小檗碱离子对化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用的制作方法

本发明属医药技术领域，具体是涉及一类小檗碱离子对化合物在制备抗乳腺癌中的应用。

背景技术：

小檗碱离子对化合物是由小檗碱阳离子与烷酰基乙醛亚硫酸氢钠加成物，俗称鱼腥草素钠的阴离子结合生成的离子对化合物。暂定通用名黄癸素（简称hb），分子式为：c32h41sno9，分子量：615.73，结构通式如下：

其中r为c8-c12的烷基。

该化合物已由中国发明专利（zl2005101366552）公开。另外，该化合物抗肝癌的用途已由中国发明专利（zl201010213692x）公开。

本发明人对黄癸素的抗癌作用进行了广泛的研究，发现其对多种癌细胞均有不同程度的抑制增殖、抗转移和诱导凋亡的作用（中国药理学通报，2010，26（12）：1630-1634；药学学报，2011，46（4）：390-394；中药药理与临床，2011,27（1）：20-23；中国药学杂志，2011，46（17）：1321-1325；中药药理与临床，2015,31(5)：41-44；等）。在这些研究中特别发现黄癸素对乳腺癌细胞有显著的作用，尤其是难治性的三阴乳腺癌细胞呈高度敏感（药学学报，2014，49（1）：131-135；中国药理学通报，2014，30（2）：253-256）。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全球每年约有140万妇女被诊断为乳腺癌，50万病例死亡，在北美西欧地区乳腺癌发病率在女性恶性肿瘤占首位，约占全部恶性肿瘤的20%~30%。近年来，在我国发病率占女性恶性肿瘤的第二位，在某些大城市已上升至第一位。三阴乳腺癌是乳腺癌四种分子分型的一种，是指雌性激素受体（er）、孕激素受体（pr）和人类表皮生长因子-2（her-2）均为阴性表达，约占乳腺癌总病例数的15%~20%。药物治疗主要局限于蒽环类的阿霉素和紫杉醇类等细胞毒类的化疗，存在毒副作用和耐药性等问题，而无法采用现有的内分泌治疗和基于赫赛汀的分子靶向治疗。与非三阴乳腺癌相比较，目前的研究尚未发现某种或某几种化疗方案在三阴乳腺癌治疗中具有较高的完全病理缓解率和较少的耐药性。三阴乳腺癌复发率、转移率和死亡率都高，目前缺少有效的治疗手段，现在上市的三阴乳腺癌靶向药物，疗效不够理想，还存在毒副作用和耐药性问题，而且价格昂贵，患者难以负担，研发高效低毒的抗三阴乳腺癌靶向药物十分迫切（夏想厚等.国际外科学杂志，2014,41（11）：766-769）。

国内外研究表明，小檗碱对乳腺癌细胞有抑制增殖、诱导凋亡、抗转移、抗侵袭和抑制血管生成作用，但总体药效不强。盐酸小檗碱理化性质存在缺陷，口服利用度低，难以发挥临床治疗作用。黄癸素与之相比具有明显优势，其具有亲脂性，细胞渗透比较强，有利于发挥抗癌作用和口服吸收。另一个重要优势是双母核药理效应，可能产生协同增效作用。其中鱼腥草素钠和小檗碱对三阴乳腺癌细胞mda-mb-231均具有抑制作用，浓度50µg·ml^-1下抑制率分别为91%和72%（刘雯清等.西北药学杂志，2015，30（2）：152-155）。由于双母核效应，使黄癸素对三阴乳腺癌呈现更显著的抗癌活性，本发明的研究成果显示，黄癸素对mda-mb-231细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用，以及对mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤的抑制作用，与同类药及目前临床主要治疗药相比较，具有一定的优势。

