IL‑2蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用的制作方法

本发明涉及养殖领域，具体涉及il-2蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用。
背景技术：
：鱼类和水产品仍是目前全世界人类的食品和营养获取的重要来源。目前，虹鳟是多数国家商品化冷水鱼的重要组成，但是随着养殖密度的加大和养殖环境的恶化，虹鳟养殖时常遭受传染性病害的威胁。疫苗被证实是防治虹鳟致病微生物侵害的有效手段。许多国家鉴于生物安全的顾虑限制活疫苗的使用，而灭活疫苗或基因工程疫苗却在某些情况下无法提供预期的保护效果。此外，注射免疫是目前鱼类疫苗接种的主要方式，该方式不仅耗时、耗力，更是不适宜于幼鱼免疫。从经济角度来讲，口服免疫是鱼类疫苗接种的理想途径。但是单独的经口投递抗原激发的免疫反应常常较弱。佐剂是可通过增强抗原诱导特异性免疫反应的能力和持续性来提高疫苗的有效性。诸多实验表明鱼类疫苗中佐剂的使用可从不同角度对疫苗的免疫效果进行优化。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何提高动物疫苗的有效性。为解决上述技术问题，本发明首先保护了il-2蛋白的应用，il-2蛋白的应用可为a1)至a6)中的至少一种：a1)制备动物疫苗佐剂；a2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；a3)提高动物机体中中和抗体的效价；a4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖；a5)提升动物疫苗的保护力；a6)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品。上述应用中，所述il-2蛋白可为b1)至b6)中的任一种：b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；b2)在序列表中序列2所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；b3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；b4)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；b5)在序列表中序列4所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；b6)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。上文中，将序列表中序列4所示的il-2蛋白自n端起第1至20位去除，即得到序列表中序列2所示的il-2蛋白。本领域技术人员一般认为去除的这20个氨基酸序列编码信号肽，不影响il-2蛋白具体的功能。编码所述il-2蛋白的核酸分子，或，含有编码所述il-2蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌，的应用，为a1)至a6)中的至少一种：a1)制备动物疫苗佐剂；a2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；a3)提高动物机体中中和抗体的效价；a4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖；a5)提升动物疫苗的保护力；a6)制备促进动物机体对抗原的免疫应答的产品。上述应用中，所述重组载体可为重组质粒pil-2。所述重组质粒pil-2的构建过程如下：(1)提取虹鳟的总rna，反转录，获得cdna第一条链；(2)以cdna第一条链为模板，以5’-aagcttttatgaacttagacgctttgc-3’和5’-gaattcgccaccatgaacccaattcccagactcct-3’为引物进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；(3)将pcr扩增产物和pmd18t载体连接，得到中间质粒；(4)取中间质粒，用限制性内切酶ecori和xhoi进行双酶切，回收约390bp的酶切产物；(5)取pcdna3.1载体，用限制性内切酶ecori和xhoi进行双酶切，回收约5.4kb的载体骨架；(6)将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒pil-2。重组质粒pil-2中含有序列表中序列1所示的dna分子。重组质粒pil-2表达序列表中序列2所示的il-2蛋白。上述应用中，所述核酸分子可为c1)至c6)中的任一种：c1)编码区如序列表中序列1所示的dna分子；c2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的dna分子；c3)编码区如序列表中序列3所示的dna分子；c4)核苷酸序列是序列表中序列3所示的dna分子；c5)与c1)或c2)或c3)或c4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述il-2蛋白的dna分子；c6)在严格条件下与c1)或c2)或c3)或c4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述il-2蛋白的dna分子。为解决上述技术问题，本发明还提供了一种产品，其含有t1)或t2)或t3)：t1)所述il-2蛋白；t2)编码所述il-2蛋白的核酸分子；t3)含有编码所述il-2蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。