一种药物组合物的应用的制作方法

本发明属于医药技术和保健食品领域，具体涉及四种多肽在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝及肥胖症的药物和保健食品中的应用。

背景技术：

非酒精性脂肪肝(nafld)是由于多种原因引起的一种代谢性肝病，主要表现为以甘油三酯为主要成分的脂质在肝细胞内异常过量沉积，其疾病谱包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化。据统计，非酒精性脂肪肝在西方发达国家的发病率约为30％，而在亚洲国家的发病率达到40％以上，在肥胖患者和2型糖尿病患者中的发病率更是高达90％。nafld的发病机制目前较为公认的是“二次打击”学说。第一次打击是胰岛素抵抗，伴随肝细胞脂质积累，在此基础上氧化应激引起细胞损伤，产生大量促炎因子，包括肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactorα,tnf-α)、白介素1(interleukin1，il-1)和白介素6(interleukin6，il-6)等，导致肝组织炎症、肝细胞损伤和调亡，此谓第二次打击。治疗非酒精性脂肪肝可通过改善胰岛素抵抗，降低肝脏组织炎症和抑制肝脏脂质积累等途径实现。目前，尚未有针对脂肪肝的药物面世，主要通过控制饮食和部分治疗糖尿病药物如glp-1及其类似药物来治疗脂肪肝，效果不理想。

肥胖症(obesity)是常见的代谢综合症，在发达国家发病率极高，当下我国发病率猛速提升。肥胖症可引起高血压、心脑血管疾病，结石症和痛风。肥胖分无明显病因的单纯性肥胖和有明确病因的继发性肥胖。后者，解除病因，加上节制饮食和注意运动，病情可缓解和恢复正常。对单纯性肥胖症，还没有良好药物治疗，目前是采用对身体有危害甚至危险的措施，虽然种类繁多，但归纳起来不外乎如隐性饥饿、药物泄吐、外科切除和吸出的办法达到减肥目的。

技术实现要素：

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种包含从大豆和豌豆等豆科植物中提取多肽作为药物组合物的活性成分，解决了现有技术的对非酒精性脂肪肝及肥胖症缺医少药和不当治疗问题。

按照本发明的一个方面，提供了一种药物组合物在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用，所述药物组合物的活性成分为氨基酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4四种多肽中的至少一种。

按照本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物在制备预防和治疗肥胖症药物中的应用，所述药物组合物的活性成分为氨基酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4四种多肽中的至少一种。

按照本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝保健食品中的应用，所述药物组合物的活性成分为氨基酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4四种多肽中的至少一种。

按照本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物在制备预防和治疗肥胖症保健食品中的应用，所述药物组合物的活性成分为氨基酸序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4四种多肽中的至少一种。

优选地，所述四种多肽均含有37个氨基酸，且均含有6个半胱氨酸，分别位于位点3、位点7、位点15、位点20、位点22和位点32，其中位点3与位点20、位点7与位点22以及位点15与位点32形成三对二硫键，这三对二硫键形成半胱氨酸结的结构域。

优选地，所述四种多肽能耐消化道蛋白酶水解。

优选地，该组合物给药方式为口服给药。

优选地，所述多肽在该药物组合物中的重量百分比为5％以上，该多肽包括所述四种多肽中至少一种的总重量。

优选地，该药物组合物还包括药学上可接受的载体。

优选地，该药物组合物是喷雾干燥或冷冻干燥得到的干粉，剂型为溶液剂、胶囊、丸剂或片剂。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)该多肽自身形成的二硫键形成半胱氨酸结的结构域，使得多肽化合物耐消化道蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白内切酶glu-c的降解作用。同时，可促进胰腺细胞胞外钙离子内流，同时体外具有保护胰腺β细胞的作用。因此，以此种多肽为主要活性成分的药物组合物口服即可发挥作用，无需注射，减轻患者痛苦。

(2)该多肽药物组合物作用于非酒精性脂肪肝患者时，使患者的胰岛素抵抗得到改善，使胰岛素对血糖的作用趋于正常个体。

(3)该多肽可显著降低非酒精性脂肪肝患者的脂肪含量和肝脏的脂肪化程度，使肝脏的脂滴明显减小，恢复到正常个体的水平。

(4)该多肽可显著降低非酒精性脂肪肝患者的谷丙转氨酶alt和谷草转氨酶ast水平。

(5)该多肽可显著降低非酒精性脂肪肝患者的肝脏甘油三酯含量，使甘油三脂含量接近正常个体，对于治疗甘油三酯升高导致的非酒精性脂肪肝具有显著效果。

附图说明

图1是多肽治疗非酒精性脂肪肝小鼠效果对比图；

图2是非酒精性脂肪肝小鼠肝脏he染色和油红染色；

图3是非酒精性脂肪肝小鼠空腹血糖；

图4是非酒精性脂肪肝小鼠胰岛素耐受实试验；

图5是多肽降低谷丙转氨酶试验结果；

图6是多肽降低谷草转氨酶试验结果；

图7是多肽降低甘油三酯试验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：多肽降低脂肪含量和肝脏脂肪化程度试验