mda-mb-231细胞体外试验：黄癸素与同类药盐酸小檗碱、我国首个批准上市的有自主知识产权的小分子化合物西达本胺、目前临床常用药顺铂相比较，体外效价强度高约14倍以上（以ic50和细胞凋亡率为评价指标），具体数据如下：黄癸素作用48小时的ic50为2.05µmol·l^-1（1.26mg·l^-1），而文献报道盐酸小檗碱ic50为10µmol·l^-1（kimjbetal.plantamed,2008,74(1):39-42）、75µmol·l^-1（谢娟等.南京医科大学学报（自然科学版），2013（9）：1220-1225）、85µmol·l^-1（温纯洁.重庆医科大学博士论文，2014），西达本胺为、顺铂ic50分别为57.38和27.8µmol·l^-1（项丹等.东南大学学报（医学版），2013,32（3）：283-288）；作用48小时对mad-mb-231细胞的促凋亡作用，hb3.898µmol·l^-1（2.4mg·l^-1）的细胞凋亡率为63.2%，而盐酸小檗碱50µmol·l^-1的细胞凋亡率为38.08%（谢娟等.南京医科大学学报（自然科学版），2013（9）：1220-1225），西达本胺16、32µmol·l^-1的细胞凋亡率分别为48.5%和70.1%（项丹等.东南大学学报（医学版），2013,32（3）：283-288），西达本胺20µmol·l^-1的对三阴乳腺癌cal-51细胞作用72、96h的凋亡率分别为15.45%和50.15%（施秀青等.临床肿瘤学杂志，2013,18（12）：1057-1061）。

mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤的在体试验：黄癸素剂量60、90、120mg·kg^-1灌胃给药13天，抑瘤率分别为13.91%、42.26%和71.57%。瑞士诺华公司研发的pbk/mtor双重靶向抑制剂bez235，剂量10、100mg·kg^-1，给药49天，抑瘤率分别约为40%和70%（周宪春等.基础医学与临床，2016,36（3）：311-314）。iwr-1-endo是新近合成的wnt通路抑制剂，剂量50mg·kg^-1，腹腔注射28天，抑瘤率为42.2%（江燕等.重庆医学，2015,44（26）：3605-3608）。黄癸素的疗效都不低于上述药物，且黄癸素的毒副作用低和价廉都有很大优势。本发明的研究成果得到了其他学者的验证，并提出黄癸素是可能通过下调nf-kβ,上调p65和p53蛋白表达诱导细胞凋亡（陈湖海等.中国临床研究，2016,29（7）：884-887）。

联合化疗是肿瘤化疗的主要方式，而联用药物之间可能存在协同、相加或拮抗关系，直接影响到用药方案的合理性和联合用药的总疗效。本发明采用的体外肿瘤细胞联合药敏实验以ci值（联合指数）大小判断联用药物之间的协同、相加或拮抗关系，以及黄癸素联用氟尿嘧啶进行在体小鼠移植瘤试验，结果显示：黄癸素与5-fu、羟喜树碱等药对体外培养的多种肿瘤细胞具有协同抑制作用；在体试验表明黄癸素与5-fu合用对小鼠h22、s180移植瘤在体生长的抑制效果较单用有明显提高。

该化合物抗肝癌的用途已由中国发明专利（zl201010213692x）公开，其具有较好的抑制肝癌细胞hegp2、bel-7402及肠癌细胞系hct116在裸鼠体内的生长的作用。本发明在此基础上依据研究结果提出该化合物对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌具有较突出的抑制作用，对三阴性乳腺癌mda-mb-231细胞的体外抑制作用显著高于hegp2、bel-7402等肝癌细胞及多种其他肿瘤细胞，在体试验对mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤抑制显著，同时阐明其对三阴性乳腺癌细胞作用的特点和机制如阻滞细胞于s期、促进细胞凋亡、抑制细胞内parp的表达等。此外，体外和体内的联合用药抗肿瘤试验显示黄癸素与多种临床常用抗肿瘤药物合用具有提高疗效的作用。本发明对于该化合物的进一步研发和应用于临床具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种黄癸素化合物作为活性成分在制备治疗乳腺癌特别是三阴乳腺癌药物中的应用。

