本发明涉及保健品
技术领域：
，具体涉及一种补血组合物和补血干细胞保健品。
背景技术：
：血虚是血液失常的一种表现，是指血液生成不足或血的濡养功能减退的一种病理状态，可由失血过多，或久病阴血虚耗，或脾胃功能失常，水谷精微不能化生血液等所致。由于气与血有密切关系，故血虚每易引起气虚，而气虚不能化生血液，又为形成血虚的一个因素。血虚主症为面色萎黄、眩晕、心悸、失眠和脉虚细等。现有关于保健品的研究中，大多采用多种中药组合形成补血保健品，其组方复杂，制备过程繁琐。目前中药质量参差不齐，不能保证保健品功效的稳定，也不利于质量控制，中药质量直接影响了制剂效果。因此，现今市场上保健产品不同批次间的质量差异明显。此外，同类型的保健品中均含有酒精，不适用于肝损害的血虚病人、小孩老人或酒精过敏患者。为了解决这些问题，植物干细胞保健品技术及其相关产品近两年受到业内人士的广泛关注。所有的干细胞，不论它们的来源(植物、动物或者人类)均含有特别的表观遗传因子以及丰富的营养物质，这些物质是维持干细胞的自我更新能力。植物干细胞成分能作为动员信号，促进机体细胞再生，启动其自我更新和分化机制，更新衰老死亡细胞和修复损伤组织。基于此，已经有相关专利和文献提出通过提取植物干细胞应用于保健品中，如专利cn201210253811.3提出了一种谷物干细胞的提取方法及其在增强精力，改善睡眠品质，减少皮肤斑点及皱纹，恢复男性性功能活力，改善女性生理疼痛和/或抗衰老食品或保健品中的应用；专利201510166803.9提出了一种苹果干细胞在制备食品、药品、保健品或化妆品中的应用。目前，暂无报道植物干细胞在补血保健品中的应用。技术实现要素：为了解决现有技术中保健品质量参差不齐、制备繁琐这一技术问题，本发明提供了一种干细胞提取物的组合物，应用于制备补血保健品。本发明的具体技术方案如下：一种补血组合物，包括熟地干细胞提取物、鸡血藤根部乙醇提取物和香附根部乙醇提取物。其中，熟地作为传统补血中药，其味甘微温质润，既补血滋阴，又能补精益髓，是本发明中的主要补血物质。辅以鸡血藤和香附两中药成分，起到全方位补血、活血、养血的功效，可用于各种类型的血虚症状。三者的配伍原理为熟地长于滋养阴血，补肾填精，为补血要药，故为君药；鸡血藤为补血良药，兼具活血作用，为养血调经要药，故为臣药；佐以香附行气功效，共凑补血活血行气之功。优选地，所述熟地干细胞提取物、鸡血藤根部乙醇提取物和香附根部乙醇提取物的质量比(1～5):1:1。本发明采用的熟地干细胞提取物可为市场购得，也可以采用本发明提供的方法制备，其实施皆为本发明的保护范围。优选地，所述熟地干细胞提取物的制备方法包括以下步骤：a)将无菌熟地根茎切片置于诱导培养基中培养，得到熟地干细胞；b)将所述熟地干细胞置于增殖培养基中进行培养，得到培养物；c)取培养物中的熟地干细胞，冻融，超声，得到所述熟地干细胞提取物。优选的，所述补血组合物还包括药学上可接受的辅料；所述辅料包括甜味剂、增稠剂、防腐剂、泡腾计和胶浆剂中的一种或多种。优选地，所述补血组合物的剂型可以为口服液、糖浆剂、片剂、胶囊剂或颗粒剂。本发明还提供了一种补血干细胞保健品，该保健品中包含但不限于上述补血组合物。本发明所提供的补血干细胞保健品，包括以下重量组分：本发明所提供的一种补血组合物及其制备方法和包含该组合物的保健品的有益效果在于：(1)利用传统的补血中药熟地作为基础成分，利用现有的植物干细胞技术，通过条件的优化从熟地组织中提取分离较高生理活性的植物干细胞，并保存提取物，适合于进行大规模生产和储存。在制备补血保健品的过程中，可以按照一定的比例直接添加熟地干细胞提取物，操作简单，有利于有效控制保健品的质量。植物干细胞大都具有全能性，具备干细胞的特点，能大量扩增，形成质量稳定、富含营养物质的植物干细胞团，从而保证了制剂的功效稳定；(2)经实验研究显示，与现有补气补血口服液相比，本发明提供的干细胞补血口服液在调节造血功能和免疫功能方面具有更好的效果。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1为本发明中试或放大生产熟地干细胞口服液保健品的工艺流程图。具体实施方式为了解决现有技术中保健品质量参差不齐、制备繁琐这一技术问题，本发明实施例提供了一种补血干细胞保健品。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例11.