姜黄提取物及其制备方法、用途和保健品与流程

本发明属于医药领域，具体而言，本发明涉及一种姜黄提取物及其制备方法、用途和保健品。

背景技术：

肝癌起病隐袭，进展较快，易转移等特点是导致目前肝癌患者死亡率居高不下的主要原因。药物治疗是缓解症状、改善患者生存的重要手段。当前，肝癌治疗药物远未能满足临床需求的事实蕴含着此市场潜在的巨大价值。目前临床一线抗肝癌药物有阿霉素、卡铂、顺铂、索拉非尼等药物。但是这些抗肝癌药物的临床有效率仅为10-20％。由此可以看出，开发出更为高效的抗肝癌药物具有巨大的市场潜力。

除此之外，随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，我国高血脂、肥胖症、脂肪肝患者呈逐年上升趋势。研究表明脂肪肝与心血管疾病的关系越来越紧密，其实大量的脂肪特别是甘油三酯在肝脏的集聚形成脂肪肝是导致高血脂、高血压等心血管疾病的真正的“元凶”。相反，如长期的患有血脂高，同样会导致脂肪肝，肝动脉粥样硬化后收到损害，肝小叶也同样收到损伤，从而导致结构发生变化，导致肝功能受到损害。因此降脂、保肝应双管齐下，才能保证健康。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种姜黄提取物及其制备方法、用途和保健品，该姜黄提取物对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备姜黄提取物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

(1)将姜黄进行粉碎，以便得到姜黄粉末；

(2)将所述姜黄粉末进行超临界co2萃取，以便得到脱油后姜黄粉；

(3)将所述脱油后姜黄粉与夹带剂混合后进行超临界co2萃取，以便得到姜黄提取物。

根据本发明实施例的制备姜黄提取物的方法不仅工艺简单，而且对姜黄提取物提取率较高，并且所得姜黄提取物对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。

另外，根据本发明上述实施例的制备姜黄提取物的方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，所述姜黄粉末的粒径为20-80目。

在本发明的一些实施例中，在步骤(2)中，所述超临界co2萃取过程中压力为28-50mpa，温度为40-70℃，流量为30-50hz，时间为50-200min。

在本发明的一些实施例中，在步骤(3)中，所述夹带剂为乙醇。

在本发明的一些实施例中，在步骤(3)中，所述乙醇的浓度为70-95vt％。

在本发明的一些实施例中，在步骤(3)中，所述脱油后姜黄粉与所述乙醇的质量比为1：(0.1-5)。

在本发明的一些实施例中，在步骤(3)中，所述超临界co2萃取过程的压力为10-30mpa，温度为20-60℃，时间为30-120min。

在本发明的再一个方面，本发明提出了一种姜黄提取物。根据本发明的实施例，所述姜黄提取物是采用上述所述的方法制备得到的。由此，该姜黄提取物对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。

在本发明的一些实施例中，所述姜黄提取物中姜黄素的含量为10～50wt％，姜黄油的含量为50～90wt％。

在本发明的又一个方面，本发明提出了一种保健品。根据本发明的实施例，所述保健品包括：组合物，所述组合物为上述所述的所述姜黄提取物；以及食品上可接受的添加剂。由此，该保健品具有上述的姜黄提取物，从而使其对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。

在本发明的第四个方面，本发明提出了上述所述的姜黄提取物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于抗肿瘤、保肝和降脂。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是根据本发明实施例的制备姜黄提取物的方法流程示意图；

图2是实施例3中空白对照组、油酸组、阳性对照组12.5μm、阳性对照组25μm、姜黄素组、姜黄油和姜黄提取物3的tg显微镜图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备姜黄提取物的方法。根据本发明的实施例，参考图1，该方法包括：

s100：将姜黄进行粉碎

该步骤中，将姜黄进行粉碎，以便得到姜黄粉末。具体的，姜黄粉末的粒径可以为20-80目。

s200：将姜黄粉末进行超临界co2萃取

该步骤中，将上述得到的姜黄粉末进行超临界co2萃取，以便得到脱油后姜黄粉。发明人发现，采用有机溶剂法操作温度高，生产周期长，并且会破坏产品的生物活性，而采用超临界co2进行萃取，不仅工艺简单，其使用的有机溶剂的毒性和用量远远低于常规有机溶剂萃取法，且产品纯生物活性更容易被保留。由此，采用超临界co2萃取法对姜黄粉末进行处理，不仅工艺简单，而且姜黄中姜黄素和姜黄油的生物活性不会被破坏。

根据本发明的一个实施例，该超临界co2萃取过程中压力为28-50mpa，温度为40-70℃，流量为30-50hz，时间为50-200min。

s300：将脱油后姜黄粉与夹带剂混合后进行超临界co2萃取

该步骤中，将上述得到的脱油后姜黄粉与夹带剂混合后进行超临界co2萃取，以便得到姜黄提取物。发明人发现，通过将上述得到的脱油后姜黄粉与夹带剂混合后再进行超临界co2萃取，可以显著提高姜黄提取物的提取率。具体的，所得姜黄提取物中姜黄素的含量为10～50wt％，姜黄油的含量为50～90wt％。

