介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药工程领域，具体地，涉及介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架及其制备方法和应用。

背景技术：

骨骼是人体重要组成部分，具有一定的机械性能，起到人体支撑作用。但由于外界创伤、骨疾病(骨肿瘤、骨髓炎等)以及感染多种原因造成的骨缺损，在临床上很常见且难以完全修复。传统的制备用于骨组织修复支架的材料种类较多，它们各自的优点各不相同，但是却存在一些相同的缺点，比如材料孔隙不均一、制作过程耗时长、可重复性较差、不能制备较复杂的支架外形。

近年来逐渐兴起的3d打印技术有望改善这一不利情况。在3d打印中，打印机逐层堆积材料直至形成孔径均一、孔道贯通、空间结构分布均匀的骨组织工程支架，因此这一方法更具备材料外形可控、产品结构个性化并一次成型的优点，所以3d打印技术已成为生物医用材料领域中制备支架的新方法。

在制备骨组织修复支架的材料中，聚己内酯(pcl)是一种可用于人体的可降解高分子聚合物，被广泛应用于生物医用材料领域。但是将pcl用于制造骨修复材料也存在一些缺陷，比如表面不利于细胞的粘附与生长，没有生物活性，降解性能不佳。因此，本领域急需一种能改善pcl的降解速率、提高生物活性和细胞相容性的支架，并能改善现有支架孔隙不均、制作复杂的缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是解决制备骨组织修复支架领域中缺少一种能改善聚己内酯(pcl)的降解速率、提高其生物活性和细胞相容性的支架，进而提供了一种介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架及其制备方法和应用。本发明在聚已内酯(pcl)中添加介孔硅酸钙镁和小麦蛋白，并通过3d打印制备了孔隙均一的骨组织修复支架。本发明的支架具有较好的体外生物活性，改善了材料的亲水性能，有效的提高了支架的降解速率；并且表现出较好的促进细胞增殖和成骨分化能力，在制备骨缺损修复材料领域具有较好的应用前景。

本发明是通过以下技术方案来解决上述技术问题：

本发明第一方面提供了一种介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架，其中，所述复合支架包括以下组分：介孔硅酸钙镁、小麦蛋白和聚已内酯；

所述介孔硅酸钙镁的比表面积为200-1000m²/g，孔容为0.3-1.0cm³/g；

所述介孔硅酸钙镁、聚已内酯和小麦蛋白的质量比为1:1:1-4:8:1；

所述复合支架的平均孔径为350-550μm；

所述复合支架中每根骨架的宽度为450-650μm。

所述的复合支架，

其中，所述介孔硅酸钙镁、聚已内酯和小麦蛋白的质量比为1:1:1-3:6:1。

其中，所述复合支架的平均孔径优选为400-500μm，更优选为400μm。

其中，所述复合支架中每根骨架的宽度优选为500-600μm。

其中，所述的小麦蛋白为本领域常规使用的小麦蛋白，包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白。所述小麦蛋白市售可得，例如可选用tci(上海)化成工业发展有限公司提供的小麦蛋白。

其中，所述的聚己内酯为本领域常规使用的聚己内酯，市售可得，例如可选用sigmaaldrichchemistry提供的聚己内酯，所述聚己内酯的重均分子量较佳地为40000-80000。

其中，所述的介孔硅酸钙镁组成比例符合camg(sio3)2，宏观以粉末态存在。本发明中，对于所使用的介孔硅酸钙镁的粉末粒径无特殊限制，只要其能够与小麦蛋白和聚己内酯混合均匀即可，较佳地，所述介孔硅酸钙镁的粉末粒径为800-1500nm，例如1000nm。更佳地，所述的介孔硅酸钙镁符合下述条件：所述介孔硅酸钙镁呈非晶态，具有孔径为6-7nm的规则六角形孔道。

