治疗精神分裂症的药物及验证药物的动物模型构建方法与流程

本发明属于医疗领域，尤其涉及一种治疗精神分裂症的药物及验证药物的动物模型构建方法。

背景技术：

目前，药物滥用是一个十分严重的社会问题，氯胺酮(k粉)作为一种新型毒品正受到人们越来越多的关注。近20年来，我国滥用氯胺酮比例连年攀升，有资料显示，2004年在香港，二十一岁以下的人服用氯胺酮的情况最为严重，达1185人，较2003年同期上升47％。氯胺酮的不良反应具有剂量相关的特点，使用剂量愈大，毒副作用愈显著，其毒副作用可概括为两个方面，一是精神、神经系统反应，表现为明显的梦幻觉、错觉(illusion)、分离状态或分裂症，尖叫、兴奋、烦躁不安、定向障碍、认知障碍、易激惹行为、呕吐、流涎、谵妄、中等肌张力增加和颤抖等；二是氯胺酮还可增加脑血流和颅内压及眼压。氯胺酮作为苯环已哌啶替代物，其毒副作用主要为精神、神经系统反应以及对心血管系统的影响，可产生精神分裂症(schizophrenia)。滥用新型毒品氯胺酮的吸毒人员还被发现会产生类似精神分裂症的阴性及阳性症状，我们前期研究表明，氯胺酮滥用确实会导致精神分裂症，但具体机制并不清楚。因此，利用氯胺酮诱导建立精神分裂症动物模型。

精神分裂症是一类严重的致残性精神疾病，被称为“影响人类的最坏的疾病”。迄今对其发病机制仍不清楚，目前普遍接受的观点是精神分裂症是在环境因素影响下，多个“中至微效”基因协同作用的结果，神经发育因素参与其中。遗传学研究发现了多个与精神分裂症相关的重要候选基因，其中神经调节素1(neuregulin1,nrg1)及其受体erbb4的编码基因均被鉴定为精神分裂症的易感基因，精神分裂症患者中nrg1和erbb4表达上调，信号转导增强。nrg1/erbb4基因突变大鼠表现出精神分裂症症状。

到目前为止，尚无有效的鉴定精神分裂症的方法，临床上大多数医生是凭借临床经验及通过对患者的行为观察对精神分裂症作出鉴定；精神分裂症病因与生物机制也不清楚，同时，目前治疗精神分裂症的药物效果不明显，毒副作用也较大；查阅文献发现用天然药物或中草药治疗精神分裂症的报道较少。中草药治疗精神分裂症是具有中国特色的一种治疗方法，有着西方药物无法比拟的独特优势，在治疗医学中将具有广阔的发展前景。

我们将从分子、细胞、神经生理、行为学等多层面，海马及前额叶皮质等多脑区开展全面系统的精神分裂症研究，阐述导致精神分裂症的本质；为精神分裂症的鉴定提供可靠的理论依据。将用中草药治疗精神分裂症，识别评估新的治疗方法或治疗靶标；并比较中草药钩藤碱和芒果苷对精神分裂症的治疗效果，筛选出治疗效果好，毒副作用小的一种中草药，为中草药治疗精神分裂症提供可能。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有无有效的鉴定精神分裂症的方法，同时，目前治疗精神分裂症的药物效果不明显，毒副作用也较大；用天然药物或中草药治疗精神分裂症的信息少。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种治疗精神分裂症的药物及验证药物的动物模型构建方法。

本发明是这样实现的，一种治疗精神分裂症的药物，所述治疗精神分裂症的药物组份由钩藤碱和芒果苷组成；钩藤碱和芒果苷单独使用时剂量均为20mg/kg；二者合用时，各自为10mg/kg。

本发明的另一目的在于提供一种治疗精神分裂症的药物的制备方法包括：首先，采集云南钩藤碱和芒果苷植物，晒干。其次，用乙醇浸泡晒干的植物，浸泡过夜后，取出浸泡液在水浴锅上挥干，然后在碱性条件下用有机溶剂萃取目标物钩藤碱和芒果苷。最后，把萃取目标物放在水浴锅上挥干，即得到纯度较高的钩藤碱和芒果苷。

本发明的另一目的在于提供一种验证上述治疗精神分裂症的药物的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：