根据本发明的一个实施例，上述夹带剂可以为乙醇，并且乙醇的浓度可以为70-95vt％。

根据本发明的再一个实施例，脱油后姜黄粉与乙醇的质量可以比为1：(0.1-5)。由此，可以进一步提高姜黄提取物的提取率。

根据本发明的又一个实施例，该步骤中，超临界co2萃取过程的压力为10-30mpa，温度为20-60℃，时间为30-120min。由此，可以进一步提高姜黄提取物的提取率。

根据本发明实施例的制备姜黄提取物的方法不仅工艺简单，而且对姜黄提取物提取率较高，并且所得姜黄提取物对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。

在本发明的再一个方面，本发明提出了一种姜黄提取物。根据本发明的实施例，该姜黄提取物是采用上述所述的方法制备得到的。由此，该姜黄提取物对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。需要说明的是，上述针对制备姜黄提取物的方法所描述的特征和优点同样适用于该姜黄提取物，此处不再赘述。

根据本发明的一个实施例，上述姜黄提取物中姜黄素的含量为10～50wt％，姜黄油的含量为50～90wt％。

在本发明的又一个方面，本发明提出了一种保健品。根据本发明的实施例，该保健品包括组合物和食品上可接受的添加剂，其中，组合物为上述所述的姜黄提取物。由此，该保健品具有上述的姜黄提取物，从而使其对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。需要说明的是，在本文中所使用的术语“食品”应作广义理解，其可以是任何可被食用的形式，并且，上述针对姜黄提取物所描述的特征和优点同样适用于该保健品，此处不再赘述。

在本发明的第四个方面，本发明提出了上述姜黄提取物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于抗肿瘤、保肝和降脂。具体的，该药物对肝癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，并对乙酰氨基酚(apap)诱导的以谷胱甘肽(gsh)耗竭为主要机制的肝细胞损伤具有很好的保护作用，同时其对油酸引起的肝细胞内脂质含量的增加以及甘油三酯含量的升高具有显著的抑制作用。需要说明的是，上述针对姜黄提取物所描述的特征和优点同样适用于该姜黄提取物在制备药物中的用途，此处不再赘述。

根据本发明的一个实施例，上述药物可以呈选自片剂、胶囊、口服液、凝胶剂、洗剂、栓剂、泡腾片、泡腾胶囊、气雾剂以及喷雾剂的至少一种的形式。

根据本发明的再一个实施例，上述药物可以呈选自片剂和胶囊的至少一种的形式。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1、姜黄提取物的抗肿瘤增殖作用

(1)姜黄提取物1的制备

称取2.8kg的干姜黄药材，粉碎后得到40目的姜黄粉末，在萃取压力为28mpa、萃取温度40℃、萃取流量30hz的条件下，萃取时间在180min的条件下进行超临界co2萃取，制备出脱油后的姜黄粉2.21kg。

将上述脱油后的姜黄粉，在压力30mpa、温度40℃、乙醇浓度95％、w原料：w乙醇＝1：1，流量为30hz的条件下进行超临界co2萃取，提取90min，制备出0.2kg的姜黄提取物1。

(2)人肝癌细胞的培养

人肝癌(hepg-2)细胞，该细胞较好的保留了人正常肝细胞的特性，常作为正常肝细胞用于体外肝病类药物活性评价。hepg-2细胞在含10％新生牛血清的dmem培养液(含青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)中生长，培养条件为37℃、5％co2，饱和湿度。用含0.25％胰蛋白酶和0.02％edta液消化传代。

(3)姜黄提取物1对肝癌细胞增殖的抑制作用

采用mtt方法。hepg-2细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入不同浓度的待测样品，同时设溶剂对照组，每个样品浓度设3个平行孔。药物作用细胞48h后，弃去培养液，每孔加入mtt(0.5mg/ml)液100μl，继续培养4h，弃去mtt液，每孔加入dmso150μl，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。

细胞抑制率(％)＝100×(1-给药细胞od平均值/溶剂对照细胞od平均值)。

(4)实验结果

姜黄提取物1对肝癌细胞增殖抑制作用的实验结果见表1所示。从表1可以看出，姜黄提取物1对10-200μg/ml浓度作用hepg-2细胞48h，表现出对肝癌hepg-2增殖的抑制作用，并呈现明显的剂量依赖性。姜黄提取物1对肝癌细胞hepg-2增殖的抑制作用，明显优于单独的姜黄素和姜黄油样品。

表1姜黄素、姜黄油及姜黄提取物1对hepg-2细胞增殖的抑制作用

实施例2、姜黄提取物的护肝作用

(1)姜黄提取物2的制备

称取2.5kg的干姜黄药材，粉碎后得到80目的姜黄粉末，在萃取压力为50mpa、萃取温度70℃、萃取流量50hz的条件下，萃取时间在200min的条件下进行超临界co2萃取，制备出脱油后的姜黄粉2.01kg。

将上述脱油后的姜黄粉，在压力30mpa、温度60℃、乙醇浓度95％、w原料：w乙醇＝1：5，流量为30hz的条件下进行超临界co2萃取，提取120min，制备出0.3kg的姜黄提取物2。