本发明中，所述的介孔硅酸钙镁可采用本领域常规用于制备介孔硅酸钙镁的方法制备而得，一般采用溶胶凝胶法。在本发明某一实施方式中，所述介孔硅酸钙镁采用包括如下步骤的方法制备：

s1、将模板剂与水和乙醇混合，搅拌，至溶液澄清；

s2、在30-50℃下，将盐酸(hcl)、正硅酸乙酯(teos)、六水硝酸镁(mg(no3)2·6h2o)、四水硝酸钙(ca(no3)2·4h2o)和水加入上述溶液中，搅拌4-6h反应形成溶胶；

s3、将所得溶胶在90-98℃下陈化，使凝胶物质沉淀；

s4、洗涤所得沉淀物，然后在500-700℃下煅烧除去模板剂即可。

其中，步骤s1中，所述模板剂为本领域常规使用的模板剂，通常采用聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物，例如sigmaaldrich提供的平均重均分子量为5800的p123三嵌段共聚物。在本发明某一实施方式中，步骤s1按照如下操作进行：将5-7gp123嵌段共聚物与170-260ml水和29-43ml乙醇混合，搅拌，至溶液澄清。

其中，步骤s2中，向上述溶液中加入盐酸、正硅酸乙酯、六水硝酸镁、四水硝酸钙和水可采用分步加入，先滴加入盐酸和正硅酸乙酯，再加入六水硝酸镁、四水硝酸钙和水。在本发明某一实施方式中，步骤s2按照如下操作进行：在35-40℃下，依次将14-20ml浓度为1.5-2.5mol/l的盐酸和10-15ml正硅酸乙酯滴加入上述溶液中，然后再加入6.5-9.5g六水硝酸镁、5.8-8.8g四水硝酸钙和25-35ml水，搅拌4-6h反应形成溶胶。

其中，步骤s3中，所述陈化的时间不作特殊限定，以使凝胶物质能够充分沉淀为宜。

其中，步骤s4中，所述洗涤一般采用去离子水和无水乙醇进行洗涤。

本发明第二方面提供了一种3d打印制备如本发明第一方面所述的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

a1、将所述介孔硅酸钙镁、小麦蛋白和聚已内酯混合，得混合物料；

a2、使用3d打印设备对步骤a1获得的混合物料进行3d打印，即得本发明的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架。

步骤a1中，制备混合物料的方法为本领域常规使用的制备方法，较佳地为使用高分子密炼机进行密炼混合，使得物料混合均匀。在本发明的一较佳实施例中，密炼混合在65-75℃下进行。所述密炼混合较佳地为搅拌混合；所述搅拌的速度较佳地为100-500rpm；所述搅拌的时间较佳地为2-5小时。

步骤a2中，所述3d打印设备为本领域常规，较佳的由上海富奇凡机电科技有限公司提供，型号为hts-300。

步骤a2中，所述的3d打印参数优选以下：所述混合物料得喷射速率较佳地为20-30g/min，更佳地为25g/min；所述3d打印设备的料筒温度较佳地为110-120℃，更佳地为112℃。

本发明中，一优选的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架规格为φ12×2mm。

本发明中，一优选的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架规格为φ6×6mm。

本发明第三方面提供了一种由本发明第二方面所述的3d打印方法制备的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架。

本发明第四方面提供了一种如本发明第一方面所述或本发明第三方面所述的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架在制备骨组织修复材料领域中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明在聚已内酯(pcl)中添加介孔硅酸钙镁和小麦蛋白，并通过3d打印制备了孔隙均一的骨组织修复支架。本发明的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚已内酯复合支架具有较好的体外生物活性，改善了材料的亲水性能，有效的提高了支架的降解速率；并且表现出较好的促进细胞增殖和成骨分化能力，在制备骨缺损修复材料领域具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明对比例1以及实施例1和2制备的支架3d0/3d10/3d20的数码照片图。