所述产品可具有如下f1)至f6)中至少一种功能：f1)动物疫苗佐剂；f2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；f3)提高动物机体中中和抗体的效价；f4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖；f5)提升动物疫苗的保护力；f6)促进动物机体对抗原的免疫应答。本发明还保护一种促进动物机体对抗原的免疫应答的方法，可包括如下步骤：在动物机体中表达所述il-2蛋白。本发明还保护一种提升动物疫苗的保护力的方法，可包括如下步骤：在动物机体中表达所述il-2蛋白。上述任一所述促进动物机体对抗原的免疫应答具体可体现为a2)至a4)中的至少一种：a2)增强动物机体中免疫相关基因的表达水平；a3)提高动物机体中中和抗体的效价；a4)促进动物机体中淋巴细胞的增殖。上述任一所述免疫相关基因可为igt基因、mx基因、viperin基因、cd4基因、cd8基因和tnf-α基因中的至少一种。上述任一所述疫苗可为核酸疫苗。所述核酸疫苗具体可为传染性造血器官坏死病核酸疫苗。上述任一所述抗原可为传染性造血器官坏死病毒g蛋白。上述任一所述传染性造血器官坏死病毒g蛋白可为d1)或d2)或d3)：d1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；d2)在序列表中序列6所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；d3)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。上述任一所述动物可为(h1)、(h2)、(h3)、(h4)、(h5)或(h6)：(h1)非人动物；(h2)鱼纲动物；(h3)鲑形目动物；(h4)鲑形科动物；(h5)太平洋鲑属动物；(h6)虹鳟(oncorhynchusmykiss)。实验证明，与注射传染性造血器官坏死病毒g蛋白的虹鳟相比，注射传染性造血器官坏死病毒g蛋白和il-2蛋白的虹鳟的igt基因、mx基因、viperin基因、cd4基因、cd8基因和tnf-α基因的表达水平显著提高，中和抗体的效价显著提高，淋巴细胞的增殖显著增强且传染性造血器官坏死病毒g蛋白的保护力有效提升。因此，il-2蛋白在制备动物疫苗佐剂中具有重要的应用价值。附图说明图1为重组质粒的鉴定。图2为实施例1步骤二中3的实验结果。图3为实施例1步骤二中4的实验结果。图4为实施例1步骤三中2的实验结果。图5为实施例2步骤三的实验结果。图6为实施例2步骤四的实验结果。图7为实施例2步骤六的实验结果。图8为实施例2步骤七的实验结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的虹鳟(oncorhynchusmykiss)为常规虹鳟鱼种，饲养于玻璃钢水族箱中，饲养温度为14-16℃。尼龙网为fisherscientific公司的产品；尼龙网的网格大小为70μm。rna提取试剂盒为promega公司的产品。pmd18t载体为takara公司的产品。pet32a载体为novagen公司的产品。trans2kdnamarker、trans15kdnamarker和m-mlv反转录试剂盒均为takara公司的产品，产品目录号分别为3427a、3582a和2640a。ni-ntaagarose为qiagen公司产品，产品目录号为30210。非预染蛋白marker为fermentas公司的产品，产品目录号为sm0431。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均为sigma公司的产品，产品目录号分别为f5881和f5506。balb/c小鼠为哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心的产品。pcdna3.1载体和脂质体转染试剂均为invitrogen公司的产品，产品目录号分别为v79020和l3000008。抗鼠fitc标记抗体、辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体和辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗均为abcam公司的产品，产品目录号分别为ab6785、ab6728和ab6721。pee12.4载体为lonzabiologics公司的产品。ficoll-paqueplus试剂为gehealthcare公司的产品。wst-1溶液为碧云天公司的产品，产品目录号c0036。ihnv-sn1203记载于如下文献中：徐黎明，刘红柏，尹家胜，卢彤岩.传染性造血器官坏死病毒-sn1203株的基因型及糖蛋白的生物信息学分析.中国水产科学.2014，21(1)：180-188.ihnv-sn1203的genbank号为kc660147.1。ihnvg截短蛋白记载于如下文献中：陶健，徐黎明，刘淼，赵景壮，曹永生，卢彤岩，尹家胜，刘红柏.传染性造血器官坏死病毒抗原表位富集区的原核表达及应用.淡水渔业，2015，45(2)，49-55.包被液：ph9.6、0.05mol/l的碳酸盐缓冲液。pbst缓冲液：将nacl8g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、kh2po40.24g和0.5mltween溶于1l去离子水。抗体稀释液：向ph7.4、0.01mmpbs缓冲液中加兔源虹鳟igm多克隆抗体至其含量为0.4％(v/v)。兔源虹鳟igm多克隆抗体记载于如下文献中：赵景壮，徐黎明，刘淼，曹永生，尹家胜，刘红柏，卢彤岩.虹鳟igm重链恒定区的表达及兔抗血清的制备,水产学报，2014，38(8)，1175-1181.lysisbuffer溶液：含100mmnah2po4和8murea的ph8.0、10mm的tris·hcl缓冲液。底物溶液：由100μla液(将0.0125gtmb溶解于80％(v/v)dmso水溶液)和5mlb液(将过氧化氢尿素0.05g、柠檬酸1.057g和na2hpo4·12h2o3.94g溶于100ml去离子水，调节ph值至4.0)混合而成。