建立正常饲料喂养的雄性c57bl/6小鼠(chow组)，高脂饲料(high-fat多肽给药处理的雄性c57bl/6小鼠(hfd+vg组)的研究非酒精性脂肪肝实验动物模型。

将2个月大的雄性c57bl/6小鼠随机分为三组：正常饲料喂养(chow组)，高脂饲料(high-fatdiet,hfd)喂养(hfd组)和在高脂饲料喂养的同时多肽给药处理(hfd+vg组)。chow组在整个实验过程中均使用正常饲料喂养，hdf组和hfd+vg组分别高脂饲料喂养3个月，然后hfd组继续高脂饲料喂养5个月，而hfd+vg在高脂饲料喂养的同时每天用多肽口腔灌胃(20mg/kg)5个月。

非酒精性脂肪肝的肝组织脂肪化程度通常使用he染色和油红染色检测，如图1所示，在实验中我们可以看到非酒精性脂肪肝小鼠(hfd组)的肝脏组织的he染色中含有大量的空泡。脂肪肝的形成是由于甘油三酯组成的脂滴在肝细胞内积累，脂滴过大则会形成空泡，而经过多肽治疗后(hfd+vg组)的小鼠肝脏组织中空泡数量和大小明显减小。空泡的数量和大小也反映出肝细胞内脂滴的数量和大小，反映了脂肪肝的脂肪化程度。如图2所示，非酒精性脂肪肝小鼠(hfd组)的肝脏组织的he染色中含有大量的脂滴，而经过多肽治疗后(hfd+vg组)的小鼠肝脏组织中脂滴数量和大小明显减小。因此多肽给药处理后可显著降低非酒精性脂肪肝小鼠腹部的脂肪含量和肝脏的脂肪化程度，其肝脏的脂滴明显减小。

实施例2：多肽改善胰岛素抵抗的试验

非酒精性脂肪肝的发病机制为：发病起初时，脂质在肝细胞内积累，而该脂肪积累的现象往往在2型糖尿病和其他代谢综合征患者身上更容易发生；然后，胰岛素抵抗以及伴随着肝脏的炎症发生会进一步加重非酒精性脂肪肝的病症，最终导致非酒精性脂肪肝的产生和加剧。胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。由于血脂异常可刺激糖原异生，引发肝脏胰岛素抵抗和外周葡萄糖利用率降低，因此改善血脂水平可成为非酒精性脂肪肝预防与治疗中的重要指标。

非酒精性脂肪肝的发病机制与胰岛素抵抗的产生直接相关。脂质在肝细胞内的过度堆积，可激活肝脏组织内的炎症信号通路，通过上调nf-κb，激活蛋白1(ap-1)等转录因子的表达而诱发炎症，产生大量诸如tnf-α,il-6,il-1β等促炎因子，促炎因子参与诱导局部或全身性的胰岛素抵抗；浸润在肝脏组织之间的巨噬细胞又通过自身分泌的促炎因子可进一步增强炎症信号，肥胖小鼠脂肪细胞之间的巨噬细胞内促炎因子的基因表达水平与小鼠血浆中胰岛素的水平呈正相关。给体形肥胖的正常个体静脉输注甘油三酯以增加血浆中自由脂肪酸的水平可引起明显的炎症反应，如果减少肥胖个体的营养摄入可以显著缓解氧化应激状态和炎症反应水平。饮食过量导致肥胖，肥胖又会导致肝脏组织过度增生和大量脂质在肝细胞内的过度堆积。

当机体分泌过多胰岛素时，空腹血糖明显升高，如图3所示。本实验中经过多肽的治疗后，非酒精性脂肪肝小鼠的空腹血糖明显降低。胰岛素抵抗通过胰岛素耐受实验itt进行检测，itt实验是将胰岛素皮下注射到实验小鼠中，由于胰岛素可以降低血糖，正常的小鼠对胰岛素敏感，血糖会