氯胺酮诱导致精神分裂症的成年期组动物模型的构建和氯胺酮诱导致精神分裂症的新生期组动物模型的构建；

所述氯胺酮诱导致精神分裂症的成年期组动物模型的构建，包括：将5周龄成年sd大鼠(不分雌雄，体重110～130g)随机分成10组(即k对照、k15给、k30给、k60给+无治疗、k20钩藤碱对照、k20芒果苷对照、k10钩藤碱+10芒果苷对照、k60给+20芒果苷、k60给+20钩藤碱、k60给+10钩藤碱+10芒果苷)，以生理盐水作为溶剂对照，并设氯胺酮15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg给药组，20mg/kg芒果苷对照组，20mg/kg钩藤碱对照组，10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷对照组，以上各组为腹腔注射给药，每日2次，连续7天；k60给+20钩藤碱为先给60mg/kg氯胺酮再用20mg/kg钩藤碱治疗组(先用60mg/kg氯胺酮腹腔注射给药，每日2次，连续7天后，再用20mg/kg钩藤碱治疗7天，每天治疗2次)，k60给+20芒果苷为先给60mg/kg氯胺酮再用20mg/kg芒果苷治疗组(先用60mg/kg氯胺酮腹腔注射给药，每日2次，连续7天后，再用20mg/kg芒果苷治疗7天，每天治疗2次)，k60给+10钩藤碱+10芒果苷为先给60mg/kg氯胺酮再用10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷治疗组(先用60mg/kg氯胺酮腹腔注射给药，每日2次，连续7天后，再用10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷治疗7天，每天治疗2次)。

所述氯胺酮诱导致精神分裂症的新生期组动物模型的构建包括：将新生期sd大鼠按上述成年期组法(不分雌雄)随机分成10组(即k对照、k15给、k30给、k60给+无治疗、k20芒果苷对照、k20钩藤碱对照、k10钩藤碱+10芒果苷对照、k60给+20芒果苷、k60给+20钩藤碱、k60给+10钩藤碱+10芒果苷)，以生理盐水作为溶剂对照，并设氯胺酮15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg给药组，20mg/kg芒果苷对照组，20mg/kg钩藤碱对照组，10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷对照组，以上各组为腹腔注射给药；从生后第6天(postnatalday,pnd)起每天给药两次，上午下午各给药一次。给药至生后第13天(对于高剂量的治疗组即k60给+20芒果苷、k60给+20钩藤碱及k60给+10钩藤碱+10芒果苷组，即治疗至生后第20天，每天治疗2次)。在此期间正常哺乳，并保持良好的饲养环境。停止给药后第2天，将幼鼠按同组同性别分笼，每笼3～4只，并正常饲养至其成年。

本发明的优点及积极效果为：本发明通过建立氯胺酮诱导给药致精神分裂症的成年期组及新生期组动物模型，探索早期环境因素对造成精神分裂症的影响，建立一种真实、可靠的精神分裂症动物模型；得出建立精神分离症动物模型氯胺酮的最佳剂量为60mg/kg，对于云南特色中草药钩藤碱和芒果苷植物的提取，采用液-液萃取效果较好，萃取成本比固相萃取低40％，萃取回收率达到85％以上。本发明从行为学、细胞、分子等多个层面，海马及前额叶皮质两个脑区展开全面系统的精神分裂症研究，将为精神分裂症的发病机制提供理论依据。采用云南中草药钩藤碱和芒果苷治疗精神分裂症大鼠，并从多层面及多脑区阐述治疗机制，将进一步促进对精神分裂症本质的认识，为开展个性化及精准治疗奠定基础。本发明为精神分裂症的鉴定提供理论依据；也将筛选出治疗效果好、毒副作用小的一种中草药物，识别评估新的治疗手段或治疗靶标，为中草药治疗精神分裂症的分子机制提供一定的理论依据，填补中草治疗精神分裂症的空白。

本发明用新型毒品氯胺酮诱导建立精神分离症动物模型，探索出建立精神分离症动物模型所需要氯胺酮的最佳剂量。然后，用具有云南特色的钩藤碱和芒果苷中草药对精神分离症大鼠进行治疗，探究出治疗机制及筛选出最佳治疗方案。

附图说明

图1是本发明实施例提供的验证药物的动物模型构建方法路线流程图。

图2是本发明实施例提供的免疫组化前期实验图。

图3是本发明实施例提供的westernblot前期实验检测nrg1图。

图4是本发明实施例提供的rt﹣pcr前期实验检测溶解曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明采用具有云南地方特色的中草药钩藤碱及芒果苷治疗精神分裂症大鼠，这将为中草药治疗精神分裂症提供可能，同时探究治疗机制，并筛选出治疗效果好、毒副作用小的一种中草药。钩藤是茜草科植物钩藤带钩茎的枝，有效活性成分为钩藤碱。现代药理研究表明，钩藤及其有效成分(钩藤生物碱)对中枢神经系统和心血管系统具有较强的抑制作用；钩藤碱对中枢神经系统的突触传递过程有明显的抑制效应，具有神经保护作用。芒果苷来自于漆树科植物芒果树的果实、叶、树皮，具有一定的神经活性，具有较强的中枢神经保护作用。

