抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12c11及其杂交瘤细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域，具体地涉及抗人神经生长因子的单克隆抗体及其杂交瘤 细胞株。
【背景技术】
[0002] 神经生长因子（NGF)是具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能的一种 神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表 达均具有重要的调控作用。
[0003] 研宄表明，神经生长因子（NGF)是一种在超敏反应的发生和异常性疼痛的产生中 具有关键作用的递质。大量临床前研宄表明：阻止NGF与其受体的相互作用，即可缓解疼 痛。NGF单克隆抗体与NGF中和，阻断NGF与其感觉神经元上的受体的相互作用从而达到缓 解疼痛的效果。（抗神经生长因子单克隆抗体Tanezumab.药学进展.2010, 34 (1):526.)。 有报道显示采用神经生长因子抗体拮抗剂来预防或治疗手术后疼痛，包括来自手术或来自 切割性或创伤性伤口的疼痛。还有报道显示抗NGF抗体用于治疗各种疾病，包括哮喘、关节 炎和银肩病（D.L.谢尔顿.抗NGF抗体用于治疗各种疾病.中国专利【申请号】02814992. 0)。 然而，目前对神经生长因子抗体的报道多是研宄多克隆抗体（赵小林，由振东.神经生长 因子抗体的制备及其应用.中国神经科学杂志.2004, 20 (2) : 171-173.)。而多克隆抗体的 特异性差，用于免疫组化时显色背景高，质量不易控制，难以在临床应用推广。单克隆抗体 具有特异性强、敏感性高的优点，在临床检测中应用广泛，可以在免疫组化、ELISA等多种方 法中使用。国内外对神经生长因子单抗的研宄并不常见。现已有报道得到的抗rhNGF单克 隆抗体是通过采用酸处理后的沙门氏菌菌体吸附纯化的NGF(抗原：菌体1 :5)脾内注射， 脾细胞与骨髓瘤细胞经PEG融合后筛选得到杂交瘤细胞，并对得到的抗rhNGF单克隆抗体 进行了初步的鉴定分析（苏瑾，张亚莉，尤长宣，等.抗人NGF单克隆抗体的制备及初步鉴 定.细胞与分子免疫学杂志.2002, 18 (2) : 168)，但没有对抗rhNGF单克隆抗体的中和活性 进行鉴定。因此，目前还需要获得一种特异性强、中和活性高的抗人NGF单克隆抗体，用于 临床疼痛的缓解和疾病的治疗。
【发明内容】
[0004] 根据上述领域的需求，本发明提供一种抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体及 其杂交瘤细胞株。
[0005] 本发明请求保护的技术方案如下：
[0006] 抗人神经生长因子的中和性单克隆抗体12C11，由保藏号为CGMCC No. 8772的杂 交瘤细胞所分泌，所述中和单克隆抗体与人神经生长因子具有中和反应效应，其分类亚型 为：重链IgGl、轻链Kappa。
[0007] 分泌人神经生长因子中和性单克隆抗体12C11的杂交瘤细胞株，其保藏号为 CGMCCNo. 8773〇
[0008] 基于本领域对于抗人神经生长因子的中和抗体的研宄，还请求保护上述抗体的以 下：制药用途：
[0009] -种止痛药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。
[0010] 一种抗过敏药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体12C11。
[0011] 一种抗抗哮喘的药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗体 12C11。一种用于治疗银肩病的药剂，其特征在于：其药效成分包含所述的中和性单克隆抗 体 12C11。
[0012] 一种鉴定抗神经生长因子NGF抗体的中和活性的方法，步骤如下：
[0013] (1)用维持培养基配制抗体样品溶液，在预稀释浓度40 μ g/ml的基础上，进行2 倍系列稀释，共9个稀释度，将待测样品溶液转移至96孔板中，每个浓度3个复孔，每孔 50 μ 1，另选择3个孔加入不含抗体的培养基作为阴性对照，每孔100 μ 1 ;
[0014] 所述 9 个稀释度分别为：10 μ g/ml、5 μ g/ml、2. 5 μ g/ml、l. 25 μ g/ml、0. 625 μ g/ ml、0. 3125 μ g/ml、0. 15625 μ g/ml、0. 078125 μ g/ml、0. 039063 μ g/ml ;
[0015] (2)另用维持培养基配制200ng/ml的NGF蛋白溶液，将其添加至含有抗NGF抗体 样品溶液的96孔板中，每孔50 μ 1，阴性对照孔不添加 NGF培养基，另选择3个孔加入阳性 对照溶液l〇〇ng/ml NGF，每孔100 μ 1，然后将96孔板放置于37°C培养箱孵育Ih ;