图2为本发明对比例1以及实施例1和2制备的支架3d0/3d10/3d20的x射线衍射(xrd)图谱(a)和傅里叶红外(ir)衍射图(b)。

图3为本发明对比例1以及实施例1和2制备的支架3d0/3d10/3d20的sem照片，放大倍数分别为50倍(a，c，e)和150倍(b，d，f)，其中a和b为3d0，c和d为3d10，e和f为3d20。

图4为本发明对比例1以及实施例1和2制备的支架3d0/3d10/3d20浸泡在tris-hcl缓冲溶液中不同时间节点的失重率(a)和ph变化(b)曲线图。

图5为本发明对比例1的支架3d0(a，b)，实施例1的支架3d10(c，d)，实施例2的支架3d20(e，f)浸泡在模拟体液(simulatedbodyfluid，sbf)溶液7天后表面的扫描电镜图，放大倍数为1k倍(a，c，e)和3k倍(b，d，f)。

图6为本发明实施例2的支架3d20浸泡在模拟体液(simulatedbodyfluid，sbf)中7天后表面的x射线能谱图。

图7为本发明实施例2的支架3d20浸泡在模拟体液(simulatedbodyfluid，sbf)中14天内溶液后的离子浓度变化曲线图。

图8为mc3t3-e1细胞分别在对比例1的支架3d0(a，b，c)，实施例1的支架3d10(d，e，f)，实施例2的支架3d20(g，h，i)表面培养12小时(a，d，g)、1天(b，e，h)和3天(c，f，i)时的扫描电镜图。

图9为mc3t3-e1细胞分别在本发明对比例1以及实施例1和2制备的支架3d0/3d10/3d20支架表面培养1、3和5天后的增殖率图，*p＜0.05。

图10为mc3t3-e1细胞分别在本发明对比例1以及实施例1和2制备的支架3d0/3d10/3d20表面培养7、10和14天后的碱性磷酸酶活性图，*p＜0.05。

图11为本发明效果实施例5中，支架材料植入手术过程照片(a：除净手术部位的绒毛，b：切开皮下组织并拨开肌肉，c：在股骨部位制作缺损模型，d：清除缺损内碎骨和血渍，e：支架材料植入，f：缝合伤口)。

图12为本发明对比例1的支架3d0(a，b，c)，实施例1的支架3d10(d，e，f)，实施例2的支架3d20(g，h，i)植入兔股骨内1个月(a，d，g)、2个月(b，e，h)和3个月(c，f，i)后的大体观察照片。

图13为本发明对比例1的支架3d0和实施例2的支架3d20植入兔股骨内1、2和3个月后的micro-ct二维成像图。

图14为本发明对比例1的支架3d0和实施例2的支架3d20植入兔股骨内1、2和3个月后的micro-ct三维成像图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明的实施例中，

聚己内酯(pcl)由sigmaaldrichchemistry提供，平均重均分子量80000，

小麦蛋白(wg)由梯希爱(上海)化成工业发展有限公司提供，

高分子密炼机由东莞市昶丰机械科技有限公司提供，

3d打印设备由上海富奇凡机电科技有限公司提供。

其它原料和试剂均市售可得。

实施例1介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d10)的制备

本实施例的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d10)采用以下方法制备：

(1)介孔硅酸钙镁(m-mcs)的制备

本实施例的m-mcs采用如下方法制备得到：

称取6g模板剂p123三嵌段共聚物，加入217ml去离子水和36ml乙醇，持续搅拌直到溶液变澄清；

在水浴38℃条件下，先后将17mlhcl(2.0mol/l)和12.9mlteos缓慢滴加到溶液中，然后向溶液中加7.9gmg(no3)2·6h2o、7.3gca(no3)2·4h2o和30ml去离子水，此过程中，继续保持水浴38℃，持续搅拌溶液5h反应形成溶胶；将所得溶胶在95℃下陈化3d，使凝胶物质沉淀；所得沉淀物先后分别用去离子水、无水乙醇洗涤，然后在600℃下煅烧除去模板剂p123三嵌段共聚物，即得。