本发明一方面利用动物模型，用morris水迷宫实验观察大鼠行为变化，分析氯胺酮诱导所致的精神分裂症动物模型；另一方面在动物模型基础上，检测氯胺酮作用导致的精神分裂症大鼠海马及前额叶皮质中nrg1和erbb4变化；最后用钩藤碱及芒果苷治疗大鼠出现的精神分裂症，以此探讨nrg1/erbb4表达调控在精神分裂症发生发展中的作用；同时依据成年期组动物模型及新生期组动物模型所得结果的不同，将提示氯胺酮的诱导因素在不同发育阶段可能通过调控不同的基因对神经系统产生不同的影响，而易感基因在不同发育阶段不同脑区的表达对疾病的效应不同，进一步提示神经发育在精神分裂症发生发展中的重要性；将推进精神分裂症病因与生物机制的理解、探讨药物作用机理以及识别评估新的治疗手段，为精神分裂症的鉴定及中草药治疗精神分裂症奠定基础。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明实施例提供的治疗精神分裂症的药物，组份由钩藤碱和芒果苷组成；钩藤碱和芒果苷单独使用时剂量均为20mg/kg；二者合用时，各自为10mg/kg。

本发明实施例提供的治疗精神分裂症的药物的制备方法包括：

首先，采集钩藤碱和芒果苷植物，晒干；

其次，用乙醇浸泡晒干的植物，浸泡过夜后，取出浸泡液在水浴锅上挥干，然后在碱性条件下用有机溶剂萃取目标物钩藤碱和芒果苷；

最后，把萃取目标物放在水浴锅上挥干，得到钩藤碱和芒果苷所述治疗精神分裂症的药物组份由钩藤碱和芒果苷组成。

本发明实施例提供的一种验证上述治疗精神分裂症的药物的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：

氯胺酮诱导致精神分裂症的成年期组动物模型的构建和氯胺酮诱导致精神分裂症的新生期组动物模型的构建；

所述氯胺酮诱导致精神分裂症的成年期组动物模型的构建，包括：

所述氯胺酮诱导致精神分裂症的新生期组动物模型的构建包括。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的验证药物的动物模型构建方法中，建立氯胺酮诱导致精神分裂症的成年期组及新生期组动物模型，在形态、分子、细胞、神经生理、行为学等多水平，海马及前额叶皮质多脑区开展全面系统的精神分裂症分析。

用中草药钩藤碱和芒果苷对精神分裂症大鼠进行治疗，研究治疗机制，推进精神分裂症病因与生物机制的理解、探讨药物作用机理以及识别评估新的治疗手段(如药物)或治疗靶标(如受体)。

筛选出治疗效果好，毒副作用小的一种中草药，为中草药治疗精神分裂症提供可能。

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例提供的验证药物的动物模型构建方法，包括：

首先，采用具有云南地方特色的中草药钩藤碱及芒果苷治疗精神分裂症大鼠，这将为中草药治疗精神分裂症提供可能，同时探究治疗机制，并筛选出治疗效果好、毒副作用小的一种中草药。钩藤是茜草科植物钩藤带钩茎的枝，有效活性成分为钩藤碱。现代药理研究表明，钩藤及其有效成分(钩藤生物碱)对中枢神经系统和心血管系统具有较强的抑制作用；钩藤碱对中枢神经系统的突触传递过程有明显的抑制效应，具有神经保护作用。芒果苷来自于漆树科植物芒果树的果实、叶、树皮，具有一定的神经活性，具有较强的中枢神经保护作用。

然后，利用动物模型，用morris水迷宫实验观察大鼠行为变化，分析氯胺酮诱导所致的精神分裂症动物模型；另一方面在动物模型基础上，检测氯胺酮作用导致的精神分裂症大鼠海马及前额叶皮质中nrg1和erbb4变化；

最后，用钩藤碱及芒果苷治疗大鼠出现的精神分裂症，以此探讨nrg1/erbb4表达调控在精神分裂症发生发展中的作用；同时依据成年期组动物模型及新生期组动物模型所得结果的不同，将提示氯胺酮的诱导因素在不同发育阶段可能通过调控不同的基因对神经系统产生不同的影响，而易感基因在不同发育阶段不同脑区的表达对疾病的效应不同，进一步提示神经发育在精神分裂症发生发展中的重要性；将推进精神分裂症病因与生物机制的理解、探讨药物作用机理以及识别评估新的治疗手段，为精神分裂症的鉴定及中草药治疗精神分裂症奠定基础。

