本发明属于植物药物
技术领域：
，涉及一种红雪茶抗肿瘤活性部位及其制备方法与应用，特别是涉及一种红雪茶(又名鹿心雪茶、金丝茶，英文名称：lethariellacladonioides)多级抗肿瘤活性部位(本申请书简称amh,为antimutagen-he的缩写)的制备、其抗肿瘤作用的发现，以及作为抗肿瘤药物与辅助抗肿瘤保健品应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命安全的一个重大疾病，目前已成为人类的主要死因，严重威胁人类健康和生命安全。世界卫生组织国际癌症研究所在globocan发布的数据显示，2008年全球新发癌症病例为1266.1万例，死亡756.4万例；其中中国癌症新发病例为281.6万例，死亡195.8万例。2012年全球新增癌症病例数1410万例，死亡820万例，有3260万人带瘤生存；其中中国2012年的新增癌症病例数为306.5万例(占全球22％)，死亡220.6万例(占全球27％)，带瘤生存患者504.5万例(占全球15％)。2012年与2008年相比，癌症发病人数和死亡例数呈递增趋势，预计2025年全球癌症新发病例数将达到1900万例，2035年将达到2400万例。中国卫生部全国肿瘤登记中心公布的《2012中国肿瘤登记年报》数据，我国2012年新发癌症病例为312万例，平均每天新增癌症病例8550例，平均每分钟有6人被确证为恶性肿瘤、死亡5人；其中50岁以上人群占总发病人数80％以上，60岁以上人群的发病率大于1％。陈万青估计，我国2015年癌症新发病例数429.2万例，死亡281.4万例。我国发病率最高的癌症是肺癌、胃癌和肝癌，世界年新增的肺癌病例有1/3、新增的肝癌和食管癌有1/2发生在我国。中国卫生部信息统计中心的资料显示，20世纪70年代恶性肿瘤占我国人民死因的第三位，80年代至90年代初占死因的第二位，自1997年以来，一直占我国人民死因的第一位。资料表明，随着人口老龄化、环境污染加重及生活模式的改变，恶性肿瘤的发病率还在快速上升。癌症在世界上目前仍是一种难治之症。癌症的化学药物治疗作为全身性治疗措施，在癌症的治疗中占有极重要的地位，也是今后彻底解决癌症治疗问题的希望。临床上目前使用的癌症化疗药物，大多药物存在毒副作用大、疗效不确定、选择性差、靶向性不强以及癌细胞耐药等许多问题，使癌症化学药物治疗在临床上的应用和效果受到很大限制。中医中药是我国的医学宝库，中药往往具有多靶点、低毒性、作用持久等特点，因此从生物资源中研发天然抗癌药物，是抗癌新药研究的一个重要方向，有利于人类的抗癌事业。植物药物的化学成分非常复杂，既含有有效成分，也含有无效成分、甚至含有有毒有害成分，且成分之间还存在相互联合作用。有些植物药物中有效成分含量很低，或者组分分离后活性降低、甚至丧失，很多植物药物以功效部位进行开发应用更具有实际应用价值。因此，对植物药物中有效部位进行分离，对提高药效、减少无效或拮抗杂质成分、减轻药物毒副作用以及实际应用均具有重要价值。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法与应用。该制备方法制得的活性部位a、活性部位d、活性部位e、活性部位h、活性部位k、活性部位l、活性部位t均具有显著性抗肿瘤作用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：除非另有说明，本文中所用的术语具有如下含义：本申请中所述的“红雪茶”属地衣类梅花衣科植物，产于高海拔地区，《本草纲目》有记载，民间有用于疾病治疗和保健历史。又名“鹿心雪茶”、“金丝茶”等，英文名为“lethariellacladonioides”。本申请中所述的“红雪茶抗肿瘤活性部位”系指由以本申请的红雪茶为原料，结合抗肿瘤活性检测，采用植物化学提取分离手段分离得到的具有显著性抗肿瘤作用的混合物，其中含有多种化合物，具体活性化合物未进一步分离。本申请中所述的a、d、e、h、k、l和t为该红雪茶的不同抗肿瘤活性部位的代号。本申请中所述的“制剂制作”系指本申请红雪茶抗肿瘤活性部位以不同的“药物可接受的载体”制成不同的药物制剂。本申请中所述的“药物制剂”系指本申请红雪茶抗肿瘤活性部位，与通常被本领域所接受的将生物活性物质输送至诸如人类等哺乳动物的介质共同使用所形成的制剂。这样的介质包括所有药物可接受的载体。本申请中所述的“药物可接受的载体”意指包括但不限于已经被美国食品与药品管理局(fda)认可的、可用于人类或动物的任何佐剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、香味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、崩解剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。