(2)样品对apap引起体外肝细胞损伤的保护作用

采用mtt方法。hepg-2细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的待测样品(姜黄素和姜黄油的浓度分别为10μm，姜黄提取物的浓度为1μg/ml)及apap(终浓度8mm)，同时设阳性药物对照组(双环醇，bicyclol)、溶剂空白对照组及模型组，继续作用细胞48h。弃去培养液，每孔加入mtt(0.5mg/ml)液100μl，继续培养4h，弃去mtt液，每孔加入dmso150μl，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。

细胞存活率(％)＝100×(给药组od平均值/溶剂对照组od平均值)。

实验结果见表2所示，apap8mm作用hepg-2细胞48h，引起hepg-2细胞显著损伤，细胞存活率为48.93％。在该apap引起的药物性肝细胞损伤模型，姜黄素和姜黄油在10μm均未显示显著的保护作用，姜黄提取物浓度为1μg/ml对apap引起的肝细胞损伤有一定的保护活性。阳性对照药双环醇也可改善apap引起的肝细胞损伤。

表2样品对apap引起hepg-2细胞氧化性损伤的保护作用。

^###p＜0.001，与空白对照组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组比较。

实施例3、姜黄提取物的降脂作用

(1)姜黄素提取物3的制备：

称取2.0kg的干姜黄药材，粉碎后得到20目的姜黄粉末，在萃取压力28mpa、萃取温度40℃、萃取流量30hz的条件下，萃取时间在100min的条件下，制备出脱油后的姜黄粉1.12kg。

将上述脱油后的姜黄粉，在压力20mpa、温度40℃、乙醇浓度95％、w原料：w乙醇＝1：1，流量为30hz的条件下，提取90min，制备出0.18kg的姜黄提取物3。

(2)降脂模型的构建：

i油红o染色法测定脂粒

hepg-2细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的待测样品及油酸(oa，终浓度240μm)，同时设阳性药物对照组(非诺贝特，终浓度25μm、12.5μm)、溶剂空白对照组及模型组，每组设3-4个平行孔。继续作用细胞24h。弃去培养液，每孔加入pbs100μl，静置30s，弃去pbs，重复3次。每孔加入4％多聚甲醛100μl，室温静置40min，弃去4％多聚甲醛，同法pbs清洗3次。每孔加入新配制的油红o染液100μl，避光静置30min，弃去油红染液，同法pbs清洗3次，每孔加入pbs100μl，于倒置显微镜下观察并拍照。

弃去pbs，每孔加入异丙醇50μl，混合振荡器振荡，与酶标仪520nm波长处测定吸光度值。脂滴含量降低百分率(％)＝100×(模型组od平均值-给药组od平均值)/模型组od平均值。

ii甘油三酯酶法测定肝细胞内tg含量

hepg-2细胞接种于6孔细胞培养板中，培养24h后，加入无毒浓度的待测样品及油酸(oa，终浓度240μm)，同时设阳性药物对照组(非诺贝特，终浓度25μm、12.5μm)、溶剂对照组及模型组，每组设3个平行孔。继续作用细胞24h。弃去培养液，冰上收集细胞至1.5mlep管中，4℃3000rpm离心5min，弃去上清液，每管加入裂解液200μl，混匀后室温静置10min。取适量裂解后的液体转移到1.5mlep管中，70℃加热10min，室温2000rpm离心5min，上层清液用于酶学试剂盒进行tg含量测定。

tg含量降低百分率(％)＝100×(模型组od平均值-给药组od平均值)/模型组od平均值。

iii统计学分析

数据以均数平均值±标准差(±sd)表示。组间比较用t检验，以p<0.05表示有显著性差异。

实验结果见表3和表4所示。实验结果表明，油酸(oa)240μm作用hepg-2细胞24h，能够显著增加肝细胞内脂质含量，表现为：油红o染色脂滴增多(图2所示)；异丙醇溶解细胞测定od值，模型组与空白组比较od值显著升高(表3)；酶学法测定肝细胞内甘油三酯(tg)含量，模型组较空白组显著升高(表4)。

姜黄素、姜黄油和姜黄提取物3在相同的实验条件下对油酸引起的肝细胞内脂质堆积均具有一定的降低作用。姜黄提取物3对肝细胞内脂质的堆积减低作用最为显著(如图2及表2所示)。

姜黄素对于肝细胞内甘油三酯(tg)含量的降低没有降低作用。姜黄油及姜黄提取物可有效抑制肝细胞中tg的含量，并且姜黄提取物的抑制作用最为明显(见表4所示)。阳性对照组非诺贝特12.5μm和25μm显著降低油酸引起的细胞内tg含量升高。

表3油红o染色、异丙醇溶解、酶标仪分析样品对油酸引起肝细胞脂滴堆积的影响。

^#p＜0.05，与空白对照组比较；*p＜0.05，与模型组比较。

表4样品对油酸引起肝细胞内甘油三酯(tg)堆积的影响。

^###p＜0.001，与空白对照组比较；*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组比较。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。