很快降下来，而产生的胰岛素耐受的非酒精性脂肪肝小鼠对胰岛素不敏感，因而血糖降低的时间会长一些。在同一时间注射胰岛素后，分别在不同的时间点监测血糖，可以观察到实验小鼠的血糖变化水平，胰岛素耐受程度越高的小鼠做曲线形成的auc数值也会大一些，auc数值是做胰岛素耐受实验即itt实验时形成的曲线下面积(areaundercurve)，即血糖变化的曲线和横纵坐标轴形成的面积，是将胰岛素耐受或者称胰岛素敏感性量化的指标。如图4所示，左边ipitt图是腹腔注射胰岛素的胰岛素耐受实验，ipitt图的正常组、模型组和治疗组的auc分别为34、40和38；右边itt图是皮下注射胰岛素的胰岛素耐受实验，itt图的正常组、模型组和治疗组的auc分别为51、67和47。可以得知，经过多肽治疗后非酒精性脂肪肝的auc数值降低，胰岛素抵抗得到改善。因此，通过空腹血糖和胰岛素耐受实验的检测发现多肽给药处理后非酒精性脂肪肝小鼠的胰岛素抵抗明显得到好转。

实施例3：多肽降低谷丙转氨酶alt和谷草转氨酶ast的试验

alt与ast主要分布在肝脏的肝细胞内，肝细胞处于炎症或病毒感染等受损环境时alt和ast就会升高。其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指标，非酒精性脂肪肝患者的alt和ast普遍升高。在实验中发现，高脂饲料喂养的肥胖的非酒精性脂肪肝小鼠的alt和ast明显升高，经过多肽的灌胃治疗后，alt和ast的含量降低。

多肽给药后非酒精性脂肪肝小鼠静脉血中的谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)显著下降。如图5所示，正常饲料喂养的小鼠静脉血中谷丙转氨酶(alt)为50卡门式单位，高脂饲料喂养的小鼠静脉血中谷丙转氨酶(alt)为200卡门式单位，高脂饲料喂养同时给多肽处理后，小鼠静脉血中谷丙转氨酶(alt)由200卡门式单位降低到50卡门式单位。可以得知，在对高脂饲料喂养的小鼠给多肽处理后，静脉血中谷丙转氨酶(alt)的含量恢复到正常水平。

如图6所示，正常饲料喂养的小鼠静脉血中谷草转氨酶(ast)为150卡门式单位，高脂饲料喂养的小鼠静脉血中谷草转氨酶(ast)为250卡门式单位，高脂饲料喂养同时给多肽处理后，小鼠静脉血中谷草转氨酶(ast)由250卡门式单位降低到150卡门式单位。可以得知，在对高脂饲料喂养的小鼠给多肽处理后，静脉血中谷草转氨酶(ast)的含量恢复到正常水平。

实施例4：多肽降低甘油三酯的试验

非酒精性脂肪肝的一个病理特征是肝细胞内的甘油三酯含量增高，在高脂喂养的肥胖的非酒精性脂肪肝小鼠中，肝脏甘油三酯的含量明显高于正常饲料喂养的健康小鼠，而通过多肽的灌胃治疗后，非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏甘油三酯含量明显降低，接近正常小鼠水平，表明多肽对于治疗甘油三酯升高导致的非酒精性脂肪肝具有很好的治疗效果。

多肽降低了非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织中甘油三酯(tg)的含量，如图7所示，正常饲料喂养的小鼠肝脏甘油三酯含量为2.5mmol/g，高脂饲料喂养的小鼠肝脏甘油三酯含量为4.5mmol/g，高脂饲料喂养同时给多肽多肽处理后，小鼠肝脏甘油三酯含量由4.5mmol/g降低到2.5mmol/g。可以得知，在对高脂饲料喂养的小鼠给多肽处理后，肝脏甘油三酯的含量恢复到正常水平。

实施例5：多肽的制备方法

本发明所述多肽的制备方法，包含以下步骤：

(1)精选大豆或豌豆种子，水浸泡12-16小时，35-38℃间断洒水条件下萌发。

(2)萌发体粉碎后，搅拌下于10-20℃以0.01n分析纯盐酸或0.02n分析纯乙酸提取12-13小时。

(3)渣浆分离机分离或板簧过滤，取滤液，陶瓷膜过滤，有机膜过滤，截留分子量3000至4500道尔顿范围物料，冷冻干燥。

(4)冻干粉经制备型高压液相色谱，收集对应4个肽所在位置的洗脱峰，再冷冻干燥，浅黄色冻干粉为4个目标肽化合物。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中科技大学

<120>一种药物组合物及其应用

<141>2017-08-07

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>37

<212>prt

<213>豆科植物

<400>1

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202530

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<213>豆科植物

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