熟地的准备(1)取熟地根茎，用自来水流水冲洗2～4h，以去除表面物质；(2)将熟地用70％～75％酒精表面消毒10～15s，然后用无菌去离子水冲洗4次；(3)将熟地用浓度为0.1％的升贡溶液分别消毒4min、6min、8min、10min，然后用无菌去离子水冲洗4次；(4)将熟地放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干水分，备用。2.熟地干细胞的分离培养(1)取购自美迪西生物医药有限公司的固体培养基，用0.1％naoh或hcl调ph值至5.8，在121℃、105kpa下，高压蒸汽灭菌20min左右后置于无菌室保存备用。其中，该固体培养基含：无机盐(硝酸钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙、碘化钾、氯化钴、磷酸二氢钠、硼酸)、维生素(肌醇、硫胺类、烟酸、l-抗坏血酸、柠檬酸)、氨基酸(l-天冬氨酸、l-精氨酸、甘氨酸、脯氨酸)、α-萘乙酸、蔗糖、活性炭、琼脂和磁化水。(2)在无菌条件下，将消毒后的熟地切成约0.5cm×0.5cm小块，然后接种于固体培养基中培养20天，将形成层细胞。接种时，每瓶2～3块，培养温度为27℃，培养ph值维持在6.0～6.5范围内。3.熟地干细胞的传代培养(1)取购自杭州百思生物技术有限公司的液体培养基，用0.1％naoh或hcl调ph值至5.8，在121℃、105kpa下，高压蒸汽灭菌20min左右后置于无菌室保存备用。其中，该液体培养基含：液体培养基的制备：将无机盐(硝酸钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙、碘化钾、氯化钴、磷酸二氢钠、硼酸)、维生素(肌醇、硫胺类、烟酸、l-抗坏血酸、柠檬酸)、氨基酸(l-天冬氨酸、l精氨酸、甘氨酸、脯氨酸)、α-萘乙酸、蔗糖、麦饭石颗粒、硒矿石颗粒和磁化水。(2)在无菌条件下，将培养20天后的层细胞转移至无菌烧瓶中继续培养10～15天，培养基为新配的液体培养基，并在显微镜下观察细胞的聚集状态和程度，至出现肉眼可见直径约为1～2cm细胞团块，转移进行放大培养。4.生物反应器放大培养(1)将烧瓶中培养的熟地干细胞转移至50l的生物反应器内进行放大培养，培养基为新配的液体培养基，培养条件为25℃，并不断搅拌；(2)培养至第10天，向生物反应器内加入无菌的蔗糖(30g/l)、甲基茉莉酮酸酯(1mg/l)和磁化水(体积10l)混合液，以补充干细胞培养营养物质，继续培养10天。5.熟地干细胞提取物的制备(1)将放大培养制得的熟地干细胞及培养液用1μm过滤器过滤，截留细胞系培养物；(2)将细胞放入-80℃超低温速冻2h后，取出解冻30min，如此反复冻融3次；(3)将反复冻融后的熟地干细胞用超声波破碎仪超声30min，然后用0.22μm的过滤器过滤，收集滤液，得到熟地干细胞提取物初提液；(4)将熟地干细胞提取物置于旋转真空蒸发仪内浓缩至固体，即得到本发明所述的熟地干细胞提取物。6.补血干细胞保健品的制备补血干细胞保健品的制备流程参见图1，其中灰色部分为操作需在30万级洁净区内进行，灰色部分以外为一般区，整个口服液保健品的制备过程在30万级无菌洁净室内完成。(1)在无菌条件下，称取熟地干细胞提取物、鸡血藤根部乙醇提取物(购自西安金绿生物工程技术有限公司)和香附根部乙醇提取物(购自西安千草生物技术有限公司)；(2)将熟地干细胞提取物加入配料罐(含有磁化水10l)中，边搅拌边加入鸡血藤根部乙醇提取物和香附根部乙醇提取物，加热至煮沸30min后；(3)加入防腐剂对羟基苯甲酸酯，搅拌混匀后过滤、冷却至室温；(4)将上述混合液转移至口服液灌装机内，罐装于10ml棕色口服液瓶中，即得到所述具有补血功能的熟地干细胞口服液保健品，该保健品可置于常温保存。按上述制备过程，分别制备如表1所示的3种补血干细胞保健品。表1.补血干细胞保健品各组分和添加剂组成比例实施例21.实验动物分组将雌雄各半、体重相近的小鼠120只随机分为6组(20只/组，雌雄各半)，分别作为空白对照组、模型对照组、补血熟地干细胞保健品组(按实施例1保健品a组分和添加剂组成比例制得的补血干细胞保健品)、阳性对照1(将黄芪4％、人参6％、山核桃仁3％、龙眼肉3％、枸杞4％、灵芝6％、五味子2％、酸枣仁3％、何首乌5％、大枣4％、菊花3％、甘草2％、莲子3％、白果3％、百合4％，红果2％按照专利cn102894440a制备得到的一种补气补血保健饮料)、阳性对照2(将阿胶1200份、党参850份、红枣1650份、枸杞子1250份、蜂蜜1150份、黄酒2000份、黑芝麻800份、水3200份按照cn103082370a制得的一种补气补血营养型保健饮料)和阳性对照3(按照cn103520391a制得的一种补血冲剂)。