实施例1、佐剂的制备及其生物学活性的鉴定一、虹鳟il-2基因的克隆根据虹鳟il-2基因的核苷酸序列(genbank：nm_001164065.1)，设计并人工合成引物f1：5’-ggatccaacccaattcccagactcct-3’(单下划线为限制性内切酶bamhi的识别位点)、引物r1：5’-aagcttttatgaacttagacgctttgc-3’(单下划线为限制性内切酶hindⅲ的识别位点)、引物f2：5’-gaattcatgaacccaattcccagactcct-3’(单下划线为限制性内切酶ecori的识别位点，双下划线为kozak序列)和引物r2：5’-ctcgagtcatgaacttagacgctttgc-3’(单下划线为限制性内切酶xhoi的识别位点)。1、处死虹鳟，迅速于冰上无菌剥取脾脏，然后加入适量含10％(v/v)fbs的mem培养基，注射器内柱碾压后，用尼龙网过滤，收集细胞滤液。2、取细胞滤液，加入浓度为5μg/ml的植物血凝素溶液(将植物血凝素溶解于ph7.4、0.01mmpbs缓冲液得到)，15℃静置培养4h。3、完成步骤1后，弃培养液，收集细胞并采用rna提取试剂盒提取总rna，按照m-mlv反转录酶说明书，以引物oligo(dt)18进行反转录，获得cdna第一条链。4、以cdna第一条链为模板，采用引物对甲(由引物f1和引物r1组成)进行pcr扩增，得到381bp的pcr扩增产物甲。以cdna第一条链为模板，采用引物对乙(由引物f2和引物r2组成)进行pcr扩增，得到390bp的pcr扩增产物乙。5、将pcr扩增产物甲和pmd18t载体连接，得到重组质粒甲。将pcr扩增产物乙和pmd18t载体连接，得到重组质粒乙。将重组质粒甲和重组质粒乙分别进行测序。测序结果表明，重组质粒甲和重组质粒乙中均含有序列表中序列1自5’末端起第1至366位所示的dna分子。将序列表中序列1所示的dna分子命名为虹鳟il-2基因。二、多克隆抗体的制备1、重组质粒pet32a-il-2的构建(1)取重组质粒甲，用限制性内切酶bamhi和hindⅲ进行双酶切，回收约381bp的酶切产物甲。(2)取pet32a载体，用限制性内切酶bamhi和hindⅲ进行双酶切，回收约5.9kb的载体骨架甲。(3)将酶切产物甲和载体骨架甲进行连接，得到重组质粒pet32a-il-2。(4)取重组质粒pet32a-il-2，分别进行pcr鉴定(采用引物对甲进行)、单酶切鉴定(采用限制性内切酶bamhi进行)和双酶切鉴定(采用限制性内切酶bamhi和hindⅲ进行)。实验结果见图1中a(m1为trans2kdnamarker，m2为trans15kdnamarker)，泳道1为pcr鉴定，泳道2为单酶切鉴定，泳道3为双酶切鉴定)。(5)将重组质粒pet32a-il-2进行测序。根据pcr鉴定、酶切鉴定和测序结果，对重组质粒pet32a-il-2进行结构描述如下：将pet32a载体的限制性内切酶bamhi和hindⅲ识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的dna分子。重组质粒pet32a-il-2中，序列表的序列1所示的dna分子与载体骨架甲上的his-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成融合基因，表达具有his-tag标签的融合蛋白。2、融合蛋白的表达(1)将重组质粒pet32a-il-2导入大肠杆菌rosetta，得到重组菌，将该重组菌命名为rosetta－pet32a-il-2。(2)取rosetta－pet32a-il-2单克隆，接种至5mllb液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素(amp))，37℃、180rpm振荡培养12h，得到培养菌液。(3)取培养菌液，按体积比为1:100接种至500mllb液体培养基(含100μg/mlamp)，37℃、180rpm振荡培养至od600nm值达到0.4～0.6，然后加入iptg并使其浓度为1mm，37℃、120rpm振荡培养4h，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体沉淀。(4)完成步骤(3)后，取菌体沉淀，加入ph8.0、100mm的tris-hcl缓冲液重悬，超声破碎(超声波功率600w，循环程序为：破碎4s，停6s，共20min)，然后4℃、10000rpm离心10min，得到菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。将菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀分别进行sds-page。结果表明，融合蛋白主要存在于包涵体，大小约为33.7kda。3、融合蛋白的纯化(1)取步骤2中(4)得到的菌体破碎沉淀，加入6mllysisbuffer溶液重悬，然后4℃静置直至沉淀完全溶解，经0.45μm过滤器过滤，得到溶解液。(2)向层析柱中加入2mlni-ntaagarose，采用重力法或低速离心法进行沉淀，然后轻轻吸去上清，再依次加入6ml去离子水清洗和6mllysisbuffer溶液(经0.45μm过滤器过滤)润洗，来回旋转3min，弃液体。(3)完成步骤(2)后，向所述层析柱中加入步骤(1)得到的溶解液，4℃来回旋转60min(目的为使ni2+与融合蛋白充分结合)，弃液体。(4)完成步骤(3)后，重复如下步骤三次：向所述层析柱中加入5mlwashbuffer1(含100mmnah2po4和8murea的ph6.0、10mmtris·hcl缓冲液)，来回旋转3min，弃液体。(5)完成步骤(4)后，重复如下步骤三次：向所述层析柱中加入5mlwashbuffer2(含100mmnah2po4和8murea的ph5.3、10mmtris·hcl缓冲液)，来回旋转3min，弃液体。(6)完成步骤(5)后，重复如下步骤三次：向所述层析柱中加入2mlelutionbuffer(含100mmnah2po4和8murea的ph4.5、10mmtris·hcl缓冲液)，来回旋转3min，收集液体。