(2)介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d10)的制备

将pcl、wg和m-mcs按照重量份6:1:3的比例用高分子密炼机在70℃下密炼混合，使其充分混合均匀。称取50g的混合样品，放入3d打印设备的料腔中，进行3d打印，所得支架即为3d10。

实施例2介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d20)的制备

本实施例的介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d20)采用以下方法制备：

(1)介孔硅酸钙镁(m-mcs)的制备

本实施例的m-mcs采用与实施例(1)中相同的方法制备。

(2)介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d20)的制备

将pcl、wg和m-mcs按照重量份5:2:3的比例用高分子密炼机在70℃下密炼混合，使其充分混合均匀。称取50g的混合样品，放入3d打印设备的料腔中，进行3d打印制备支架，所得支架即为3d20。

实施例3介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d15)的制备

(1)介孔硅酸钙镁(m-mcs)的制备

本实施例的m-mcs采用与实施例(1)中相同的方法制备。

(2)介孔硅酸钙镁/小麦蛋白/聚己内酯复合支架(3d15)的制备

将pcl、wg和m-mcs按照重量份11:3:6的比例用高分子密炼机在70℃下密炼混合，使其充分混合均匀。称取50g的混合样品，放入3d打印设备的料腔中，进行3d打印制备支架，所得支架即为3d15。

对比例1介孔硅酸钙镁/聚己内酯复合支架(3d0)的制备

本实施例的介孔硅酸钙镁/聚己内酯复合支架(3d0)采用以下方法制备：

(1)介孔硅酸钙镁(m-mcs)的制备

本实施例的m-mcs采用与实施例(1)中相同的方法制备。

(2)介孔硅酸钙镁/聚己内酯复合支架(3d20)的制备

将pcl和m-mcs按照重量份7:3的比例用高分子密炼机在70℃下密炼混合，使其充分混合均匀。称取50g的混合样品，放入3d打印的料腔中，进行3d打印制备支架，所得支架即为3d0。

效果实施例1支架3d0/3d10/3d20的表征

①数码相片图

本发明的支架3d0/3d10/3d20的数码照片如图1所示。

由图可知，随着wg质量分数的增加，支架的颜色逐渐加深。

②ir、xrd分析

采用ir对上述制备的支架3d0/3d10/3d20进行分子结构和化学组成分析，测试范围使用中红外光(约4000-400cm^-1)。

采用xrd，在广角(10-80°)进行测试，对支架3d0/3d10/3d20进行组成、结构分析。以上分析结果见图2。

从图2a可以看出，m-mcs是非晶态硅酸盐材料，xrd图谱在2θ＝24°处有一个宽峰，21.3°和23.7°处出现的峰是pcl的特征衍射峰，3d0的xrd图谱是由宽峰与结晶峰叠加而成。wg是非晶态物质，3d10和3d20的出峰位置与3d0基本相同，但是随着wg含量的增多，3d10和3d20峰强度逐渐降低。

从图2b可以看出，3d0中2930cm^-1、2870cm^-1、1720cm^-1和1150cm^-1是pcl中c-h伸缩振动峰、-ch2-伸缩振动峰、c＝o伸缩振动吸收峰和c-o-c对称伸缩振动，1081cm^-1、802cm^-1和460cm^-1是m-mcs中si-o-si非对称伸缩振动峰、对称伸缩振动峰以及弯曲振动吸收峰。wg中3303cm^-1、2927cm^-1和1592-1651cm^-1分别是是水伸缩振动峰、甲基-ch3的反对称伸缩振动峰和氨基特征峰。随着wg含量的增多，3d10和3d20中wg的特征峰强度变强。此外，支架3d15具有与支架3d10和3d20相近的效果。

