一种MSCs来源的OPCs滋养感觉神经元轴突生长的方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种mscs来源的opcs滋养感觉神经元轴突生长的方法。

背景技术：

神经系统退行性改变和损伤后再生修复与功能重建，一直是神经科学研究者亟待探索解决的重大课题及面临的最难以逾越的严峻挑战。由于中枢神经组织在结构上的脆弱性和功能上的复杂性，其损伤往往息味着巨大的、不可逆的破坏，严重影响患者生命安全与生活质量。神经系统损伤修复包括结构修复和功能恢复两个方面。结构修复涵盖神经元再生和新生、轴突生长和突触再连接。目前的医疗技术尚不能解决神经元再生和新生的难题，而轴突生长则是可控的一个方面。既往的研究表明，截瘫大鼠5%的残留神经纤维即可使瘫痪后肢恢复部分或全部关节运动；当残留达到10%时，截瘫动物甚至可以恢复部分行走功能；当残留比例超过40%时，大鼠后肢运动功能可达到正常。有理由推测，人类神经系统（脑和脊髓）退行性改变或损失只要10%~15%神经结构完整，即可保持近85%~90%功能，而如何促进神经纤维新生是恢复神经功能、改善生活质量的重要内容。

目前，应用于临床治疗的药物大多起神经保护作用和（或）可能的神经修复作用，包括：神经节苷脂、脑蛋白水解物、三磷酸胞苷二钠、奥拉西坦等神经营养药物，硫酸软骨素、软骨素酶abc等减弱抑制神经生长的药物，司来吉兰、肌酸、艾地苯醌等代谢药物，拉莫三嗪、利鲁唑等抗兴奋毒性药物，美金刚、瑞波西汀、利他林、他克林等神经递质性药物，但这些药物对轴突再生和新生以及神经功能恢复的作用极其有限。研究新的神经修复制剂或药物成为神经修复医学的重要课题。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

技术实现要素：

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种mscs来源的opcs滋养感觉神经元轴突生长的方法，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种mscs来源的opcs滋养感觉神经元轴突生长的方法，包括如下步骤：

s1.以新生儿脐带华通氏胶经mscs培养基培养得到p2代脐带mscs；

s2.以mscs培养基悬浮p2代脐带mscs，接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的细胞培养板中培养至60-70%汇合，换神经分化培养基制备得到神经上皮预诱导细胞；

s3.以神经上皮预诱导细胞经opcs培养基培养得到p0代opcs，并传代培养至p2代；

s4.以p2代opcs制备opcs滋养层;

s5.制备drg感觉神经元细胞，以opcs滋养层与drg感觉神经元细胞进行共培养。

进一步地，所述mscs培养基为含2%血清替代物的无血清培养基。

进一步地，所述神经分化培养基为包含以下成分的dmem/f12：

1×b27，

1×n2，

1um1,25-二羟维生素d3，

40ng/ml三碘甲状腺氨酸，

0.5ug/ml人褪黑素，

20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，

20ng/ml重组人表皮生长因子。

进一步地，所述opcs培养基为包含以下成分的dmem/f12：

1×b27，

1×n2，

2mml-谷氨酰胺，

1um1,25-二羟维生素d3，

40ng/ml三碘甲状腺氨酸，

0.5ug/ml人褪黑素，

20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，

20ng/ml重组人表皮生长因子，

20ng/ml重组人血小板来源生长因子aa，

4ng/ml重组人神经营养因子3。

进一步地，所述步骤s1进一步包括如下步骤：足月健康新生儿脐带经洗涤，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎，以mscs培养基悬浮后，转移至培养瓶置于co2培养箱内培养，培养至第14天时，加入消化液室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀物以尼龙细胞筛过滤，收集滤液，离心弃上清，收获沉淀物，记为p0代脐带mscs；以mscs培养基重悬细胞，调整细胞密度，接种至新的组织培养瓶中培养至第4天，收获，记为p1代脐带mscs，将p1代继续培养至p2代。