术语“治疗”意为将本发明所述红雪茶抗肿瘤活性部位或制剂进行给药以改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：(i)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；(ii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。“辅助抗肿瘤保健品”是指在肿瘤病人的治疗过程中，用于肿瘤病人的辅助治疗，可能对肿瘤病人的治疗具有增敏、增效作用，但不以治疗为目的保健品。红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法，包括如下步骤：步骤(1)，将地衣红雪茶干燥后粉碎，以体积浓度为60％-70％乙醇为提取溶剂，提取多次；地衣红雪茶与每次所用的提取溶剂的料液比为1g:4-5ml；合并提取液浓缩至膏状，得到初级提取物；步骤(2)，将初级提取物与蒸馏水按质量比为1-2:1混合成混悬状，然后向其中加入体积浓度为95％-100％的乙醇，得到混合液；其中，乙醇的加入量为使所得的混合液中乙醇的体积浓度大于80％；之后对混合液振摇进行醇沉，振摇至混合均匀后，静置20-24小时，离心，取上层液体；余下沉淀物再采用体积浓度为80％的乙醇多次醇沉，离心取上层液体，每次醇沉所用的体积浓度为80％的乙醇的体积是沉淀物体积2-3倍体积；合并所有上层液体，浓缩至膏状，得到活性部位a；步骤(3)，将活性部位a与蒸馏水按质量比为1-2:1混合成混悬状，得到混悬液；之后在搅拌振摇条件下，向混悬液中加入体积是混悬液体积3-4倍的氯仿，待混合均匀后，静置分层，取氯仿萃取液层，水相层离心分离氯仿萃取液；水相层再用氯仿反复萃取、离心3-4次，每次萃取所用氯仿的体积为被提萃取的水相层体积的2-3倍，合并所有氯仿萃取液，浓缩至膏状，得到活性部位d；步骤(4)，将活性部位d用体积为活性部位d体积3-4倍的乙醚搅拌溶解成混悬状后，静置1-2小时，离心，取乙醚上清液；余下沉淀物继续以乙醚提取3-4次，每次提取所用乙醚的体积为沉淀物体积的2-3倍，合并乙醚上清液及所有乙醚提取液，浓缩至膏状，得到活性部位k；步骤(5)，将活性部位d采用硅胶柱进行柱层析分离，洗脱溶剂依次为石油醚、体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂、氯仿、体积比为100:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为20:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为10:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、甲醇进行梯度洗脱，除首次所用石油醚体积为所用硅胶柱体积的3-4倍外，其余每种洗脱溶剂所用的体积均为所用硅胶柱体积的2-3倍，tlc跟踪，合并相同部分，并浓缩除去溶剂；之后对浓缩物顺序编号，并进行常规体外抗肿瘤作用活性检测(以分析纯dmso溶解成20mg/ml浓度，以试验浓度为20μg/ml进行体外抗肿瘤作用活性检测)，将对癌细胞生长抑制率大于60％的编号相连浓缩物合并为一个有效活性部位，得到活性部位e、活性部位h和活性部位l’；体外抗肿瘤作用活性检测的检测方法是现有方法；步骤(6)，对活性部位l’采用体积为活性部位l’3-4倍的乙酸乙酯溶解成混悬状态后，离心，取上清液；余下沉淀物继续以乙酸乙酯提取3-4次，每次提取所用乙酸乙酯的体积为沉淀物体积的2-3倍，合并上清液及所有乙酸乙酯提取液，浓缩成膏状，得到活性部位l；步骤(7)，将活性部位e、h和l活性部位合并，再以氯仿为萃取溶剂进行萃取，每次萃取所用氯仿的体积为被萃取物体积的3-4倍，萃取3-4次，分离氯仿萃取液，之后合并所有氯仿萃取液，浓缩并干燥，得到活性部位t。进一步，优选的是，步骤(1)中，提取次数为4-5次。进一步，优选的是，步骤(2)中，醇沉次数为3-4次。进一步，优选的是，步骤(5)中，将活性部位d采用硅胶柱进行梯度洗脱前，进行干法上样；硅胶柱内装硅胶为200-300目硅胶粉；干法上样具体为：将活性部位d以氯仿溶解，活性部位d与氯仿的料液比为1g:2-3ml，之后以200-300目硅胶粉拌样吸附，放阴凉通风处挥发有机溶剂，之后上样。进一步，优选的是，步骤(2)、(3)、(4)、(6)中，离心参数为2500-3500转/分钟、离心5分钟。本发明还提供上述红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法制备得到的活性部位a、活性部位d、活性部位e、活性部位h、活性部位k、活性部位l或活性部位t。