②sem观察

采用扫描电子显微镜(sem，hatachis-4800，日本日立集团)，对3d0，3d10和3d20进行表面形态观察。结果见图3。

从图中可以看出，三组支架均具有高度规则的孔结构和优异的孔贯通性，平均孔径约400-500μm之间，支架每根骨架的宽度约500-600μm(图3a，c，e)。100-500μm的孔径不仅有利于营养物质在材料与细胞之间的传导，也有利于细胞和骨组织的长入。3d0具有较光滑的支架表面，且表面上存在一些m-mcs粉末颗粒(图3a，b)。3d10和3d20的支架表面越来越粗糙，3d10表面存在少量的凸起，而3d20的凸起较多(图3c，d，e，f)。材料表面的粗糙度对细胞行为的影响很大，细胞在粗糙的材料表面更易于粘附、铺展、增殖和分化。此外，支架3d15具有与支架3d10和3d20相近的效果。

效果实施例2支架3d0/3d10/3d20体外降解性能测试

支架材料体外降解性能是在37℃中tris-hcl浸泡84天，通过测定其失重率和ph变化情况来判定。在本实施例中，tris-hcl缓冲溶液(ph＝7.4)的配制方法如下：42ml稀盐酸溶液(0.1mol/l)与50ml三羟甲基氨基甲烷(tris，0.1mol/l)溶液混合均匀后，用去离子水定容至100ml，即得。

具体操作为：将支架样品(3d0，3d10，3d20，φ12×2mm)超声清洗2次，100℃真空干燥至恒重，分析天平称其初始质量，记为w0。按照固体/液体为0.25g/50ml的比例，将样品浸泡在tris-hcl(ph＝7.4)溶液中，置于恒温振荡箱(37℃，80r/min)中。分别在3，7，14，21，28，42，56，70和84天时取出样品，100℃真空干燥至恒重，称重并记为wi。则失重率(％)按照公式计算：

失重率(％)＝(w0-wi)/(w0)×100

另外，将样品(3d0，3d10，3d20，φ12×2mm)按照固体/液体为0.25g/50ml的比例，将样品浸泡在tris-hcl(ph＝7.4)溶液中，在整个浸泡周期中，分别在第1、3、7、14、21、28、35、42、56、70和84天，用ph计测定其溶液ph值。结果见图4。

从图4a可以看出，从第1天到第84天，三组支架的失重率逐渐增加。3d0的失重率在整个降解周期中一直处于不理想状态，在84天后，3d0的失重率只有24.85％。相比3d0，3d10的降解性有所提升，在第28天，失重率已经达到23.52％，而在第84天，其失重率进一步增加，最终为36.57％。3d20的表现出较好的降解性，前42天，其失重率变化的较快，随着浸泡时间进一步增加，其失重率变化比较平缓，最终在第84天，其失重率是45.65％。理想的骨再生植入材料应该有适宜的降解性，在新骨生长的过程中，材料逐渐降解，骨组织可以逐渐形成和重建。wg是可降解的天然植物高分子，wg的加入有效的提高了支架的降解性，且失重率的效果可以通过wg的含量进行调控。

从图4b可以看出，随着浸泡时间的延长，三组支架的ph均有所升高，但是升高的幅度有所不同。3d0在前21天，ph变化上升较快，之后ph逐渐趋于平缓，最终ph稳定7.83。这是由于支架表面和内部存在大量的m-mcs，随着支架不断的降解，m-mcs释放的ca²⁺、mg²⁺和sio4^4-，使溶液处于弱碱的环境。3d10在整个浸泡周期ph的上升趋势不大，最终ph在7.70左右浮动。这是由于3d10中加入了wg，wg降解后溶液显酸性，使得总体溶液ph有所下降。而3d20中加入的wg较多，最终其溶液ph变化最小，在浸泡84天后，稳定在7.47附近。人体体液ph正常情况下处于弱碱环境(约7.4)，只有在弱碱条件下，才能保证细胞正常的代谢和基体的正常进行。此外，支架3d15具有与支架3d10和3d20相近的效果。