进一步地，所述步骤s2进一步包括如下步骤：以mscs培养基悬浮p2代脐带mscs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%co2，饱和湿度条件下培养4天，吸弃培养上清，pbs洗涤培养表面1次，加入胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。

进一步地，所述步骤s3进一步包括如下步骤：以opcs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，pbs洗涤培养表面，加入accutase^tm消化液，室温消化5分钟后终止，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为p0代opcs，p0代opcs传代培养至p2代时收获。

进一步地，所述p0代opcs传代培养的培养体系为：经opcs培养基悬浮，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶。

进一步地，所述步骤s4进一步包括如下步骤：以opcs培养基重悬p2代opcs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的培养板中，培养至24小时，换含3%fbs的dmem/f12培养48小时备用，此为opcs滋养层。

进一步地，所述步骤5进一步包括如下步骤：断颈处死成年雄性wistar大鼠，手术取drg，以含0.1mg/mlnb4的dmem/f12消化drg，600g离心10分钟，弃上清；以胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟后终止，离心弃上清；沉淀以生理盐水洗涤，以移液管抽吸吹打，离心弃上清，沉淀为drg感觉神经元细胞；以含3%fbs的dmem/f12重悬drg感觉神经元细胞，调整细胞密度；吸弃opcs滋养层培养基，再接种drg感觉神经元细胞悬液，37℃，5%co2条件下共培养48小时。

本发明的有益效果：本发明所述的mscs来源的opcs滋养感觉神经元轴突生长的方法，采用mscs来源的opcs与成年大鼠背根神经节（dorsalrootganglia，drg）感觉神经元共培养48小时，68.19±24.09%的drg感觉神经元轴突生长，平均生长长度为190.22+/-20.51um，为中枢神经系统神经损伤修复的细胞治疗提供了新的思路。

附图说明

图1是华通氏胶组织块接种时的形态图；

图2是华通氏胶组织块培养第14天时的形态图；

图3是p2代脐带mscs的形态图；

图4是脐带p2代mscs在重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的96孔板上生长的形态图；

图5是神经上皮预诱导细胞形态的改变；

图6是神经上皮预诱导细胞高表达nestin的形态图；

图7是脐带mscs来源的opcs高表达a2b5的形态图；

图8是脐带mscs和mscs来源的opcs培养48小时分泌多种生物活性分子浓度比较图；

图9是对照组drg感觉神经元形态图；

图10是脐带mscs共培养组drg感觉神经元形态图；

图11是opcs共培养组drg感觉神经元形态图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂和实验器械未经特殊说明均可从商业途径获得。