2、氯胺酮给药动物模型的建立。

建立氯胺酮慢性给药成年期组动物模型和氯胺酮慢性给药新生期组动物模型。

所述氯胺酮诱导致精神分裂症的成年期组动物模型的构建，包括：将5周龄成年sd大鼠(不分雌雄，体重110～130g)随机分成10组(即k对照、k15给、k30给、k60给+无治疗、k20钩藤碱对照、k20芒果苷对照、k10钩藤碱+10芒果苷对照、k60给+20芒果苷、k60给+20钩藤碱、k60给+10钩藤碱+10芒果苷)，以生理盐水作为溶剂对照，并设氯胺酮15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg给药组，20mg/kg芒果苷对照组，20mg/kg钩藤碱对照组，10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷对照组，以上各组为腹腔注射给药，每日2次，连续7天；k60给+20钩藤碱为先给60mg/kg氯胺酮再用20mg/kg钩藤碱治疗组(先用60mg/kg氯胺酮腹腔注射给药，每日2次，连续7天后，再用20mg/kg钩藤碱治疗7天，每天治疗2次)，k60给+20芒果苷为先给60mg/kg氯胺酮再用20mg/kg芒果苷治疗组(先用60mg/kg氯胺酮腹腔注射给药，每日2次，连续7天后，再用20mg/kg芒果苷治疗7天，每天治疗2次)，k60给+10钩藤碱+10芒果苷为先给60mg/kg氯胺酮再用10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷治疗组(先用60mg/kg氯胺酮腹腔注射给药，每日2次，连续7天后，再用10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷治疗7天，每天治疗2次)。

所述氯胺酮诱导致精神分裂症的新生期组动物模型的构建包括：将新生期sd大鼠按上述成年期组法(不分雌雄)随机分成10组(即k对照、k15给、k30给、k60给+无治疗、k20芒果苷对照、k20钩藤碱对照、k10钩藤碱+10芒果苷对照、k60给+20芒果苷、k60给+20钩藤碱、k60给+10钩藤碱+10芒果苷)，以生理盐水作为溶剂对照，并设氯胺酮15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg给药组，20mg/kg芒果苷对照组，20mg/kg钩藤碱对照组，10mg/kg钩藤碱及10mg/kg芒果苷对照组，以上各组为腹腔注射给药；从生后第6天(postnatalday,pnd)起每天给药两次，上午下午各给药一次。给药至生后第13天(对于高剂量的治疗组即k60给+20芒果苷、k60给+20钩藤碱及k60给+10钩藤碱+10芒果苷组，即治疗至生后第20天，每天治疗2次)。在此期间正常哺乳，并保持良好的饲养环境。停止给药后第2天，将幼鼠按同组同性别分笼，每笼3～4只，并正常饲养至其成年。

3、morris水迷宫实验观察大鼠的行为变化。

定位航行训练阶段；空间探索实验阶段(定位航行训练后第2天)；工作记忆测试阶段。

4、免疫组化实验(immunohistochemicalstaining)检测海马及前额叶皮质中nrg1/erbb4在相应脑区的位置(定位)。

4.1脑组织的移取。

4.2免疫组织化学技术。

4.3免疫组织化学染色半定量分析。

4.4统计与分析。

5、蛋白免疫印迹实验(westernblot)检测海马及前额叶皮质中nrg1及erbb4蛋白的表达水平。

5.1脑组织蛋白的提取。

5.2标准曲线的绘制及蛋白浓度测定。

5.3结果处理。

6、反转录聚合酶链式反应法(rt-pcr)检测海马及前额叶皮质中nrg1及erbb4mrna的表达。

脑组织总rna的提取；rna定量与纯度鉴定；引物设计；逆转录；pcr扩增；琼脂糖凝胶电泳。

7、实验结果

实验效果显示如下：免疫组化前期实验初步显示前额叶皮质有阳性细胞变化，海马区初步定位于齿状回(dg)及ca3区；westernblot前期实验也显示出低、中、高及高剂量连续给药引起目标蛋白变化；rt-pcr前期实验也表明效果较好。

图2是本发明实施提供的免疫组化前期实验图。

图3是本发明实施提供的westernblot前期实验检测nrg1图。

图4是本发明实施提供的rt﹣pcr前期实验检测溶解曲线图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。