效果实施例3复合支架3d0/3d10/3d20体外生物活性测试

本发明复合支架体外生物活性的评价是通过在37℃模拟体液(sbf)中浸泡7天，观察其羟基磷灰石的生长情况来判定。sbf溶液中的化学成分主要有nacl、nahco3、kcl、k2hpo4·3h2o、mgcl2·6h2o、hcl(1mol/l)、cacl2、na2so4和nh2ch2oh，最后用hcl(0.5mol/l)调节溶液ph＝7.4。

将支架样品(3d0，3d10，3d20，φ12×2mm)浸泡在sbf溶液中，浸泡比例为20ml/g。放于37℃温度、100％湿度、60r/min恒温振荡箱中，浸泡7天。用去离子水清洗材料表面，并在50℃下烘干24h。采用sem对支架3d0/3d10/3d20进行表面形态观察。采用xrd于广角(10-80°)进行测试，对样品3d0/3d10/3d20的成分、结构进行分析。

分别在0、1、3、5、9和14天时，在3d20的sbf浸泡液中提取1ml液体，用去离子水稀释10倍。采用等离子体发射光谱仪(icp，icpe-9000，日本岛津)，检测3d20各个时间段的sbf溶液中ca、mg、si和p离子的浓度。测试结果见图5/6/7。

从图5可以看出，支架表面均有球状物质生成，后续实验可以进一步证明其为羟基磷灰石(ha)。3d0表面生成的球状ha比较分散，其直径普遍≤5μm(图5a，b)。3d10在sbf浸泡7天后生成的球状羟基磷灰石比较密集，且其直径在5-7μm之间(图5c，d)。3d20表面完全被球状羟基磷灰石所覆盖，生成的羟基磷灰石的尺寸更大，其直径约为8±1μm(图5e，f)。所以3d20可以良好的诱导ha的产生，具有较好的生物活性。

从图6可计算化学计量羟基磷灰石ca/p≈1.67。3d20表面覆盖的微球晶体主要成分有ca和p，且ca/p≈1.61，与ha化学计量基本相符。

从图7可以看出，在整个浸泡周期过程中，ca和p离子的浓度一直保持下降趋势，而si和mg离子呈现出上升趋势，这一结果主要由于3d20多孔支架的降解和m-mcs结构的破坏所导致。结果表明，3d20支架浸泡在sbf中，ha逐渐形成，有较好的体外生物活性。

效果实施例4复合支架3d0/3d10/3d20的细胞实验

本实施例的细胞实验按照以下方法进行：

首先将从液氮中取出的小鼠成骨细胞(mc3t3-e1)，然后将融化的细胞悬液转移到离心管中离心10分钟，取下面沉淀物，并加入10ml含10％胎牛血清的dmem(gibco公司)培养液，反复离心弃上清液，最终将细胞放入含有上述培养液的培养皿中，37℃、100％湿度和5％co2条件下培养，每两天更换一次培养液，待mc3t3-e1生长成为细胞株，用0.25％的trypsin和0.03％的edta混合溶液处理。

将支架样品(3d0，3d10，3d20，φ12×2mm)灭菌处理放入24孔板中，将剥离后的细胞种在样品表面，接种密度为2×10⁴个/孔。

①细胞形态观察

具体方法为：在培养的第12小时、1天、3天和7天时，用pbs清洗支架样品，再用2.5％的戊二醛溶液固定，用于sem观察。

sem观察：在培养第12小时、1天、3天时，用pbs清洗样品2-3次，将戊二醛固定液洗净，然后依次用1ml的10％、30％、50％、70％、85％和90％乙醇溶液脱水处理，每次时间为15min，最后再用100％无水乙醇脱水两次。将样品在37℃下烘干。采用sem对支架(gcwg，20m-gcwg，40m-gcwg)进行表面的细胞形态观察。

②细胞增殖测定

用mtt法测定mc3t3-e1细胞的增殖性。具体方法为：在细胞培养第1、3和5天时，每孔加入100μl5％mtt液(sigmaaldrichchemistry)，37℃培养4h，然后加入200μl二甲基亚砜(dmso)，最后用酶标仪在570nm处，测吸光度值(o.d.)。