首先，对本发明具体实施例中涉及的试剂、出现的英文及缩写进行简单的说明。

ultraculture：无血清培养基，生产厂商为lonza，货号为12-725f；

ultrosergserumsubstitute：血清替代物，生产厂商为pall，货号为15950-017；

0.25%重组人胰蛋白酶：生产厂商为上海雅心生物技术有限公司，货号为rht0301；

0.08%edta：生产厂商为sigma-aldrich，货号为1233508；

抑肽酶溶液：生产厂商为sigma，货号为a1250000；

重组人层黏连蛋白：生产厂商为biolamina，货号为laminin-221；

重组人玻连蛋白：生产厂商为enzo，货号为enz-prt179-0500；

fbs：胎牛血清，生产厂商为bi，货号为04-400-1a；

dmem/f12：是一种细胞培养基，生产厂商为invitrogen，货号为12800017；

b27：人体白细胞抗原，生产厂商为gibco，货号为17504-044；

n2：是一种细胞培养添加剂，生产厂商为gibco，货号为17502-048；

1,25-二羟维生素d3：生产厂商为sigma，货号为740543；

三碘甲状腺氨酸：生产厂商为sigma，货号为t2877；

人褪黑素：生产厂商为sigma，货号为m5250；

重组人碱性成纤维细胞生长因子：生产厂商为sigma，货号为srp2092，sigma；

重组人表皮生长因子：生产厂商为sigma，货号为e9644；

accutase^tm消化液：生产厂商为innovativecelltechnologies,inc，货号为40506es60；

重组人血小板来源生长因子aa：生产厂商为peprotech，货号为100-13a；

重组人神经营养因子3：生产厂商为sigma，货号为spr3267；

nb4：胶原酶nb4，生产厂商为serva，货号为17454；

0.05%胰蛋白酶溶液：生产厂商为biologicalindustries，货号为03-053-1a；

mouseanti-integrinβ1：小鼠抗整合素β1，生产厂商为abcam，货号为ab183666；

goatanti-rabbitigg：羊抗兔igg，生产厂商为abcam，货号为alexafluor®488，ab150077；

ngf：神经生长因子；

bdnf：脑源性神经营养因子；

nt-3：nt-3神经营养因子；

gdnf：胶质细胞源性神经营养因子；

vegf:血管内皮生长因子;

tgf-β1：重组人转化生长因子-β1；

tgf-β2：重组人转化生长因子-β2；

bfgf:成纤维细胞生长因子;

pdgf-aa:血小板衍生因子-aa;

angiogenin:血管生成素;

hgf：肝细胞生长因子；

cd73:分化抗原簇73，是胞外-5'-核苷酸酶通过糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定于质膜的一种糖蛋白。;

cd90:分化抗原簇90，又称thy-1，一种25-37kda的高度保守的n-糖基化的糖基磷脂酰肌醇（gpi）锚定的膜蛋白，是粘附分子免疫球蛋白家族成员;

cd105:分化抗原簇105，又称内皮素，是一种内皮细胞增殖的标志物,是转化生长因子β受体复合物的成分之一;

nestin:巢蛋白,是中间丝蛋白家族成员。

实施例一：mscs的培养及mscs滋养层的建立

足月健康新生儿脐带以生理盐水洗涤3次，去除残血，无菌解剖剥离华通氏胶，剪碎至2-3mm³的小块，以10mlmscs培养基悬浮，所述mscs培养基为含2%ultrosergserumsubstitute的ultraculture。

转移至25cm²组织培养瓶（型号：easyflask，生产厂商：nunc）中，置于37℃，5%co2培养箱内培养。

培养至第14天时，吸弃培养上清，以生理盐水洗涤表面2次，加入5ml含有0.25%重组人胰蛋白酶和0.08%edta的胰蛋白酶消化液，室温消化5分钟，以1ml抑肽酶溶液终止消化，400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物。

沉淀物以生理盐水洗涤2次，100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液，400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物，即为p0代脐带mscs。

以mscs培养基重悬细胞，调整细胞密度至6000个/cm²，接种至新的25cm²组织培养瓶中培养至第4天，收获，即为p1代脐带mscs。

继续培养至p2代。以mscs培养基悬浮p2代脐带mscs，按6000个/cm²接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的96孔板（型号：167008，生产厂商：nunc）中，培养至24小时，换含3%fbs的dmem/f12培养48小时备用，此为mscs滋养层。

实施例二：神经上皮预诱导细胞的制备

以mscs培养基悬浮p2代脐带mscs，按6000个/cm²接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板（型号：174901，生产厂商：nunc）中，培养至60-70%汇合，换神经分化培养基，37℃，5%co2，饱和湿度条件下培养4天。

吸弃培养上清，pbs洗涤培养表面1次，加入1ml0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入100ul抑肽酶溶液终止消化。

400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，即为神经上皮预诱导细胞。

其中，神经分化培养基为包含以下成分的dmem/f12：

1×b27，

1×n2，

1um1,25-二羟维生素d3，

40ng/ml三碘甲状腺氨酸，

0.5ug/ml人褪黑素，

20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，

20ng/ml重组人表皮生长因子。

实施例三：opcs的培养及opcs滋养层的建立

以opcs培养基重悬神经上皮预诱导细胞，按1.5×10⁴/cm²接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板中，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，pbs洗涤培养表面1次，加入accutase^tm消化液1ml，室温消化5分钟，加入200ul抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为p0代opcs。

p0代opcs传代培养，培养体系为opcs培养基，重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的组织培养瓶，传代至p2代时收获。