本发明同时提供上述红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法制备得到的活性部位a、活性部位d、活性部位e、活性部位h、活性部位k、活性部位l或活性部位t在制备抗肿瘤药物或辅助抗肿瘤保健品中的应用。上述活性部位具有广谱抗肿瘤作用，可以作为抗肿瘤药物用于肿瘤病人的治疗。上述抗肿瘤的药物还包括药物可接受的载体。本领域所属技术人员根据给药对象和肿瘤类型的情况可以确定活性部位在药物组合物中具体的治疗有效量。在一些实施方案中，活性成分有效量可以占药物组合物重量的1-100％。进一步，优选的是，所述的药物剂型和辅助抗肿瘤保健品的剂型为浸膏、片剂、胶囊、口服液、颗粒剂或冲剂，但不限于此。进一步，优选的是，所述的所述肿瘤为以下人类肿瘤中的任一种：肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、鼻咽癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、骨肉瘤、胃癌、结肠癌、胆管癌、胆囊癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴癌、神经胶质瘤、皮肤癌、肌肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌，但不限于此。本发明另外提供一种联合抗肿瘤药物组合物，其活性成分包括上述制备方法制备得到的活性部位a、活性部位d、活性部位e、活性部位h、活性部位k、活性部位l和活性部位t中的至少一种，还包括顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺中的至少一种。本发明对地衣红雪茶干燥和粉碎的程度没有具体限制，通常为干燥至可以进行常规机械粉碎，粉碎至粗粉末程度即可。本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明的红雪茶抗肿瘤活性部位(a、d、e、h、k、l和t)，系从地衣红雪茶(又名鹿心雪茶或金丝茶，英文lethariellacladonioides)中提取分离。红雪茶抗肿瘤活性部位可作为肿瘤治疗药物，或作为抗肿瘤药物活性成分的抗肿瘤药物组合物，或作为联合抗肿瘤药物组合物，以及作为辅助抗肿瘤的保健品。红雪茶抗肿瘤活性部位体外能显著性杀灭和/或抑制人类多种肿瘤细胞，如宫颈癌细胞hela、鼻咽癌细胞cne、肺癌细胞(xwlc-05，a-549，nci-h157，nci-h460)、白血病细胞k-562、淋巴癌wsu-dlcl2、肝癌细胞(hepg2，qgy-7703)、胆管癌细胞qbc-939、胆囊癌细胞gbc-sd、神经胶质瘤细胞u-251、乳腺癌细胞(mcf-7,t-47d,mda-mb-453,mda-mb-468,mda-mb-231,hs-578t,bt-549andbt-474)、前列腺癌细胞pc-3、膀胱癌细胞t-24、肾癌细胞achn、胃癌细胞sgc-7901、结肠癌细胞hct-116、卵巢癌skov-3、子宫内膜癌细胞rl-952、胰腺癌细胞panc-1、皮肤癌细胞a-431、骨肉瘤细胞saos2等。该红雪茶抗肿瘤活性部位体内对balb/c裸鼠移植人类肿瘤如肝癌hepg2、肝癌qgy-7703、宣威肺癌xwlc-05、肺癌nci-h460、宫颈癌hela等，以及对小鼠移植动物肿瘤如小鼠肉瘤s-180、小鼠肝癌h22、小鼠肺腺癌3ll等，均具有显著性的生长抑制作用。该红雪茶抗肿瘤活性部位与临床使用的抗肿瘤化疗药物如环磷酰胺、顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇具有协同/或相加联合抗肿瘤作用。该红雪茶抗肿瘤活性部位具有细胞靶向性抗癌作用，不同癌细胞株的敏感性有较大差异，人类hela、xwlc-05、cne、k-562、wsu-dlcl2、a-549、qbc-939、gbc-sd、hepg2、qgy-7703、mcf-7、t-47d、mda-mb-453、mda-mb-468、hs-578t、bt-549、bt-474、u-251、hct-116、t-24、achn、skov-3、panc-1、a-431、saos2等对红雪茶抗肿瘤活性部位非常敏感。该红雪茶抗肿瘤活性部位具有选择性抗肿瘤作用，在同等剂量下对肿瘤细胞的杀灭和/或抑制作用显著性大于对人体正常细胞的杀灭和/或抑制作用。