③细胞分化

用alp活性来评估mc3t3-e1细胞的分化功能。具体方法为：在细胞培养第7、10和14天时，用含50mg/l10％胎牛血清、抗坏血酸和10mmol/lβ-甘油磷酸钠的α-mem培养，弃诱导液，用pbs清洗3次，加入250μl细胞裂解液，反复冻融，离心后取细胞裂解液上清液，用alp检测试剂盒(sigmaaldrichchemistry)在405nm处，测定相应的吸光度值(o.d.)。

本发明实验中所得数据均重复5次，以平均值±标准偏差的形式表示，并由origin8.0(originlabcorporation，usa)软件进行分析处理。统计学上的数据组间差异比较采用方差分析(anova)。统计数据在可信度大于95％(p<0.05)的条件下获得。

实验结果见图8/9/10。

从图8可以看出，在培养第12小时，细胞形态主要呈长条状和纺锤状，3d20细胞数目略多(图8a，d，g)。在培养第1天时，细胞伸出伪足呈现出多边形，3d0细胞单独存在，而3d10和3d20上的细胞群主要沿着凸起周围粘附和生长(图8b，e，h)。在培养第3天时，细胞逐渐在三组支架材料上铺展，细胞数量开始增多，3d20的细胞形态更好、数目多，细胞交错生长在一起(图8c，f，i)。

实验结果分析：细胞在3d0、3d10和3d20支架上的粘附形态和生长状况良好，说明这三种3d打印支架无细胞毒性。3d20支架更利于细胞的粘附、铺展。细胞行为受生物材料的粗糙度所影响，3d20支架有较多的凸起形貌，高低凸起的粗糙形貌可以提高材料的表面能，也可以增大细胞与材料的接触面积，相关研究表明，在细胞附着的初始阶段，如果材料的表面能比较高，则助于细胞的粘附和铺展。而且由于添加wg，使3d20溶液呈弱碱性，更适合细胞的粘附、铺展和生长。

从图9可以看出，在培养第1天时，三组细胞的增殖率都比较低，但是3d10和3d20稍高于3d0。在培养第3天和第5天时，3d20细胞增殖率大幅度提升，明显高于其他两组。这是由于添加wg，使3d20溶液呈弱碱性，是细胞成长所需的ph环境，且3d20的降解性更好，m-mcs释放mg、ca和si离子发生协同作用可以促进细胞的增殖。所以3d20可以促进细胞的增殖和生长。

从图10可以看出，在培养第7天时，3d0和3d10的alp活性无明显差别，而3d20比较高。在培养第10和第14天时，三组3d打印支架的alp活性都逐渐提高，其中3d20明显升高。3d20的弱碱性溶液适合细胞生长所需的微环境，且3d20的降解性较好，从而释放更多的mg、ca、si离子，能显著促进细胞的成骨分化能力。此外，支架3d15具有与支架3d10和3d20相近的效果。

效果实施例5复合支架3d0/3d10/3d20体内生物相容性研究

①兔股骨模型植入实验

本实施例中动物实验使用的支架样品是φ6×6mm的3d0、3d10和3d20。构建兔右侧股骨缺损作为动物模型。实验过程如图11所示。

所有手术过程及动物饲养均在国家组织工程技术研究中心(上海，中国)进行，由当地伦理委员会批准，选取2-3个月龄新西兰大白兔18只(体重约2.5kg/只)，随机平均分成三组，每组9只分别植入一种支架样品。