2.血虚动物模型的造模及给药除空白对照组外，其它各组动物于实验第2日，经皮下注射乙酰苯肼20mg/kg，于第4日，再次皮下注射乙酰苯肼40mg/kg，同时从第4日起，动物经腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，每日1次，连续4日，可得血虚证动物模型。按照不同组别的动物按照下述方法给药：(1)空白对照组：于造模第一天起灌胃给药5ml去离子水，连续给药14天，每天1次；(2)模型对照组：于造模第一天起灌胃给药5ml去离子水，连续给药14天，每天1次；(3)实验组：于造模第一天起灌胃给药5ml补血熟地干细胞保健品，连续给药14天，每天1次；(4)阳性对照1：于造模第一天起灌胃给药5ml阳性对照1的补气补血保健饮料，连续给药14天，每天1次；(5)阳性对照2：于造模第一天起灌胃给药5ml阳性对照2的补气补血营养型保健饮料，连续给药14天，每天1次；(6)阳性对照3：于造模第一天起灌胃给药5ml阳性对照3的补血冲剂，连续给药14天，每天1次。3.样本采集在第14天给药30min后，眼眶静脉取血，室温静止4h后，2500r/min离心10min，取上清，-20℃冰箱保存，用以指标检测。4.检测指标(1)检测保健品对血虚小鼠造血功能的影响血细胞分析仪检测：红细胞(rbc)、白细胞(wbc)、血红蛋白(hgb)、血小板(plt)、红细胞比容(hct)；酶联免疫法检测：血清中白细胞介素3(il-3)、促红细胞生成素(epo)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)。(2)检测保健品对血虚小鼠免疫调节功能的影响酶联免疫法检测：血清中识别性t细胞标志物(cd3)、辅助性t细胞标志物(cd4)、杀伤性t细胞标志物(cd8)、白细胞介素2(il-2)、白细胞介素6(il-6)、肿瘤坏死因子(tnf)。5.数据统计用spss13.0版数理统计软件处理各组数据，其结果用均数±标准差表示，选用t检验统计学方法判断结果的显著性，p﹤0.05即认为具有统计学意义。6.结果分析(1)保健品对血虚小鼠外周血rbc、wbc、hgb、plt和hct的影响保健品对血虚小鼠外周血rbc、wbc、hgb、plt和hct的影响结果如表2所示，结果显示，与空白对照组比较，模型组动物外周血rbc、wbc、hgb、plt和hct均明显降低(p﹤0.01)。表明乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药可明显造成血细胞数目下降。与模型组比较，对照组1、对照组2、对照组3中rbc、hgb、hct均明显增加(p﹤0.05)，表明三组药物对乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药所致的动物血细胞减少有明显的改善作用，提示三者能够改善动物的造血功能；实验组中的中rbc、hgb、hct均极显著增加(p﹤0.01)，表明本发明对乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药所致的动物血细胞减少具有极显著的改善作用；本发明的造血功能改善效果优于三组对照组。与模型组比较，对照组1、对照组2、对照组3和实验组中plt均明显增加(p﹤0.05)，表明四组对乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药所致的动物血小板减少有明显的改善作用。wbc检测表明，对照组1、对照组2、对照组3中wbc数量与模型组对比没有显著性差异(p>0.05)，而实验组中wbc的数量明显高于模型组，表明本发明对乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药所致的动物白细胞减少有明显的改善作用。