本发明的另一目的是提供一种黄癸素化合物作为活性成分作为联合用药的辅助抗癌药物中应用。

小檗碱离子对化合物具体是指小檗碱与烷酰基乙醛亚硫酸氢钠加成物作用生成的离子对化合物。黄癸素（暂定通用名，简称hb）具体是小檗碱与鱼腥草素钠作用生成的离子对化合物。

本发明的目的是这样实现的，所述的小檗碱离子对化合物具有下列结构通式：

其中r为c8-c12的烷基。

本发明上述的化合物作为活性成分在制备治疗乳腺癌特别是三阴乳腺癌药物中的应用。

本发明上述的化合物作为联合用药的辅助抗癌药物应用。

本发明上述的化合物是与选自5-fu、羟喜树碱、顺铂、阿霉素或奥沙利铂之一的化疗药物的联合用药。

具体地说，本发明上述的黄癸素具有如下作用：

1.黄癸素对三阴乳腺癌mda-mb-231细胞有显著的增殖抑制作用，具有浓度和时间依赖性，作用48小时的ic50（半抑制浓度）为（1.26±0.30）mg·l^-1（2.05µmol·l^-1）。平行试验对非三阴乳腺癌细胞mcf-7的ic50为（32.07±9.09）mg·l^-1，相差达25倍。表明mda-mb-231细胞对黄癸素呈高度敏感，且效价强度显著高于先导物盐酸小檗碱，文献报道盐酸小檗碱ic50为10~85µmol·l^-1（文献见前述：kimjbetal；谢娟等；温纯洁）。

2.黄癸素对mda-mb-231细胞周期的影响。hb作用24小时，大部分细胞阻滞在s期，同时g2细胞减少，甚至消失。

3.黄癸素促进mda-mb-231细胞凋亡，采用annexinv-fitc/pi双染色法，hb剂量0.6、1.2和2.4mg·l^-1，作用24小时，细胞凋亡率明显提高，由对照组的2.6%分别提高到9.1%、31.5%、63.2%。

4.黄癸素明显抑制mda-mb-231细胞内parp（多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶）的表达。随着hb浓度的增加，细胞内parp表达逐渐减少，而裂片断clearedparp的表达逐渐增加，caspase-3和caspase-9的裂片增多。parp抑制剂是三阴乳腺癌靶向治疗的一种重要选择。

5.黄癸素对mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤有明显抑制作用。黄癸素90和120mg·kg^-1灌胃给药13d，抑瘤率分别为42.26%和71.57%，疗效显著。

6.本发明小檗碱离子对化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，还可以作为联合用药的辅助抗癌药物应用，以及在癌症放射治疗中做增敏剂使用。

本发明在现有技术基础上依据研究结果提出小檗碱离子对化合物对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌具有较突出的抑制作用，对mda-mb-231细胞的体外抑制作用显著高于hegp2、bel-7402等肝癌细胞及多种其他肿瘤细胞，在体试验对mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤抑制显著，同时阐明其对三阴性乳腺癌细胞作用的特点和机制如阻滞细胞于s期、促进细胞凋亡、抑制细胞内parp的表达等。

本发明的积极有益效果在于，小檗碱离子对化合物黄癸素对乳腺癌特别是对难治性的三阴乳腺癌有明显的体内外抑制作用，为治疗三阴乳腺癌提供了一种疗效明显、毒副作用小、使用方便、药源丰富、制备简单、价格低廉的潜在新药。本发明对于该化合物的进一步研发和应用于三阴乳腺癌治疗，以及作为联合用药的辅助抗癌药物应用提供依据。

