。

如图13所示，图13是实施例9中h-mno2-peg/c&d与anti-pd-l1联合治疗后，对小鼠原始肿瘤以及远端肿瘤的治疗结果，和期待的一样，基于h-mno2-peg/c&d的化疗-光动力治疗与anti-pd-l1抗体联用之后，与h-mno2-peg/c&d的联合治疗组相比，可以进一步提高左侧肿瘤的治疗效果。h-mno2-peg/c&d在小鼠左侧肿瘤引导的化疗-光动力治疗与anti-pd-l1抗体联用之后可以延缓远程肿瘤的生长，但是右侧其他组的小鼠肿瘤没有明显的抑制。联合治疗组小鼠左侧和右侧肿瘤的体积分别增加了2.5倍和2.3倍。因此h-mno2-peg/c&d组诱导的化疗-光动力治疗与anti-pd-l1抗体的联合治疗不仅对直接光照的原始肿瘤进行有效地杀伤，而且可以抑制远端肿瘤的生长(例如活体深层次的肿瘤或治疗之前很难检测的肿瘤)。

由以上实施例可知，本发明提供了一种空心mno2复合纳米材料的制备方法，包括以下步骤：a)将正硅酸乙酯溶解在乙醇和碱性水溶液的混合溶液中，水解，得到实心二氧化硅纳米颗粒；b)将所述实心二氧化硅纳米颗粒的水溶液和高锰酸钾溶液混合，还原反应后再刻蚀，得到空心mno2纳米颗粒；c)将所述空心mno2纳米颗粒表面依次修饰聚丙烯胺盐酸盐层、聚丙烯酸层和氨基化的聚乙二醇层，得到空心mno2复合纳米材料。该方法以实心二氧化硅球为模板，一次实验可以得到大量形貌可控的空心结构的mno2复合纳米材料，重复性好；在酸性条件下可以完全的分解，通过荧光成像和磁共振成像，证明该纳米颗粒在小鼠体内会分解产生mn²⁺离子并通过肾脏排出体外。另外，该制备方法制备的空心mno2复合纳米材料具有非常好的水溶性和生物相容性，在水和生理环境下都具有很好的分散性，可以高效的装载药物试剂并在肿瘤部位特定的释放；能够实现可见光区的较强的荧光成像以及肿瘤部位特异性的t1磁共振成像；与anti-pd-l1联合使用之后，不仅可以对原始肿瘤进行有效的杀伤，还能明显的抑制远端肿瘤的生长。实验结果表明：该制备方法可以一次合成至少6g空心mno2复合纳米材料；tem表明其可重复实验；mno2纳米颗粒在中性或碱性条件下是稳定的，在弱酸性的环境中会分解成mn²⁺离子；二氢卟酚e6和盐酸阿霉素的装载量分别为17～89％和13～87％；注射纳米颗粒24h之后，肿瘤位置的t1磁共振信号有2倍的增强；h-mno2-peg/c&d加激光的联合治疗组在治疗结束的时候肿瘤的生长速度最慢并且体积最小，肿瘤的体积仅仅增加了2倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。