附图说明图1为红雪茶活性部位d体外抗癌作用的剂量-效应关系(72h)；图2为红雪茶活性部位k体外抗癌作用的剂量-效应关系(72h)；图3为红雪茶活性部位l体外抗癌作用的剂量-效应关系(72h)；图4为红雪茶活性部位t体外抗癌作用的剂量-效应关系(72h)；图5为红雪茶活性部位d体外抗癌作用的时间-效应关系(a-549)；图6为红雪茶活性部位d体外抗癌作用的时间-效应关系(mda-mb-453)；图7为红雪茶活性部位h体外抗癌作用的时间-效应关系(mcf-7)；图8为红雪茶活性部位t体外抗癌作用的时间-效应与剂量-效应关系(t-24)；图9为dmso溶剂对照组和红雪茶活性部位t体外抗癌作用的时间-效应与剂量-效应关系(achn)；图10为dmso溶剂对照组和活性部位a体外对人乳腺癌mcf-7体外抗癌作用的显微镜下结果；图11为活性部位e体外对人乳腺癌mcf-7体外抗癌作用的显微镜下结果；图12为红雪茶活性部位d体外选择性抗癌作用；图13为红雪茶活性部位k体外选择性抗癌作用；图14为红雪茶活性部位l对移植性肿瘤nci-h460的抑制作用(rtv)；图15为不同时间点宫颈癌hela的相对肿瘤体积(rtv)；图16为不同时间点宫颈癌hela的肿瘤相对增殖率(rpr)；图17为红雪茶活性部位t与顺铂体内联合抗宣威肺癌作用(rpr)；图18为红雪茶活性部位t与ddp联合用药对xwlc-05生长的影响(rtv)；图19为红雪茶活性部位l(图中l1、l2)对肝癌细胞qgy-7703中cleavedparp含量的影响；图20为红雪茶活性部位l(图中l2、l3)对结肠癌细胞hct-116中cleavedparp含量的影响。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。本发明中100克的干燥红雪茶粉末，可以提取得到6-8克活性部位a。100克活性部位a，可得到30-35克活性部位d。100克活性部位d，可得到70-80克活性部位k。100克活性部位d通过硅胶柱柱层析，可得到8-10克活性部位e，18-20克活性部位h，35-40克活性部位l。合并e、h、l后，氯仿萃取得到50-60克活性部位t。实施例1红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法，包括如下步骤：步骤(1)，将地衣红雪茶干燥后粉碎，以体积浓度为60％乙醇为提取溶剂，提取5次；地衣红雪茶与每次所用的提取溶剂的料液比为1g:5ml；合并提取液浓缩至膏状，得到初级提取物；步骤(2)，将初级提取物与蒸馏水按质量比为1:1混合成混悬状，然后向其中加入体积浓度为100％的乙醇，得到混合液；其中，乙醇的加入量为使所得的混合液中乙醇的体积浓度大于80％；之后对混合液振摇进行醇沉，振摇至混合均匀后，静置20小时，3500转/分钟，离心5分钟，取上层液体；余下沉淀物再采用体积浓度为80％的乙醇进行醇沉4次，离心取上层液体，每次醇沉所用的体积浓度为80％的乙醇的体积是沉淀物体积2倍体积；合并所有上层液体，浓缩至膏状，得到活性部位a；步骤(3)，将活性部位a与蒸馏水按质量比为1:1混合成混悬状，得到混悬液；之后在搅拌振摇条件下，向混悬液中加入体积是混悬液体积4倍的氯仿，待混合均匀后，静置分层，取氯仿萃取液层，水相层离心(3500转/分钟，5分钟)分离氯仿萃取液；水相层再用氯仿反复萃取3次，每次萃取所用氯仿的体积为被提萃取的水相层体积的3倍，合并所有氯仿萃取液，浓缩至膏状，得到活性部位d；步骤(4)，将活性部位d用体积为活性部位d体积3倍的乙醚搅拌溶解成混悬状后，静置2小时，离心(3500转/分钟，5分钟)，取乙醚上清液；余下沉淀物继续以乙醚提取4次，每次提取所用乙醚的体积为沉淀物体积的2倍，合并乙醚上清液及所有乙醚提取液，浓缩至膏状，得到活性部位k；步骤(5)，将活性部位d采用硅胶柱进行柱层析分离，洗脱溶剂依次为石油醚、体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂、氯仿、体积比为100:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为20:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为10:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、甲醇进行梯度洗脱，除首次所用石油醚体积为所用硅胶柱体积的3倍外，其余每种洗脱溶剂所用的体积均为所用硅胶柱体积的2倍，tlc跟踪，合并相同部分，并浓缩除去溶剂；之后对浓缩物顺序编号，并进行体外抗肿瘤作用活性检测(以分析纯dmso溶解成20mg/ml浓度，以试验浓度为20μg/ml进行体外抗肿瘤作用活性检测)，将对癌细胞生长抑制率大于60％的编号相连浓缩物合并为一个有效活性部位，得到活性部位e、活性部位h和活性部位l’；其中，将活性部位d采用硅胶柱进行梯度洗脱前，进行干法上样；硅胶柱内装柱硅胶为200-300目硅胶粉；干法上样具体为：将活性部位d以氯仿溶解，活性部位d与氯仿的料液比为1g:3ml，之后以200-300目硅胶粉拌样吸附，放阴凉通风处挥发有机溶剂，之后上样；步骤(6)，对活性部位l’采用体积为活性部位l’3倍的乙酸乙酯溶解成混悬状态后，于3500转/分钟离心5分钟，取上清液；余下沉淀物继续以乙酸乙酯提取离心4次，每次提取所用乙酸乙酯的体积为沉淀物体积的2倍，合并上清液及所有乙酸乙酯提取液，浓缩成膏状，得到活性部位l；步骤(7)，将活性部位e、h和l活性部位合并，再以氯仿为萃取溶剂进行萃取，每次萃取所用氯仿的体积为被萃取物体积的3倍，萃取4次，分离氯仿萃取液，之后合并所有氯仿萃取液，浓缩并干燥，得到活性部位t。