附图说明

图1是本发明的hb对mda-mb-231细胞抑制作用的时间依赖性图。

图2是本发明的黄癸素作用24h后细胞周期的变化图；

图中：①：对照；②~④：hb0.6、1.2、2.4mg·l^-1。

图3是本发明的流式细胞仪检测黄癸素诱导mda-mb-231凋亡图；

图中：①：对照；②~④：hb0.6、1.2、2.4mg·l^-1。

图4是本发明的tunel法检测肿瘤组织的凋亡情况图；

图中：①：对照；②~④：hb60,90,120mg·kg^-1；⑤：ctx50mg·kg^-1。

图5是本发明的黄癸素对mda-mb-231细胞内parp的影响图。

图6是本发明的黄癸素对mda-mb-231细胞caspase表达的影响图。

图7是本发明的黄癸素对裸鼠肿瘤的抑制——肿瘤生长曲线图。

图8是本发明的黄癸素对裸鼠肿瘤的抑制——各组瘤块外观图。

图9是本发明的黄癸素联用5-fu对h22小鼠肿瘤组织学的影响图（he×400）。

图中：a：生理盐水组；b：25mg/kg5-fu；c：90mg/kg黄癸素；d：90mg/kg黄癸素联用25mg/kg5-fu。

具体实施方式

实施例1黄癸素对三阴乳腺癌mda-mb-231细胞的体外抑制作用

1.1细胞培养mcf-7与mda-mb-231细胞分别采用dmem和l-15培养基，含体积分数为0.1的胎牛血清、100ku·l^-1青霉素和100mg·l^-1链霉素，置37℃、体积分数为0.05和co2、饱和湿度的培养箱常规培养，以质量分数为0.25%的胰酶消化传代。实验采用传代后3d处于指数增殖期的细胞；

1.2法检测黄癸素对乳腺癌细胞增殖的影响收集对数生长期的肿瘤细胞，用完全培养液制备成单细胞悬液，接种于96孔板，mcf-7细胞每孔8×10³个，mda-mb-231细胞每孔1.2×10⁴个，置co2培养箱过夜。设置溶媒对照组和不同浓度黄癸素处理组（mcf-7、mda-mb-231细胞分别以最高浓度50和25mg·l^-1倍比稀释7个浓度），每组设4~5个复孔，培养48h。按常规加20µlmtt（5g·l^-1）溶液处理，作用4h后除去上清液并加入100µldmso溶解反应产物，使用酶标仪在570nm波长处测定吸收度od值，计算细胞抑制率。

细胞抑制率=（1－给药组平均od值/阴性对照组平均od值）×100%

1.3结果黄癸素作用48h后，对mda-mb-231细胞增殖有明显额浓度依赖性抑制作用，ic50为（1.26±0.30）mg·l^-1，相同条件下对mcf-7细胞的ic50则为（32.07±9.09）mg·l^-1（见表1）。黄癸素对mda-mb-231细胞作用24、48、72h的ic50分别为4.65、1.46、0.75mg·l^-1，具有明显的时间依赖性抑制作用，作用时间与ic50相关系数为－0.940，而各作用时间的药物浓度与细胞抑制率相关系数分别为0.971、0.898和0.784，表现为明显的浓度依赖性（见图1）。

表1黄癸素对mda-mb-231和mcf-7细胞的抑制效果（n=8）

*p<0.05，**p<0.01较对照组；ir：细胞生长抑制率

实施例2黄癸素对mda-mb-231细胞周期的影响

2.1流式细胞术检测细胞周期取对数生长期的细胞，胰酶消化、重悬为单细胞悬液，接种于6孔板（细胞数5×10⁵/孔）。不同浓度黄癸素作用24h后收集细胞，pbs洗两次。4℃预冷的75%乙醇固定过夜。每个样品加入pi（终质量浓度为10mg·l^-1）10µl，rnasea（终质量浓度为50mg·l^-1）50µl及pbs340µl，混匀，37℃避光孵育30min后用流式细胞仪测定荧光强度。

结果细胞经黄癸素作用24h后，大部分细胞被阻滞在s期，与此同时g期细胞减少甚至流失。黄癸素0.6、1.2、2.4mg·l^-1处理组s期细胞由对照组的19.97%分别提高至20.22%、25.40%和39.17%，而g期细胞则由对照组的10.41%分别下降至1.91%、1.08%和0（见图2）。