(7)检测步骤(6)收集的液体的od280nm，然后4℃透析，收集透析产物。(8)完成步骤(7)后，将透析产物进行sds-page。washbuffer1、washbuffer2和elutionbuffer均经0.45μm过滤器过滤。实验结果见图2(m为非预染蛋白marker)，泳道1为透析产物，箭头为融合蛋白)。结果表明，透析产物即为融合蛋白溶液。经检测，融合蛋白溶液中融合蛋白浓度约为0.325mg/ml。4、多克隆抗体的制备(1)将1体积份融合蛋白溶液(含200μg融合蛋白)和1体积份弗氏完全佐剂混合，乳化，得到混合液甲。将1体积份融合蛋白溶液(含200μg融合蛋白)和1体积份弗氏不完全佐剂混合，乳化，得到混合液乙。(2)取混合液甲，经背、腹等部位皮下多点注射至5只balb/c小鼠(每只balb/c小鼠注射混合液甲的体积相同)。(3)完成步骤(2)的第14d，经背、腹等部位皮下多点注射至5只balb/c小鼠(每只balb/c小鼠注射混合液乙的体积相同)。(4)完成步骤(2)的第35d，分别对balb/c小鼠的尾静脉采血，分离血清；然后采用间接elisa法测定抗血清效价。具体步骤如下：a、用包被液稀释步骤3得到的融合蛋白溶液，得到蛋白溶液；b、取微孔板，每孔加入蛋白溶液(含0.1μg融合蛋白)，用封口膜封好，4℃、50rpm包被12h，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；c、完成步骤b后，每孔加入含5％(v/v)脱脂乳的pbst缓冲液，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；d、完成步骤c后，每孔加入2倍倍比稀释的步骤(4)分离的血清，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；5、完成步骤4后，每孔加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体，用封口膜封好，37℃静置30min，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；7、完成步骤6后，每孔加入100μl底物溶液，避光显色15min，然后每孔加入70μl浓度为1m的h2so4水溶液，测量各孔在450nm处的od值。部分实验结果见图3(3只小鼠血清为步骤(4)分离的血清(即免疫小鼠血清)，混合阴性血清为3只未免疫小鼠血清的混合液)。结果表明，经过免疫的小鼠(即依次注射混合液甲和混合液乙的小鼠)的血清的最终效价超过1:25600，完全可以满足后续实验需求。(5)完成步骤(4)后，将经过免疫的小鼠通过眼球采血，然后分离血清，冻存于-20℃备用。该血清即为制备的多克隆抗体。三、佐剂的制备及其生物学活性的鉴定1、佐剂的制备本发明提供的佐剂即重组质粒pil-2。(1)取步骤一中6构建的重组质粒乙，用限制性内切酶ecori和xhoi进行双酶切，回收约390bp的酶切产物乙。(2)取pcdna3.1载体，用限制性内切酶ecori和xhoi进行双酶切，回收约5.4kb的载体骨架乙。(3)将酶切产物乙和载体骨架乙进行连接，得到重组质粒pil-2。(4)取重组质粒pil-2，分别进行pcr鉴定(采用引物f2和引物r2组成的引物对乙进行)、单酶切鉴定(采用限制性内切酶ecori进行)和双酶切鉴定(采用限制性内切酶ecori和xhoi进行)。实验结果见图1中b(m1为trans2kdnamarker，m2为trans15kdnamarker，泳道1为pcr鉴定，泳道2为单酶切鉴定，泳道3为双酶切鉴定)。(5)将重组质粒pil-2进行测序。根据pcr鉴定、酶切鉴定和测序结果，重组质粒pil-2中含有序列表中序列1所示的dna分子。重组质粒pil-2表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下简称il-2蛋白或蛋白质il-2)。2、佐剂的生物学活性的鉴定虹鳟性腺细胞rtg-2为atcc(网址为：https://www.atcc.org)的产品，产品编号为ccl-55。(1)取24孔板，每孔加入1.0×105个虹鳟性腺细胞rtg-2和0.3ml含10％(v/v)新生犊牛血清的mem培养基，5％co2、15℃培养至细胞单层达到40-60％。(2)向完成步骤(1)的体系中加入1-3μg重组质粒pil-2，然后采用脂质体转染试剂进行转染(具体参考脂质体转染试剂说明书的操作步骤)。(3)取完成步骤(2)的体系，5％co2、15℃培养48h，然后用4％(v/v)多聚甲醛水溶液固定，再用ph7.4、0.01mm的pbs缓冲液洗涤3次。(4)取完成步骤(3)的体系，加入200μl多克隆抗体稀释液(由49体积份ph7.4、0.01mm的pbs缓冲液和1体积份步骤二制备的多克隆抗体混合而成)，37℃孵育1h，然后用ph7.4、0.01mm的pbs缓冲液洗涤3次。(5)取完成步骤(4)的体系，加入200μl抗鼠fitc标记抗体稀释液(由999体积份ph7.4、0.01mm的pbs缓冲液和1体积份抗鼠fitc标记抗体混合而成)，37℃孵育30min，然后用ph7.4、0.01mm的pbs缓冲液洗涤3次。(6)完成步骤(5)后，置于荧光倒置显微镜下观察，记录结果。按照上述步骤，将步骤(2)中的重组质粒pil-2替换为pcdna3.1载体，其它步骤均不变，作为对照。实验结果见图4(a为重组质粒pil-2，b为对照)。结果表明，重组质粒pil-2可在虹鳟性腺细胞rtg-2中高水平的表达，具有生物学活性，可以进行下一步体内实验。实施例2、实施例1制备的佐剂的应用一、dna疫苗(重组质粒pee12.4-g)的制备1、人工合成序列表中序列5所示的双链dna分子并以其为模板，采用引物对丙(由引物f3：5’-gaattcatggacaccatgatcaccactccg-3’(单下划线为限制性内切酶ecori的识别位点)和引物r3：5’-ggatcctcaggaccggtttgccaggtgat-3’(单下划线为限制性内切酶bamhi的识别位点)组成)进行pcr扩增，得到1539bp的pcr扩增产物丙。