实施例2红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法，包括如下步骤：步骤(1)，将地衣红雪茶干燥后粉碎，以体积浓度为70％乙醇为提取溶剂，提取4次；地衣红雪茶与每次所用的提取溶剂的料液比为1g:4ml；合并提取液浓缩至膏状，得到初级提取物；步骤(2)，将初级提取物与蒸馏水按质量比为2:1混合成混悬状，然后向其中加入体积浓度为95％的乙醇，得到混合液；其中，乙醇的加入量为使所得的混合液中乙醇的体积浓度大于80％；之后对混合液振摇进行醇沉，振摇至混合均匀后，静置24小时，离心(2500转/分钟，5分钟)，取上层液体；余下沉淀物再采用体积浓度为80％的乙醇进行醇沉3次，取上层液体，每次醇沉所用的体积浓度为80％的乙醇的体积是沉淀物体积3倍体积；合并所有上层液体，浓缩至膏状，得到活性部位a；步骤(3)，将活性部位a与蒸馏水按质量比为2:1混合成混悬状，得到混悬液；之后在搅拌振摇条件下，向混悬液中加入体积是混悬液体积3倍的氯仿，待混合均匀后，静置分层，取氯仿萃取液层，水相层离心(2500转/分钟，5分钟)分离氯仿萃取液；水相层再用氯仿反复萃取4次，每次萃取所用氯仿的体积为被提萃取的水相层体积的2倍，合并所有氯仿萃取液，浓缩至膏状，得到活性部位d；步骤(4)，将活性部位d用体积为活性部位d体积4倍的乙醚搅拌溶解成混悬状后，静置1小时，离心，取乙醚上清液；余下沉淀物继续以乙醚提取3次，每次提取所用乙醚的体积为沉淀物体积的3倍，合并乙醚上清液及所有乙醚提取液，浓缩至膏状，得到活性部位k；步骤(5)，将活性部位d采用硅胶柱进行柱层析分离，洗脱溶剂依次为石油醚、体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂、氯仿、体积比为100:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为20:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为10:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、甲醇，除首次所用石油醚体积为所用硅胶柱体积的4倍外，其余每种洗脱溶剂所用的体积均为所用硅胶柱体积的3倍，tlc跟踪，合并相同部分，并浓缩除去溶剂；之后对浓缩物顺序编号，并进行体外抗肿瘤作用活性检测(以分析纯dmso溶解成20mg/ml浓度，以试验浓度为20μg/ml进行体外抗肿瘤作用活性检测)，将对癌细胞生长抑制率大于60％的编号相连浓缩物合并为一个有效活性部位，得到活性部位e、活性部位h和活性部位l’；其中，将活性部位d采用硅胶柱进行梯度洗脱前，进行干法上样；硅胶柱内装柱硅胶为200-300目硅胶粉；干法上样具体为：将活性部位d以氯仿溶解，活性部位d与氯仿的料液比为1g:2ml，之后以200-300目硅胶粉拌样吸附，放阴凉通风处挥发有机溶剂，之后上样；步骤(6)，对活性部位l’采用体积为活性部位l’4倍的乙酸乙酯溶解成混悬状态后，于2500转/分钟离心5分钟，取上清液；余下沉淀物继续以乙酸乙酯提取3次，每次提取所用乙酸乙酯的体积为沉淀物体积的3倍，合并上清液及所有乙酸乙酯提取液，浓缩成膏状，得到活性部位l；步骤(7)，将活性部位e、h和l活性部位合并，再以氯仿为萃取溶剂进行萃取，每次萃取所用氯仿的体积为被萃取物体积的4倍，萃取3次，分离氯仿萃取液，之后合并所有氯仿萃取液，浓缩并干燥，得到活性部位t。实施例3红雪茶抗肿瘤活性部位的制备方法，包括如下步骤：步骤(1)，将地衣红雪茶干燥后粉碎，以体积浓度为65％乙醇为提取溶剂，提取4次；地衣红雪茶与每次所用的提取溶剂的料液比为1g:4.5ml；合并提取液浓缩至膏状，得到初级提取物；步骤(2)，将初级提取物与蒸馏水按质量比为1.5:1混合成混悬状，然后向其中加入体积浓度为98％的乙醇，得到混合液；其中，乙醇的加入量为使所得的混合液中乙醇的体积浓度大于80％；之后对混合液振摇进行醇沉，振摇至混合均匀后，静置22小时，离心(3000转/分钟，5分钟)，取上层液体；余下沉淀物再采用体积浓度为80％的乙醇进行醇沉3次，离心取上层液体，每次醇沉所用的体积浓度为80％的乙醇的体积是沉淀物体积2.5倍体积；合并所有上层液体，浓缩至膏状，得到活性部位a；步骤(3)，将活性部位a与蒸馏水按质量比为1.5:1混合成混悬状，得到混悬液；之后在搅拌振摇条件下，向混悬液中加入体积是混悬液体积3.5倍的氯仿，待混合均匀后，静置分层，取氯仿萃取液层，水相层离心(3000转/分钟，5