实施例3黄癸素对mda-mb-231细胞凋亡率的影响

3.1tunel法检测瘤组织细胞凋亡肿瘤组织标本进行石蜡包埋，切片厚6µm。tunel测试按试剂盒说明书进行，tunel染色切片中细胞核有黄棕色颗粒或者斑片为凋亡细胞。每组做5个切片，每个切片随机选5个高倍视野（×400），计算1000个细胞中阳性细胞所占的百分比，即凋亡指数。

数据处理及结果采用中效直线回归计算细胞半数抑制浓度（ic50）；其他计量资料用±s表示，spss13.0统计分析，比较两组间差异的显著性。结果如图3所示，细胞经黄癸素作用24h后，凋亡率明显提高，0.6、1.2和2.4mg·l^-1处理组的细胞凋亡率由对照组的2.6%分别提高至9.1%、31.5%和63.2%，而正常细胞所占的比率由对照组的83.0%分别降低到76.5%、32.4%和10.3%，浓度与凋亡率的相关系数为0.988，表现为明显的浓度依赖性诱导细胞凋亡作用（见图4）。

实施例4黄癸素对mda-mb-231细胞相关蛋白的表达

4.1westernblotting检测凋亡相关蛋白表达量收集经不同浓度黄癸素处理24h后的细胞，pbs洗2次，置于冰上，加入预冷的ripa裂解液，混匀，冰上孵育30min，10000×g离心10min，取上清液。室温5%脱脂奶粉封闭2h，pbs洗3次，加入1:1000稀释的一抗（parocaspase-3、parocaspase-9、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、兔抗人parp或cleavedparp抗体）室温孵育2h，经过pbs充分洗涤后，再与1:2000稀释的相应二抗室温反应1h，充分洗涤后，经化学发光试剂盒检测。用kodakimagestation4000mmpro对胶片进行灰度分析。

统计学分析数据资料以±s表示。用spss13.0软件进行统计学处理，excel软件进行作图。两组间均数比较采用t检验，相关性计算采用线性回归分析。

黄癸素对mda-mb-231细胞内parp活性的影响由图5可见，随着黄癸素浓度的增加，细胞内parp的表达量逐渐减少，而其裂解片段cleavedparp表达量逐渐增加（药物浓度与灰度值的相关系数分别为-0.962和0.906），表现为明显的浓度依赖性抑制作用。由图6显示，随着黄癸素浓度的增加，细胞内parocaspase-3、parocaspase-9的表达量减少（相关系数分别为－0.919和－0.888）；而他们的裂解片段cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9的表达量逐渐增加（相关系数分别为0.987和0.997）；结果表明，活化caspase对parp的剪切灭活导致其活性显著降低。

实施例5黄癸素对mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

5.1荷瘤鼠模型的建立人三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231制备成每毫升3×10³个细胞的悬液，以0.2ml接种裸鼠右侧腋窝外侧皮下，成瘤大于1g后取肿瘤组织约1mm³接种于裸鼠传代，建立裸鼠移植瘤模型。

黄癸素对移植瘤的治疗实验实验采用第2代移植瘤，分离瘤组织，剪成约1mm³、均匀一致的瘤块，接种于裸鼠皮下，待长到100mm³后，按瘤体积随机分组，设溶媒对照组（2%淀粉溶液）、阳性对照组（环磷酰胺50mg·kg^-1）和不同剂量黄癸素（120、90、60mg·kg^-1）处理组，每组8只、阳性对照组前5d每天1次、d6起每3d1次灌胃给药，其余各组每天1次灌胃给药，共13d。给药期间，隔日测量裸鼠体重并用游标卡尺测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b）。末次给药24h后，处死实验动物，取瘤称重，计算抑瘤率。将瘤组织固定于10%甲醛溶液，备用。