[0016] (3)取足量TF-I细胞培养物，离心收集TF-I细胞，PBS洗涤2次，离心收集的细胞 用维持培养基重悬，配成每1ml含5X IO4个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中含 有NGF蛋白及抗NGF抗体的孔、阴性对照孔和阳性对照孔中，每孔100 μ 1 ;将96孔板置于 37°C，5%二氧化碳培养；72h后，每孔加入MTS溶液20 μ 1，于37°C，5%二氧化碳培养3小 时；
[0017] (4)从培养箱中取出96孔板，放入酶标仪，于波长490nm处测定吸光度，记录测定 结果；
[0018] (5)通过待测制品的吸光度，按照公式：抗NGF抗体孔的中和抑制率（％) =[(阳 性孔0D490nm平均值-阴性孔0D490nm平均值）-(抗体孔0D490nm平均值-阴性孔0D490nm 平均值）V (阳性孔0D490nm平均值-阴性孔0D490nm平均值），计算每孔的中和抑制率， 中和抑制率越高，则抗NGF抗体的中和活性越强。
[0019] 实验证明，本发明提供的抗人神经生长因子的中和单克隆抗体能够与人神经生长 因子特异性结合，具有中和反应活性，因此可以作为hNGF的拮抗剂。与现有的抗人神经生 长因子多克隆抗体相比，本发明提供的单抗特异性强，能够避免交叉反应，而且本发明提供 的单抗经过了中和活性的鉴定，其效价高、亲和力强、特异性好，能够与人神经生长因子发 生明显的中和反应。
[0020] 本发明还请求保护分泌抗人神经生长因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其保藏 号分别为 CGMCC No. 8773。
[0021] 另一方面，本发明还提供一种鉴定抗神经生长因子NGF抗体的中和活性的方法， 所述方法为TF-I细胞增殖法。本发明首次采用TF-I细胞增殖法检测抗NGF抗体的中和活 性，该方法可以准确、高效地检测出抗NGF抗体的中和活性，其原理是：NGF依赖的TF-I细 胞在NGF蛋白存在的条件下可以促进TF-I细胞增殖，然而在添加了 一定浓度的抗NGF抗体 后，抗NGF抗体与NGF发生中和作用，从而抑制TF-I细胞的良好生长，然后通过添加 MTS混 合溶剂细胞显色，在酶标仪上〇D490nm处测吸光度，计算每孔的中和抑制率，中和抑制率越 高，抗NGF抗体的中和活性也就越强。
[0022] 生物保藏信息：
[0023] 生物材料名称：12C11
[0024] 分类命名：小鼠杂交瘤细胞
[0025] 保藏日期：2014年1月16日
[0026] 保藏号：CGMCC No. 8772
[0027] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0028] 生物材料名称：IlFl
[0029] 分类命名：小鼠杂交瘤细胞
[0030] 保藏日期：2014年1月16日
[0031] 保藏号：CGMCC No. 8773
[0032] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0033] 图1.免疫后小鼠血清效价检测结果
[0034] 图2.抗hNGF单克隆抗体纯化效果的SDS-PAGE鉴定
[0035] 图3.抗hNGF单克隆抗体蛋白的Western Blot结果
[0036] 图4.抗hNGF单克隆抗体中和抑制实验结果
【具体实施方式】
[0037] 下面通过具体实施例对本发明进行更详细的描述，需要说明的是，以下实施例仅 用于解释和说明，而不是以任何方式限制本发明。
[0038] 实验材料：
[0039] BALB/c小鼠：购自北京大学医学部实验动物中心。
[0040] rhNGF :重组人神经生长因子，由申请人单位表达并纯化（乐伟，彭璐佳，史权 威，等.重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研宄.中国药事.2014, 28(6): 601-606.)〇
[0041] NGF依赖的TF-1-A2细胞：由申请人单位本公司驯化后克隆化筛选的TF-I细胞 (刘荷中、乐伟、霍立红，等.亚克隆细胞株TF-1-A2及其制备方法与用途.中国发明专利 授权号：ZL 201210119401. X.)。
[0042] 注射用鼠神经生长因子（苏肽生，北京舒泰神药业有限公司，批号：201211148)
[0043] AP 标记的羊抗鼠 IgG :购自 SIGMA 公司（Cat. No. :A3562)。
[0044] 本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可以通过商购或采用本领域 常规方法制备而得，规格为实验纯级即可。
[0045] 实施例1.抗hNGF单克隆抗体的制备
[0046] l、BALB/c 小鼠免疫
[0047] rhNGF制备：由申请人自行表达、纯化并制备（乐伟，彭璐佳，史权威，等.重组人 神经生长因子的高效表达和生物活性评价研宄.中国药事.2014, 28 (6) :601-606.)。
[0048] 选取5只雌性BALB/c小鼠，将rhNGF抗原与弗氏完全佐剂（sigma公司）混合，乳 化完全后皮下注射，每只小鼠的免疫剂量为80 μ g免疫。首次免疫后，间隔2周及3周，将 rhNGF抗原与弗式不完全佐剂（sig