表2各组动物外周血rbc、wbc、hgb、plt和hct的计数变化比较组别rbc(1012/l)wbc(109/l)hgb(g/l)hct(％)plt(109/l)空白对照组7.39±0.86**7.53±2.31**12.06±1.98**35.56±5.21**504.87±106.97**模型对照组3.48±0.453.35±1.577.56±1.6922.68±4.63358.06±147.52实验组6.48±2.48**6.18±1.59**11.54±1.79**33.65±3.68**547.49±121.89*阳性对照组14.62±0.99*4.87±2.538.16±2.05*28.52±4.60*491.73±211.67*阳性对照组24.91±1.06*4.33±2.618.20±2.67*28.94±5.18*549.64±230.79*阳性对照组35.37±1.27*4.79±1.589.68±2.38*29.77±4.37*566.82±219.83*注：与模型组比较：*表示p﹤0.05，**表示p﹤0.01。(2)保健品对血虚小鼠外周血il-3、epo、g-csf和m-csf的影响保健品对血虚小鼠外周血il-3、epo、g-csf和m-csf的影响如表3所示，结果显示：与空白对照组比较，模型组动物血清中il-3、epo、g-csf、m-csf含量明显低于对照组(p﹤0.05)，表明乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药可导致动物淋巴细胞il-3、epo、g-csf、m-csf分泌量减少。与模型组比较，对照组1～3中动物血清中il-3、epo、g-csf、m-csf含量均明显增加(p﹤0.05)，而实验组则极显著增加(p﹤0.01)说明实验组较三组对照组对造血功能促进作用更为显著。表3各组动物外周血il-3、epo、g-csf、m-csf的含量变化比较组别il-3(pg/ml)epo(iu/l)g-csf(pg/ml)m-csf(pg/ml)空白对照组3.62±1.47*1.46±0.32*32.15±9.72**119.62±18.18**模型对照组2.46±1.291.09±0.4517.79±6.2988.97±16.54实验组5.73±1.08**1.38±0.31*31.35±7.26**112.83±16.29**阳性对照组14.31±1.18*1.13±0.27*25.28±7.17*98.13±20.63*阳性对照组24.52±1.36*1.16±0.38*23.34±7.38*103.64±18.20*阳性对照组34.89±1.27*1.10±0.62*26.57±6.56*96.56±16.75*注：与模型组比较：*表示p﹤0.05，**表示p﹤0.01。(3)保健品对血虚小鼠外周血cd3、cd4、cd8含量变化的影响保健品对血虚小鼠外周血cd3、cd4、cd8含量变化的影响如表4所示，结果显示，与空白对照组比较，模型组动物血清中cd3、cd4、cd8含量明显低于对照组(p﹤0.05)。表明乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药可导致动物淋巴细胞cd3、cd4、cd8分泌量减少。与模型组比较，对照组1～3和实验组中动物血清中cd3、cd4、cd8含量均明显增加(p﹤0.05)，说明四组补血口服液对造血功能具有促进作用。表4各组动物外周血cd3、cd4、cd8的含量变化比较组别cd3(u/ml)cd4(u/ml)cd8(u/ml)空白对照组1.76±0.52*0.68±0.11*1.90±0.61**模型对照组1.11±0.280.58±0.061.17±0.53实验组1.52±0.56*0.70±0.38*1.72±0.64**阳性对照组11.51±0.27*0.70±0.07*1.37±0.45*阳性对照组21.49±0.43*0.68±0.04*1.68±0.27*阳性对照组31.46±0.49*0.66±0.07*1.61±0.51*注：与模型组比较：*表示p﹤0.05，**表示p﹤0.01。(4)保健品对血虚小鼠外周血il-2、il-6和tnf含量变化的影响保健品对血虚小鼠外周血il-2、il-6和tnf含量变化的影响如表5所示，结果显示，与空白对照组比较，模型组动物血清中il-2、il-6和tnf含量明显低于对照组(p﹤0.05)。表明乙酰苯肼和环磷酰胺联合给药可导致动物淋巴细胞il-2、il-6和tnf分泌量减少。与模型组比较，对照组1～3和实验组中动物血清中il-2、il-6和tnf含量均明显增加(p﹤0.05)，说明四组对造血功能具有促进作用。表5各组动物外周血il-2、il-6和tnf的含量变化比较注：与模型组比较：*表示p﹤0.05，**表示p﹤0.01。当前第1页12