瘤体积=1/2×a×b²

抑瘤率/%=（1－给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%

5.2结果由裸鼠移植瘤生长曲线（见图7）可见，黄癸素治疗组与对照组比较，肿瘤生长较慢，给药4d起黄癸素中、高剂量组和ctx组的移植瘤体积与对照组差异有显著性（p<0.01）。裸鼠瘤重的差异与瘤体积变化差异的结果一致（见表2、图8），黄癸素中、高剂量组的抑瘤率分别为42.26%和71.57%（p<0.01）。

表2黄癸素对mda-mb-231细胞裸鼠移植瘤的抑制（n=8）

*p<0.05，**p<0.01较对照组；ir：瘤重抑制率；ai：凋亡指数。

实施例6黄癸素与常用化疗药物的协同抗肿瘤效应

6.1mtt法检测黄癸素体外联合给药的作用取对数生长期细胞，制备成单细胞悬液（每毫升6×10⁴~8×10⁴个细胞）。细胞接种于96孔培养板，每孔100µl，常规培养24h后加入100µl以培养液稀释的不同浓度药物。实验设空白对照、细胞对照、黄癸素和其他联用药物不同浓度单药及联用实验组，每组设4个平行孔。加药后继续培养48h，mtt法测细胞活力（波长570nm吸光度，a570），按下式计算抑制率。

抑制率=（1－药物组平均a570/对照组平均a570）×100%。

黄癸素联合用药对小鼠移植性肿瘤h22、s180的抑制作用小鼠接种肿瘤后按体重随机分成10组，每组10只。设生理盐水对照组、5-fu（25、30mg·kg^-1）、黄癸素各剂量（40、60、90mg·kg^-1）单药组和二药联用组。黄癸素每日灌胃给药，共10日，5-fu隔日腹腔注射给药，共4次。记录小鼠每日摄食量和一般情况，于末次给药后24h称体重，处死小鼠，分离瘤块称重，比较各组差异的显著性，按下式计算抑瘤率。h22小鼠用常规方法进行白细胞数和红细胞数测定，瘤组织块于10%甲醛溶液固定，制片并做he染色，镜下观察细胞形态。

抑瘤率=（1－给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%

6.2数据处理细胞实验重复二次以上，联合用药数据采用calcusyn软件处理，求出各抑制水平的联合指数（combinationindex，ci），ci＜1表示联用药物之间有协同作用，ci值越小协同作用越大；ci=1表示联用药物之间为相加或无关作用，ci＞1表示联用药物之间无协同关系，ci值越大拮抗作用的可能性越大。在体试验数据用±s表示，采用spss13.0软件进行单因素方差分析和q检验，比较组间差异的显著性。

结果

6.3黄癸素体外联合给药对肿瘤细胞的作用

黄癸素合用5-fu从ci值计算结果来判断协同作用效果可见（表3）：实验浓度下二药对sgc-7901和sw1116细胞有显著的协同抑制作用，其ci值均小于1，且ci值随黄癸素浓度升高而降低，表明其协同效果对黄癸素有浓度依赖性，对sgc-7901和sw1116细胞的ci值最低分别达0.21和0.47，对应细胞抑制率为80.9%和61.1%，分别高于单药组的73.6%（黄癸素）/50.1%（5-fu）和50.1%（黄癸素）/36.4%（5-fu）；对mgc-803细胞也表现为较显著的协同作用，仅个别组合的ci值略大于1；对hepg2细胞有一定的协同作用，在5-fu较低浓度的组合ci值小于1；二药合用对sw480细胞未见明显协同效果，抑制率略高于对应单药，而ci值大于1。参考各组的细胞抑制率可见，黄癸素与5-fu合用对各实验细胞增殖的抑制作用大多高于单用药物组，仅个别组合抑制率相近，表明二药之间无拮抗作用关系。