分钟)分离氯仿萃取液；水相层再用氯仿反复萃取4次，每次萃取所用氯仿的体积为被提萃取的水相层体积的2.5倍，合并所有氯仿萃取液，浓缩至膏状，得到活性部位d；步骤(4)，将活性部位d用体积为活性部位d体积3.5倍的乙醚搅拌溶解成混悬状后，静置1.5小时，离心(3000转/分钟，5分钟)，取乙醚上清液；余下沉淀物继续以乙醚提取3次，每次提取所用乙醚的体积为沉淀物体积的2.5倍，合并乙醚上清液及所有乙醚提取液，浓缩至膏状，得到活性部位k；步骤(5)，将活性部位d采用硅胶柱进行柱层析分离，洗脱溶剂依次为石油醚、体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂、氯仿、体积比为100:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为20:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为10:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶剂、甲醇，除首次所用石油醚体积为所用硅胶柱体积的3.5倍外，其余每种洗脱溶剂所用的体积均为所用硅胶柱体积的2.5倍，tlc跟踪，合并相同部分，并浓缩除去溶剂；之后对浓缩物顺序编号，并进行体外抗肿瘤作用活性检测(以分析纯dmso溶解成20mg/ml浓度，以试验浓度为20μg/ml进行体外抗肿瘤作用活性检测)，将对癌细胞生长抑制率大于60％的编号相连浓缩物合并为一个有效活性部位，得到活性部位e、活性部位h和活性部位l’；其中，将活性部位d采用硅胶柱进行梯度洗脱前，进行干法上样；硅胶柱内装柱硅胶为200-300目硅胶粉；干法上样具体为：将活性部位d以氯仿溶解，活性部位d与氯仿的料液比为1g:2.5ml，之后以200-300目硅胶粉拌样吸附，放阴凉通风处挥发有机溶剂，之后上样；步骤(6)，对活性部位l’采用体积为活性部位l’3.5倍的乙酸乙酯溶解成混悬状态后，于3000转/分钟离心5分钟，取上清液；余下沉淀物继续以乙酸乙酯提取4次，每次提取所用乙酸乙酯的体积为沉淀物体积的2.5倍，合并上清液及所有乙酸乙酯提取液，浓缩至膏状，得到活性部位l；步骤(7)，将活性部位e、h和l活性部位合并，再以氯仿为萃取溶剂进行萃取，每次萃取所用氯仿的体积为被萃取物体积的3.5倍，萃取4次，分离氯仿萃取液，之后合并所有氯仿萃取液，浓缩并干燥，得到活性部位t。实施例4红雪茶抗肿瘤活性部位的抗肿瘤作用、选择性抗肿瘤作用、细胞靶向性抗肿瘤作用、联合抗肿瘤作用的生物学实验结果下面通过部分具体实验例证来说明本发明的红雪茶抗肿瘤活性部位具有显著性、选择性、细胞靶向性抗肿瘤作用，以及与临床抗肿瘤药物的联合抗肿瘤作用。1.红雪茶抗肿瘤活性部位体外抑制和/或杀灭人类癌细胞作用：体外抗肿瘤试验方法：本发明红雪茶抗肿瘤活性部位以分析纯dmso溶解成不同的浓度梯度进行体外抗肿瘤试验。采用常规体外肿瘤细胞培养试验方法，收集培养的对数生长期人类癌细胞，以dmem/f12完全培养液混悬后接种于96孔板，每孔加入200μl细胞悬液(不同细胞株的接种细胞密度不一样，大部分癌细胞的密度为7×103个细胞/孔)，每浓度、每测定时间点做8个平行复孔。接种细胞后的培养板放37℃、5％co2培养箱培养，24小时后采用mtt法测定1个96孔板的od值作为加药时的0小时值；其余培养板吸去培养液，然后按研究设计分别加入含有相应浓度的本发明红雪茶抗肿瘤活性部位的培养液200μl，同时设dmso溶剂对照和抗癌药物阳性对照(顺铂，pbs溶解，使用浓度3μm)。同时做3组平行。培养板在加药后放37℃、5％co2培养箱继续培养，于加药后24h、48h、72h，分别取一组细胞，采用mtt法测定每孔的od值，计算抑制率，绘制不同时间、不同剂量下细胞生长曲线，测定本发明红雪茶抗肿瘤活性部位体外抗癌作用的时间-效应和每个时间点的剂量-效应关系，采用spss软件计算半数抑制浓度(ic50)。也可以只测定药物作用72小时后的剂量-效应关系，或采用筛选试验在显微镜下观察记录72h的作用结果。mtt法按下式计算癌细胞的生长抑制率：抑制率(％)＝(溶剂对照组校正od值-本发明红雪茶抗肿瘤活性部位组的校正od值)/溶剂对照组校正od值×100校正od值＝实验组实际测量的od值-无细胞空白对照组的od值结果：红雪茶抗肿瘤活性部位(a、d、e、h、k、l和t)对人类癌细胞株如宣威肺癌细胞xwlc-05、肺癌细胞a-549、肺癌nci-h460、肺癌nci-h157、肝癌细胞hepg2、乳腺癌细胞mcf-7、膀胱癌细胞t-24、鼻咽癌细胞cne、宫颈癌细胞hela、子宫内膜癌rl-952、白血病细胞k-562、淋巴癌wsu-dlcl2、肝癌细胞qgy-7703、胆管癌细胞qbc-939、胆囊癌细胞gbc-sd、神经胶质瘤细胞u-251、前列腺癌细胞pc-3、肾癌细胞achn、结肠癌细胞hct-116、胃癌细胞sgc-7901、卵巢癌细胞skov-3、胰腺癌细胞panc-1、皮肤癌细胞a-431、骨肉瘤细胞saos2等均具有极显著性体外抗癌作用，体外抗肿瘤作用存在明显的剂量-效应和/或时间-效应关系。