2、取pcr扩增产物丙，用限制性内切酶ecori和bamhi进行双酶切，回收约1539bp的酶切产物丙。3、取pee12.4载体，用限制性内切酶ecori和bamhi进行双酶切，回收约6.9kb的载体骨架丙。4、将酶切产物丙和载体骨架丙进行连接，得到重组质粒pee12.4-g。将重组质粒pee12.4-g进行测序。根据测序结果，对重组质粒pee12.4-g进行结构描述如下：将pee12.4载体的限制性内切酶ecori和bamhi识别序列间的小片段替换为序列表中序列5所示的dna分子。重组质粒pee12.4-g表达序列表中序列6所示的蛋白质(即传染性造血器官坏死病毒g蛋白，以下简称g蛋白)。重组质粒pee12.4-g即为制备的dna疫苗。二、免疫将180尾体重为9.5-10.5g的虹鳟随机分成联合免疫组、单独免疫组和对照组(每组60尾)，分别进行如下处理：联合免疫组：肌肉注射重组质粒pee12.4-g和重组质粒pil-2。注射剂量为2.5μg重组质粒pee12.4-g/尾和2.5μg重组质粒pil-2/尾。单独免疫组：肌肉注射重组质粒pee12.4-g。注射剂量为2.5μg重组质粒pee12.4-g/尾。对照组：肌肉注射pcdna3.1载体。注射剂量为2.5μgpcdna3.1载体/尾。三、实施例1制备的佐剂对免疫相关基因表达的影响1、完成步骤二后的第3d，各组处死3尾虹鳟，然后迅速于冰上无菌剥取脾脏。2、分别取脾脏，进行液氮研磨后采用rna提取试剂盒提取总rna，然后采用m-mlv反转录试剂盒获得cdna。3、以步骤3得到的cdna为模板，通过荧光定量pcr检测脾脏中igm基因、igt基因、mx基因、viperin基因、cd4基因、cd8基因和tnf-α基因的的相对表达量(以β-actin基因为内参基因)。鉴定igm基因、igt基因、mx基因、viperin基因、cd4基因、cd8基因、tnf-α基因和β-actin基因的引物的核苷酸序列详见表1。其中荧光定量pcr上样体系为25μl，由0.5μl上游引物(浓度为10μm)、0.5μl下游引物(浓度为10μm)、12.5μlsybrpremixextaq(tlirnasehplus)(2×conc.)、2μl模板溶液、0.5μlroxreferencedye(50×conc.)和9μlddh2o组成。上游引物即表1中引物名称中含有“sense”的引物，下游引物即表1中引物名称中含有“anti”的引物。premixextaqtm(tlirnasehplus)为takara公司的产品，产品目录号为rr420a。sybrpremixextaq(tlirnasehplus)(2×conc.)和roxreferencedye(50×conc.)均为premixextaqtm(tlirnasehplus)中的组件。表1将对照组中免疫相关基因(igm基因、igt基因、mx基因、viperin基因、cd4基因、cd8基因或tnf-α基因)的相对表达量作为1，联合免疫组和单独免疫组中免疫相关基因的相对表达量见图5(pee12.4-g为单独免疫组，pee12.4-g+pil-2为联合免疫组)。免疫相关基因表达采用单因素方差分析进行比较，t检验用于成对样品间的比较，p<0.05为差异显著。结果表明，联合免疫组中igt基因、mx基因、viperin基因、cd4基因、cd8基因和tnf-α基因的表达水平均显著高于单独免疫组(p<0.05)，联合免疫组中igm基因的表达水平也高于单独免疫组，但差异不显著。四、实施例1制备的佐剂对特异性igm抗体产生的影响分别在完成步骤二后的第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，采集各组3尾虹鳟的血液并分离血清，然后采用elisa方法检测血清中特异性igm抗体的水平。具体步骤如下：1、用包被液稀释ihnvg截短蛋白，得到浓度为0.001μg/μl的蛋白溶液；2、取微孔板，每孔加入100μl蛋白溶液，用封口膜封好，4℃、50rpm包被12h，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；3、完成步骤2后，每孔加入100μl含5％(v/v)脱脂乳的pbst缓冲液，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；4、完成步骤3后，每孔加入100μl血清稀释液(向pbst缓冲液中加血清至其含量为1％(v/v)，用封口膜封好，37℃静置1h，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；5、完成步骤4后，每孔加入100μl抗体稀释液，用封口膜封好，37℃静置30min，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；6、完成步骤5后，每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(工作浓度为1:120000，用ph7.4、0.01mmpbs缓冲液稀释)，用封口膜封好，37℃静置30min，然后弃上清，用pbst缓冲液洗涤三次，每次3min，滤纸上拍干；7、完成步骤6后，每孔加入100μl底物溶液，避光显色15min，然后每孔加入70μl浓度为1m的h2so4水溶液，测量各孔在450nm处的od值。实验结果见图6(pee12.4-g为单独免疫组，pee12.4-g+pil-2为联合免疫组，pcdna3.1为对照组)。结果表明，免疫后第7天，单独免疫组和联合免疫组中均有特异性igm抗体产生，免疫后第28天达到最高水平，单独免疫组和联合免疫组中特异性igm抗体的水平无显著差异。