表3黄癸素合用5-fu/hcpt对肿瘤细胞的抑制作用

注：药物作用时间为48h。

ci值：0.1~0.3,高度协同;0.3~0.7,协同;0.7-0.9，轻度协同;0.9~1.1,相加。

黄癸素合用羟喜树碱表3所示黄癸素与羟喜树碱合用的ci值均小于1，表明二药合用对各实验细胞均有明显的协同抑制作用。对sgc-7901、sw1116细胞的协同抑制效果显著，ci值最低分别达0.16和0.18，对应细胞抑制率为71.2%和70.5%，分别高于单药组的44.6%（黄癸素）/41.9%（羟喜树碱）和47.5%（黄癸素）/37.4%（羟喜树碱）；对hepg2、sw480细胞也有较显著的协同效果。协同效果对黄癸素和羟喜树碱均有明显的浓度依赖性。

黄癸素合用顺铂/阿霉素/奥沙利铂hepg2、sw480、mgc80-3细胞的实验显示，黄癸素与顺铂或阿霉素、奥沙利铂合用在较低浓度的组合可见协同效果，高浓度组合无明显协同作用，综合细胞抑制率值的比较，未出现相互拮抗作用。如表4所见，对mgc80-3细胞的ci值多大于1；对sw480细胞在联用药为低浓度（顺铂2.5mg·l^-1、阿霉素1.25mg·l^-1、奥沙利铂1.5mg·l^-1，分别为三药的ic15、ic16和ic23）时可见ci值小于1，表现为协同效果，ci值最低分别达0.330、0.377和0.070；对hepg2细胞，黄癸素与低浓度奥沙利铂（1.5mg·l^-1）合用的ci值小于1，最低为0.310，与黄癸素浓度有明显依赖性。

表4黄癸素合用顺铂、阿霉素、奥沙利铂对肿瘤细胞的抑制作用

注：药物作用时间为48h。

ci值：0.1~0.3,高度协同;0.3~0.7,协同;0.7-0.9，轻度协同;0.9~1.1,相加。

黄癸素联合用药对动物移植性肿瘤的抑制作用

黄癸素联用5-fu对小鼠h22移植瘤的作用黄癸素联用5-fu对肿瘤增长的抑制率高于单用等剂量黄癸素（p<0.01）和5-fu（p<0.05），表现为相加或协同效果，并与黄癸素和5-fu均有明显的剂量依赖关系（表5）。小鼠肿瘤组织he染色显示，对照组小鼠肿瘤组织细胞密集排列，无明显炎症细胞浸润和肿瘤组织坏死区，5-fu、黄癸素治疗组可见瘤组织坏死，瘤细胞呈多态现象，黄癸素高剂量组有炎症细胞浸润，5-fu联合黄癸素中、高剂量治疗组与5-fu组比较瘤细胞密度进一步降低，同时有炎症细胞浸润（图9）

表5黄癸素联用5-fu对小鼠移植性肿瘤h22的影响（n=10）

注：1)ig，qd×10；2)ip，qod×4；与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；

与等剂量hb组比较：^▲p<0.05；与等剂量5-fu组比较：^△p<0.05，^△△p<0.01

黄癸素联用氟尿嘧啶对小鼠s180移植瘤的作用小鼠s180移植瘤试验结果显示，黄癸素联用氟尿嘧啶对肿瘤增长的抑制率高于单用等剂量黄癸素（p<0.01）和5-fu，表现为相加或协同效果，并与黄癸素和5-fu均有剂量依赖关系（表6）。同时发现，各组动物的体重增长与对照组比较均有减缓，但黄癸素组较5-fu组和二药联用组更轻（p<0.01），而联合用与5-fu组相比无显著性差异，可见体重增长减缓的主要原因可能来自于5-fu。

表6黄癸素联用5-fu对小鼠移植性肿瘤s180的影响（n=10）

注：1)ig，qd×10；2)ip，qod×4；与对照组比较：*p<0.05，**p<0.01；

与等剂量hb组比较：^▲p<0.05，^▲▲p<0.01。