本发明的部分红雪茶抗肿瘤活性部位对部分癌细胞的体外抗癌72小时剂量-效应关系见图1-图4、时间-效应与剂量-效应关系结果见图5-图9。药物处理72小时，本发明红雪茶抗肿瘤活性部位d对mcf-7、t-47d、mda-mb-453、mda-mb-468、mda-mb-231、bt-549、bt-474的ic50(半数抑制浓度)分别为28.59、27.26、11.52、27.85、43.241、28.28和22.01μg/ml；活性部位k对mcf-7、mda-mb-453、bt-474的ic50(半数抑制浓度)分别为10.76、8.14和13.96μg/ml；活性部位l对mcf-7、a-549、hct-116、qgy-7703的ic50(半数抑制浓度)分别为13.79、23.41、16.56和35.41μg/ml；活性部位t对t-24、achn、pc-3、u-251、hepg2、xwlc-05的ic50(半数抑制浓度)分别为6.19、12.89、9.70、6.63、17.28和>32μg/ml。由于活性部位d、k、l和t样品深颜色的干扰，显微镜下观察的实际抑制率远远大于mtt测定的抑制率。活性部位a、e、h等在检测中采用细胞计数法和显微镜下观察法进行体外抗癌活性检测，都显示显著性体外抗癌作用及剂量-效应关系，见图10、图11；活性部位h对人乳腺癌mcf-7的72小时ic50值为25.47μg/ml(图7)。2.选择性抗癌作用本发明红雪茶抗肿瘤活性部位在同等的剂量和试验条件下，对人正常乳腺上皮细胞mcf-10a和mcf-12a、血管内皮细胞huvec、肺上皮细胞beas-2b的生长抑制和/或杀灭作用显著性低于对许多人类癌细胞株的生长抑制和/或杀灭作用。如活性部位k在对人乳腺癌mcf-7的体外抑制率大于90％时的剂量下对人体正常乳腺上皮细胞株mcf-10a和mcf-12a几乎无细胞生长抑制作用，呈现非常明显的选择性抗癌作用。红雪茶活性部位的选择性抗癌作用见图12、图13。3.细胞靶向性抗癌作用体外抗癌试验结果表明，本发明红雪茶抗肿瘤活性部位对不同癌细胞株的抑制率存在显著性差异，大多数人类癌细胞对本发明的红雪茶抗肿瘤活性部位很敏感，本发明红雪茶抗肿瘤活性部位的体外抗癌作用具有细胞靶向性。不同癌细胞对同一活性部位的ic50(半数抑制浓度)差异较大，如活性部位d对mcf-7、t-47d、mda-mb-453、mda-mb-231、bt-549、bt-474的ic50值分别为28.59、27.26、11.51、43.24、28.28和22.01μg/ml(见图1)；活性部位k对mcf-7、mda-mb-453、bt-474的ic50值分别为10.76、8.79和13.96μg/ml(见图2)；活性部位l对mcf-7、a-549、hct-116、qgy-7703的ic50值分别为13.79、23.41、16.56和35.41μg/ml(见图3)；活性部位t对achn、pc-3、t-24、u-251、hepg2、xwlc-05的ic50值分别为14.22、9.70、4.26、6.63、17.28和>32μg/ml(见图4)。4.对临床抗癌药物的增敏作用体外抗癌试验结果显示，红雪茶抗肿瘤活性部位与顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇等临床抗癌药物联合用药，对某些癌细胞株具有协同或相加抗癌作用，红雪茶抗肿瘤活性部位可以作为临床抗癌药物的增敏药物或联合用药组合物。红雪茶抗肿瘤活性部位d与顺铂(ddp)联合应用对人肺癌a-549的体外抑制作用见表1，与5-氟尿嘧啶(5-fu)联合应用对人肺癌a-549的体外抑制作用见表2。均显示具有良好的协同抗癌作用。表1.红雪茶活性部位d与顺铂(ddp)联合应用对a-549的抑制作用空白处为非联合用药组，无q值。表2.红雪茶活性部位d与5-氟尿嘧啶(5-fu)联合应用对a-549的抑制作用空白处为非联合用药组，无q值。红雪茶抗肿瘤活性部位t与顺铂ddp联合应用对人膀胱癌t-24的体外抑制作用见表3，与ddp联合应用对人肾癌achn的体外抑制作用见表4。显示具有良好的协同抗癌作用。表3红雪茶抗肿瘤活性部位t与顺铂联合应用对t-24的抑制作用空白处为非联合用药组，无q值。表4.红雪茶抗肿瘤活性部位t与顺铂联合应用对achn的抑制作用空白处为非联合用药组，无q值。红雪茶抗癌活性部位k与紫杉醇联合应用对人乳腺癌mcf-7和mda-mb-453的抑制作用见表5、表6，显示具有协同或相加抗癌作用。表5.红雪茶抗肿瘤活性部位k与紫杉醇联合应用对mcf-7的抑制作用空白处为非联合用药组，无q值。表6.