动物实验在无菌手术室进行。麻醉剂用量按动物体重计算(25mg/kg舒泰和0.15ml/kg2％rompon)，经肌肉注射后进行全身麻醉。新西兰大白兔右后肢剃毛、消毒，按俯卧位放置在手术台上。右侧股骨髁部位取约长1cm的切口，逐层分离皮肤、肌肉、骨膜等组织，显露兔股骨外髁。选用骨科钻孔器，沿股骨纵轴和矢状轴垂直方向制造6mm×6mm圆柱腔骨洞缺损，上述三种支架分别植入兔骨缺损模型，逐层严密缝合创口，在伤口表面涂抹碘伏进行伤口消毒。术后单笼饲养，正常喂食，连续3天肌肉注射青霉素以消炎。

分别于术后4，8和12周通过注射过量戊巴比妥钠处死动物，取出缺损修复部位，剥除肌肉组织后获得骨样标本。拍摄数码照片，对骨缺损情况进行大体观察。然后使用10％中性福尔马林缓冲液来固定标本，进行各种检测。

②大体观察

支架样品3d0、3d10和3d20植入兔股骨内1，2和3个月后的数码照片结果见图12。

支架植入1个月后，三组支架降解量均比较少，宏观上明显可见。骨缺损部位的未得到显著修复，表面与内部的骨缺损都比较明显。3d0支架与骨缺损边界依然存在明显的边界空隙，尚未得到较好的修复，而3d10的支架与缺损部位结合较紧密。有少量骨组织长入3d20支架边界，支架边界与骨缺损部位比较模糊。

支架植入2个月后，三组支架缺损部位均有愈合趋势，支架也进一步降解。3d0未修复区域依然较大，但是缺损部位与支架材料的边界消失，骨组织逐渐长入支架。3d10缺损表面有明显的愈合趋势。而3d20材料降解较快，与此同时骨缺损部位只剩下很小的孔洞尚未修复，新生骨组织与原骨组织已紧密结合。

支架植入3个月后，三组支架缺损部位基本得到愈合，外观上看到的材料比较少。3d0和3d10依然存在比较小的未修复缺损，但是新生骨组织已经长入支架内部区域，骨组织与材料紧密结合。而3d20缺损部位愈合平整，表面完全被新生骨所包裹，且骨组织比较致密。此外，支架3d15具有与支架3d10和3d20相近的效果。

结果显示，3d20具有较好的组织相容性和成骨性，材料降解的同时，可以有效促进新生骨组织的再生。

③同步辐射micro-ct成像

利用上海光源bl13w1线站对实验骨头样品进行二维和三维成像。用动态x射线同轴位相衬度成像、显微断层成像等可对材料进行高分辨、无损的成像研究。被单色化的x射线与样品的各个部位发生菲涅耳衍射，带有样品信息的光线被探测器接收，从而得到相应的图像。

本实验中，将样品固定在操作台上，成像距离1.6m，旋转角度180°，再使用vhr对每个样品采集1600张ct图像。最后用imageproplus6.3、vgstudiomax处理图像信息。结果见图13和图14。

从图中可以看出，支架植入1个月后，两组支架的缺损部位均未得到较好的修复，但是可以看到少量的骨组织沿着支架的骨架生长。3d0未修复面积较大，新骨在松质骨有少量的修复，而皮质骨部位几乎未得到修复。3d20松质骨有较多的新生骨生成，而皮质骨的修复效果不好。

支架植入2个月后，大量骨组织沿着支架的骨架生长，支架边缘的新生骨与原骨组织紧密结合。3d0的新生骨组织在皮质骨、松质骨的生成量都比较少。3d20未修复区域比较少，骨小梁开始重建并向支架的中心部位生长延伸。

支架植入3个月后，在3d0中，可以清晰的看到，无论是松质骨还是皮质骨，新生骨组织沿着支架有序的排列生长，且新骨生成量显著增多；而在3d20中，皮质骨已得到愈合，松质骨的新生骨不仅沿着支架骨架有序生长，且相邻骨架的新生骨组织相互连接。此外，支架3d15具有与支架3d10和3d20相近的效果。

结果显示，3d20支架具有良好成骨性，能有效促进新生骨的再生并促进骨缺损的愈合。