五、实施例1制备的佐剂对中和抗体效价的影响分别在完成步骤二后的第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，采集各组3尾虹鳟的血液并分离血清，然后采用pnt法(记载于如下文献中：ssristow，jdavila，selapatra，klauda.detectionandcharacterizationofrainbowtroutantibodyagainstinfectioushematopoieticnecrosisvirus，diseasesofaquaticorganisms，1993，15(2)，109-114.)检测血清中中和抗体效价。具体步骤如下：1、将血清置于56℃水浴灭活30min，冷却，得到待检血清；2、取细胞培养板，用mem培养基将待检血清做2倍系列稀释，每孔液体容量为50μl(即第1个孔加入50μl待检血清；第2个孔先加入50μl待检血清和50μlmem培养基，充分混匀，然后吸取50μl加入第3个孔；向第3个孔加入50μlmem培养基，充分混匀，然后吸取50μl加入第4个孔；依次类推)；3、完成步骤2后，每孔加入50μlihnv-sn1203(效价为100tcid50/50μl)，充分混匀，然后置于15℃温箱静置1h；4、完成步骤3后，将所述细胞培养板每孔中的液体转移至另一细胞培养板的对应孔中，置于15℃温箱静置1h，弃上清。5、完成步骤4后，每孔加入500μl含1％(v/v)甲基纤维素的mem培养基，待阴性对照出现明显噬斑后，弃上清，用结晶紫进行染色，记录各孔噬斑形成数量，噬斑减少50％的最高稀释度即为中和抗体效价。上述步骤中，将步骤2中的待检血清替换为健康虹鳟血清，其它步骤均不变，即为阴性对照。上述步骤中，将步骤2中的待检血清替换为ihnv-sn1203感染虹鳟血清，其它步骤均不变，即为阳性对照。上述步骤中，将步骤2中的待检血清替换为mem培养基，其它步骤均不变，即为病毒对照。上述步骤中，将步骤3中的ihnv-sn1203替换为mem培养基，其它步骤均不变，即为正常对照。实验结果见表2(效价>1:20的中和抗体认为是阳性)。结果表明，免疫后第14天，联合免疫组可诱导阳性中和抗体产生(1:40)，此时单独免疫组无阳性中和抗体产生；联合免疫组的中和抗体在免疫后第28天达到最高值，这一结果虽晚于单独免疫组7天，但在免疫后第35天联合免疫组中的中和抗体仍可维持在1:160，而单独免疫组中的中和抗体此时则下降至1:40，对照组在免疫后各周均未检测到阳性中和抗体。因此，实施例1制备的佐剂可以影响中和抗体效价。表2免疫后7天免疫后14天免疫后21天免疫后28天免疫后35天联合免疫组1:201:401:801:1601:160单独免疫组1:201:201:1601:801:40对照组<1:20<1:20<1:20<1:20<1:20六、实施例1制备的佐剂对淋巴细胞增殖的影响g蛋白记载于如下文献中：陶健，徐黎明，刘淼，赵景壮，曹永生，卢彤岩，尹家胜，刘红柏.传染性造血器官坏死病毒抗原表位富集区的原核表达及应用.淡水渔业，2015，45(2)，49-55.分别在完成步骤二后的第14天和第28天，将联合免疫组和单独免疫组各处死3尾虹鳟，迅速于冰上无菌剥取脾脏，然后采用mtt法测定淋巴细胞增殖指数。具体步骤如下：1、用注射器内柱碾压脾脏，经尼龙网过滤，然后采用ficoll-paqueplus试剂分离淋巴细胞，5000rpm离心3min，用无菌的ph7.4、0.01mmpbs缓冲液洗涤两次。2、完成步骤1后，向所述淋巴细胞中加入含10％(v/v)血清的mem培养基重悬，得到浓度为5×106个/ml的细胞悬浮液。3、取96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬浮液和50μl浓度为2μg/ml的g蛋白溶液(将g蛋白溶解于ph7.4、0.01mmpbs缓冲液得到)，5％co2、15℃培养60h，然后每孔加入10μlwst-1溶液继续培养2h，测量在450nm处的od值，即刺激孔的od450nm。4、按照步骤3的步骤，将浓度为2μg/ml的g蛋白溶液替换为浓度为5μg/mlpha水溶液，其它步骤均不变，得到对照孔的od450nm。计算刺激指数。刺激指数＝刺激孔的od450nm/对照孔的od450nm。实验结果见图7(pee12.4-g为单独免疫组，pee12.4-g+pil-2为联合免疫组)。结果表明，免疫后第14天，联合免疫组在pha的刺激下的刺激指数显著高于单独免疫组(p<0.05)；免疫后第28天，联合免疫组在pha或g蛋白刺激下的刺激指数显著高于单独免疫组(p<0.05)。因此，实施例1制备的佐剂可影响淋巴细胞的增殖。七、实施例1制备的佐剂对dna疫苗(即重组质粒pee12.4-g)的保护力的影响完成步骤二后的第28d，各组取30尾虹鳟，采用腹腔注射的方式，以ihnv-sn1203进行攻毒(剂量为300pfu/尾)，然后逐日观察鱼体健康情况，记录鱼的死亡数量，绘制累积存活率曲线。实验结果见图8(pee12.4-g为单独免疫组，pee12.4-g+pil-2为联合免疫组，pcdna3.1为对照组)。结果表明，攻毒后14天，单独免疫组的存活率(43.3％)显著高于对照组(13.3％)，而联合免疫组的保护率可达到80％。因此，实施例1制备的佐剂可从多角度对重组质粒pee12.4-g诱导的免疫反应进行优化，有效提升dna疫苗(即重组质粒pee12.4-g)的保护力。