以opcs培养基重悬p2代opcs，按1.5×10⁴/cm²接种至重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的96孔板中，培养至24小时，换含3%fbs的dmem/f12培养48小时备用，此为opcs滋养层。

其中，opcs培养基为包含以下成分的dmem/f12：

1×b27，

1×n2，

2mml-谷氨酰胺，

1um1,25-二羟维生素d3，

40ng/ml三碘甲状腺氨酸，

0.5ug/ml人褪黑素，

20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子，

20ng/ml重组人表皮生长因子，

20ng/ml重组人血小板来源生长因子aa，

4ng/ml重组人神经营养因子3。

实施例四：drg感觉神经元分离和共培养

断颈处死成年雄性wistar大鼠（型号：spf，生产厂商：维通利华），手术取drg。以含0.1mg/mlnb4的dmem/f12消化drg，37℃，90分钟，600g离心10分钟，弃上清。

以0.05%胰蛋白酶溶液重悬沉淀，37℃消化15分钟，加入10%体积的抑肽酶溶液终止消化，400g离心10分钟，弃上清。

沉淀以生理盐水洗涤2次，以5ml移液管抽吸吹打15次，400g离心10分钟，弃上清，沉淀为drg感觉神经元细胞。

以含3%fbs的dmem/f12重悬drg感觉神经元细胞，调整细胞密度至3×10⁴/ml。

对照组直接接种drg感觉神经元细胞悬液于重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的96孔板中。

mscs共培养组和opcs共培养组，首先吸弃mscs滋养层和opcs滋养层培养基，再接种drg感觉神经元细胞悬液，每孔100ul，37℃5%co2，共培养48小时。

实施例五：多种生物活性分子表达检测及drg神经元轴突检测

5.1多种生物活性分子表达检测

elisa法检测培养48小时的p2代脐带mscs和培养48小时的mscs来源的p2代opcs培养上清中以下生物活性分子的表达：ngf、bdnf、nt-3、gdnf、vegf、tgf-β1、tgf-β2、hgf、bfgf、pdgf-aa、angiogenin。

5.2drg神经元轴突检测

共培养至第48小时，吸弃培养基，以4％多聚甲醛固定细胞10分钟，以pbs漂洗2次，滴加mouseanti-integrinβ1一抗，4℃过夜；pbs漂洗2次，滴加goatanti-rabbitigg，室温孵育1小时，pbs漂洗2次；以细胞成像系统（生产厂家：gehealthcare）检测有轴突的神经元数量和轴突长度。

5.3统计学分析

统计学分析采用spss17.0进行统计学处理。数据以±s表示，均值比较采用独立样本t-test，频数比较采用卡方检测，p<0.05有统计学意义。

实施例六：实验结果

6.1滋养层制备和分析

脐带mscs来源的opcs培养的不同阶段参见图1~7。

脐带组织块采用无血清培养体系培养，参见图1，至第7天时部分组织块有大量细胞爬出，至第14天收获时，大约45%的组织块周围形成多克隆的典型mscs培养形态，参见图2。

随着传代次数的增加，细胞形态逐渐均一化，参见图3。

p2代脐带mscs高表达cd73、cd90、cd105，低表达或不表达造血免疫系定向表型。

p2代mscs在重组人层黏连蛋白、重组人玻连蛋白包被的6孔板上更易于贴壁，且具有更好的迁移特征，培养72小时具有典型的mscs形态特征，参见图4。

以神经诱导培养基诱导mscs向神经分化，mscs细胞体逐渐拉长，平行生长，参见图5，高表达nestin，参见图6。

以opcs培养基诱导mscs来源的神经上皮预诱导细胞分化成opcs，6天以后，细胞形态发生明显的双极性、三极性改变，传代培养至第2代时92.09+/-11.43%的细胞表达a2b5，参见图7。