<110>中国水产科学研究院黑龙江水产研究所<120>il-2蛋白在制备动物疫苗佐剂中的应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>369<212>dna<213>虹鳟（oncorhynchusmykiss）<400>1aacccaattcccagactcctagctggaatcgattatctagaagaaaatattacatgtcca60gattcagtcttctatacaccaactgatgtagaggatagttgcattgttgcagcattggcc120tgttccattaaggaactggacactgtgaaagtagaatgcctcgataaagcggtccatctg180gaaagtatgcaacaccacatcagcatgactgccacggccctacaaaagacgattgataag240gagaacagcacaacggacacttcagaatgcatctgtgaagacaagcggttggaaaagtct300ttcaaggacttcattcagaacataagacatttaactcaagctcatgctgcaaagcgtcta360agttcataa369<210>2<211>122<212>prt<213>虹鳟（oncorhynchusmykiss）<400>2asnproileproargleuleualaglyileasptyrleuglugluasn151015ilethrcysproaspservalphetyrthrprothraspvalgluasp202530sercysilevalalaalaleualacysserilelysgluleuaspthr354045vallysvalglucysleuasplysalavalhisleuglusermetgln505560hishisilesermetthralathralaleuglnlysthrileasplys65707580gluasnserthrthraspthrserglucysilecysgluasplysarg859095leuglulysserphelysasppheileglnasnilearghisleuthr100105110glnalahisalaalalysargleuserser115120<210>3<211>429<212>dna<213>虹鳟（oncorhynchusmykiss）<400>3atggaccgtcgttacaggatttcctttttgacgctttttctcgccggttgtctacaagga60aacccaattcccagactcctagctggaatcgattatctagaagaaaatattacatgtcca120gattcagtcttctatacaccaactgatgtagaggatagttgcattgttgcagcattggcc180tgttccattaaggaactggacactgtgaaagtagaatgcctcgataaagcggtccatctg240gaaagtatgcaacaccacatcagcatgactgccacggccctacaaaagacgattgataag300gagaacagcacaacggacacttcagaatgcatctgtgaagacaagcggttggaaaagtct360ttcaaggacttcattcagaacataagacatttaactcaagctcatgctgcaaagcgtcta420agttcataa429<210>4<211>142<212>prt<213>虹鳟（oncorhynchusmykiss）<400>4metaspargargtyrargileserpheleuthrleupheleualagly151015cysleuglnglyasnproileproargleuleualaglyileasptyr202530leuglugluasnilethrcysproaspservalphetyrthrprothr354045aspvalgluaspsercysilevalalaalaleualacysserilelys505560gluleuaspthrvallysvalglucysleuasplysalavalhisleu65707580glusermetglnhishisilesermetthralathralaleuglnlys859095thrileasplysgluasnserthrthraspthrserglucysilecys100105110gluasplysargleuglulysserphelysasppheileglnasnile115120125arghisleuthrglnalahisalaalalysargleuserser130135140<210>5<211>1527<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5atggacaccatgatcaccactccgctcattctcattctaatcacctgtggagcaaacagc60caaacagtcccccccgacaccgcaagcgaatcagaccaacccacctggtcaaacccgctc120ttcacctaccccgagggatgcactctggacaaactctccaaggtcaatgcttctcaactg180agatgcccaaggatcttcgatgatgagaacagggggctaatttcttatcccgcctccatc240cggtccctggcggtcggaaacgacctcggggcgattcacacccaagggaactacatccac300aaagtcctgtaccgcaccatctgctcaacagggttcttcgggggtcagacgatagagaag360gtacttgtagaaatgaaactctcaacgagagaagcaggggcatatgacaccacaaccgcg420gccgctctgtacttcccagctccccgatgccaatggtacaccgacaacgtacaaaatgat480ctcatcttctactacacaacccaaaagagtgttctgagagatccctacaccagagacttc540ctggactcagattttgttggaggaaaatgcactaaatcaccctgccagactcattggtcc600aacgtagtttggattggtgatgcagggataccagcctgtgacgccagcccagaaataaac660ggtcacctctttgttgataaaatctccagtcgagccgtgaaggcaacgagctacggacac720cacccctggggactgcatcgggcctgtatgattgagttctgtgggaaacagtggatacgg780acagatctcggtgacctgatatctgtaggatacaattctggagcaaaaaccctctccttc840ccgaagtgtgaggacgagacggtggggatgaggggaaacctggatgactttgcctatcta900gacgacctggtgaaggcctcagagagcagagaggaatgtcttgaggcgcatgccgagata960atatcaacaaacagtgtgactccatacctcctatccaagttccgatctccacatcccgga1020ataaatgacgtctacgctatgcacaaaggctccatctatcatgggatgtgcatgacggtc1080gctgtggacgaggtatccaaggacaggacgacgtacagggcccatcacgccaccaacttc1140actaaatgggaacgaccctttggggatgagtgggaaggctttcacggattgcacggaaac1200aacatcaccattattccagacctggagaaatacgtcgcccagtacaagatgagcatgatg1260gaaccgatgggcatcaaatccgtaccccatccaagcatcctggccttctacaatgagaca1320gaagtatcggggatctccatcaggaaattggactcgttcgaccttcaatcactccactgg1380agtttctggcccacaatctccacactgggtgggattcccctggttctcctccttgctgtt1440gccgcgtgctgctgctggtcagggagacttcccactccctccgcgccgcagagtatcccc1500atgtatcacctggcaaaccggtcctga1527<210>6<211>508<212>prt<213>人工序列<220><223><400>6metaspthrmetilethrthrproleuileleuileleuilethrcys151015glyalaasnserglnthrvalproproaspthralasergluserasp202530glnprothrtrpserasnproleuphethrtyrprogluglycysthr354045leuasplysleuserlysvalasnalaserglnleuargcysproarg505560ilepheaspaspgluasnargglyleuilesertyrproalaserile65707580argserleualavalglyasnaspleuglyalailehisthrglngly859095asntyrilehislysvalleutyrargthrilecysserthrglyphe100105110pheglyglyglnthrileglulysvalleuvalglumetlysleuser115120125thrargglualaglyalatyraspthrthrthralaalaalaleutyr130135140pheproalaproargcysglntrptyrthraspasnvalglnasnasp145150155160leuilephetyrtyrthrthrglnlysservalleuargaspprotyr165170175thrargasppheleuaspseraspphevalglyglylyscysthrlys180185190serprocysglnthrhistrpserasnvalvaltrpileglyaspala195200205glyileproalacysaspalaserprogluileasnglyhisleuphe210215220valasplysileserserargalavallysalathrsertyrglyhis225230235240hisprotrpglyleuhisargalacysmetilegluphecysglylys245250255glntrpileargthraspleuglyaspleuileservalglytyrasn260265270serglyalalysthrleuserpheprolyscysgluaspgluthrval275280285glymetargglyasnleuaspaspphealatyrleuaspaspleuval290295300lysalasergluserarggluglucysleuglualahisalagluile305310315320ileserthrasnservalthrprotyrleuleuserlyspheargser325330335prohisproglyileasnaspvaltyralamethislysglyserile340345350tyrhisglymetcysmetthrvalalavalaspgluvalserlysasp355360365argthrthrtyrargalahishisalathrasnphethrlystrpglu370375380argpropheglyaspglutrpgluglyphehisglyleuhisglyasn385390395400asnilethrileileproaspleuglulystyrvalalaglntyrlys405410415metsermetmetgluprometglyilelysservalprohisproser420425430ileleualaphetyrasngluthrgluvalserglyileserilearg435440445lysleuaspserpheaspleuglnserleuhistrpserphetrppro450455460thrileserthrleuglyglyileproleuvalleuleuleualaval465470475480alaalacyscyscystrpserglyargleuprothrproseralapro485490495glnserilepromettyrhisleualaasnargser500505当前第1页12