脐带源mscs和mscs来源的opcs培养48小时，分泌的与神经修复相关的生物活性因子分泌有较大差别。结果参见图8，左侧为mscs表达多种生物活性分子的结果，右侧为opcs表达多种生物活性分子的结果，结果表明，mscs分化成opcs后，与mscs相比，ngf、bdnf、nt-3、gdnf的分泌量有显著增长，分别增长至2.98、7.30、13.11、112.80倍；而vegf、hgf、tgf-β1、tgf-β2、bfgf、pdgf-aa、angiogenin分泌有不同程度降低，分别降低至mscs分泌量的2.72%、74.88%、47.76%、46.58%、28.39%、1.83%、2.44%。

6.2滋养层细胞促进drg感觉神经元细胞轴突增加和生长

drg感觉神经元细胞接种至重组人层黏连蛋白和重组人玻连蛋白包被的96孔板、mscs滋养层或opcs滋养层上共培养48小时，对照组、mscs共培养组、opcs共培养组的神经元轴突都有不同程度的增加和生长，分别参见图9、图10和图11。

其中对照组带有神经纤维的神经元为22.52±9.11%，mscs共培养组为51.85±20.06%、opcs共培养组为68.19±24.09%。opcs共培养组神经元轴突生长最长（190.22+/-20.51um），显著长于mscs共培养组（99.46+/-3.87um）和对照组（25.12+/-3.28um）。

实施例七：结果分析

在神经组织修复过程中，神经元再生是十分困难的，但残留神经纤维生长、突触再连接能部分，甚至全部恢复神经功能。

目前虽然发现某些神经营养因子对神经轴突生长有一定促进作用，但非常有限。随着干细胞再生医学的发展，很多基础和临床研究发现，体外mscs和opcs等与神经元细胞共培养能促进轴突生长，而且体内移植mscs、opcs等能一定程度上再建神经传递通路。但mscs的作用更趋向于局部调节免疫活动，并通过旁分泌作用动员在体干/祖细胞恢复活性，从而促进神经组织自我修复，而opcs则不然。opcs是髓鞘的结构细胞，对于轴突生长和修复有天然的作用，体内外的实验都表明opcs对于轴突生长和神经功能重建是有作用的，是维持和修复损伤的轴突、重建轴突电传导功能的最新进展和最有前景的治疗手段。

目前，成体opcs获取困难，虽然胚胎干细胞、诱导多能干细胞体外能分化产生opcs，但存在体内移植致瘤性风险。因此有人采用诱导成体多能干细胞，特别是mscs，体外产生opcs，如此不会存在伦理学障碍以及体内应用的成瘤性等严重不良反应。

mscs是目前除造血干细胞之外，研究和应用最广泛和深入的成体多能干细胞，其样本来源广泛，体外培养简单，细胞收率高，特别是脐带mscs，更易于培养。因此，选择脐带mscs来源的opcs作为滋养细胞促进神经元轴突增生和生长是一个优化的方案。

mscs经过bfgf、egf等生长因子能分化成nestin+神经前体细胞，再经过opcs诱导体系分化成opcs。既往多采用mscs-神经球-opcs的诱导体系，比较复杂，操作复杂，我们优化了培养工艺，采用mscs-神经上皮预诱导细胞-opcs的传代培养体系，简化了操作步骤，至p2代时，92.09+/-11.43%的细胞表达a2b5，纯度很高。并且ngf、bdnf、nt-3、gdnf等与神经修复有关的生物活性因子的分泌相对于mscs有了很大的提高。

共培养结果表明，采用脐带mscs来源的p2代opcs滋养drg感觉神经元，神经元的生长锥数量相比于无滋养层的对照组和mscs滋养层增加了3.9倍和1.32倍，而神经纤维长度，经共培养48小时，提高了7.57倍和1.91倍。因此，本发明提供了一种通过脐带mscs来源的opcs有效培养drg感觉神经元轴突增长和生长的方法。