红雪茶活性部位k与紫杉醇联合应用对mda-mb-453的抑制作用空白处为非联合用药组，无q值。5.红雪茶抗肿瘤活性部位抑制动物体内移植性动物肿瘤生长作用实验方法：小鼠肉瘤s-180、肝癌h-22或肺腺癌3ll肿瘤细胞经小鼠腹水传代2次后，无菌条件下抽取生长良好呈米汤样的小鼠腹水，用灭菌生理盐水稀释成5×107个瘤细胞/ml。取昆明种小鼠、icr小鼠、c57bl/6j小鼠，对小鼠左腋皮下注射进行肿瘤细胞接种，每只接种0.1ml(约5×106个瘤细胞)，制成皮下移植瘤模型。接种后将小鼠称重并随机分为dmso溶剂对照组、活性部位给药组，每组雌雄各半。活性部位以分析纯dmso溶解，溶剂对照组给予溶剂dmso，其他各组给予相应的待测物。于接种后的第二天开始腹腔注射给药，隔天给药一次，每只小鼠每次给药0.05ml。于最后一次给药后的第二天脱臼处死小鼠，称重，完整剥取实体瘤并称重。按以下公式计算抑瘤率，进行统计分析。抑瘤率＝(1-t/c)×100％t：给药组平均瘤重c：溶剂对照组平均瘤重5.1红雪茶抗肿瘤活性部位d对昆明种小鼠体内移植性小鼠肉瘤s-180生长抑制作用见表7，对icr小鼠体内移植性小鼠肝癌h-22体内生长抑制作用见表8，对c57bl/6j小鼠体内移植性小鼠肺腺癌3ll肿瘤体内生长抑制作用见表9。表7.活性部位d对小鼠移植肉瘤s-180的体内生长抑制作用(n＝12)与对照组比较,*p＜0.05.表8.活性部位d对小鼠移植肝癌h-22的体内生长抑制作用表9.活性部位d对c57bl/6j小鼠移植肺癌3ll的瘤重和抑瘤率结果显示活性部位d能显著性抑制小鼠移植的动物肉瘤s-180、肝癌h-22和肺癌3ll的生长，具有明显的体内抗肿瘤作用。5.2红雪茶抗肿瘤活性部位l对小鼠移植性小鼠肉瘤s-180的体内生长抑制作用结果见表10，对小鼠肝癌h-22的体内生长抑制作用结果见表11。表10.活性部位l对小鼠s-180肉瘤的体内抑制作用组别剂量(mg/kg)体重(g)肿瘤重(g)抑瘤率(％)p值溶剂对照------18.722.0708------------活性部位l10018.701.041649.700.0018表11.活性部位l对小鼠肝癌h22的体内抑制作用组别剂量(mg/kg)体重(g)肿瘤重(g)抑瘤率(％)p值溶剂对照------20.902.6157------------活性部位l10020.871.388346.920.04326.红雪茶抗肿瘤活性部位对裸鼠体内移植性人类肿瘤的生长抑制作用裸鼠体内抗移植性人类肿瘤试验方法：采用细胞培养技术制备人体肿瘤细胞样品，收集细胞，以无菌pbs洗两次，用无菌、无fbs的dmem/f12培养液调整细胞浓度为1×108cells/ml。对经适应性饲养1周的balb/c裸鼠(体重18-20g)，每只在右侧背部皮下无菌操作接种细胞悬液0.1ml。裸鼠饲养在spf实验室。接种细胞后的第12天，大部分小鼠皮下出现肉眼可见肿瘤、肿瘤体积达100-300mm3左右，用自动读数的游标卡尺测量每只荷瘤小鼠肿瘤的长径(a)和横径(b)，采用公式：v＝a×b2/2计算每只小鼠的肿瘤体积。将荷瘤小鼠按照肿瘤体积分层后随机分为溶剂对照组、抗癌药物顺铂阳性对照组和红雪茶活性部位给药组，每组5-8只荷瘤小鼠。红雪茶活性部位以分析纯dmso为溶剂配制，采用腹腔注射给药，对照组小鼠给予同等体积的溶剂。小鼠从分组当天开始给药，隔天给药1次，每4天测定1次肿瘤体积和体重，观察记录动物的一般状况。试验结束时，测小鼠体重，将小鼠取血后脱臼处死，测量肿瘤体积，完整剥离肿瘤、肝、脾、肾、心和睾丸，以精密电子秤测定肿瘤和各脏器重量。按照下式计算各时间点的肿瘤相对增值率rpr(％)：相对增值率(％)＝trtv/crtv×100，trtv为给药组肿瘤相对体积，crtv为溶剂对照组肿瘤相对体积，rtv＝vt/v0，v0为分组给药时的肿瘤体积，vt为每一次测量时肿瘤体积。按照下式计算肿瘤重量抑制率：抑制率(％)＝(溶剂对照组平均肿瘤重量-给药组平均肿瘤重量)/溶剂对照组平均肿瘤重量×100按照下式计算各脏器系数：脏器系数＝脏器重量/体重×1006.1活性部位l对裸鼠移植人肺癌nci-h460的体内生长抑制作用活性部位l以dmso溶解，腹腔注射给药，剂量为150mg/kg，隔天给药一次，共给药10次。结果表明，给药2、4、6、8、10次时，nci-h460的相对增值率分别为72.12％、51.21％、49.40％和50.36％；各时间点的肿瘤相对体积(rtv)见图14。实验结束时，dmso对照组的平均肿瘤重量为2.67g，活性部位l组的平均肿瘤重量为1.35g，肿瘤重量抑制率为49.44％。6.2活性部位t对裸鼠移植人宫颈癌hela的体内生长抑制作用分组和给药：在肿瘤体积大约为100mm3时，将10只符合实验条件的荷瘤小鼠按照肿瘤体积大小分成dmso对照组和活性部位t组，每组5只荷瘤小鼠。分组当天开始腹腔注射给药，隔天给药一次，每次每只给药0.05ml，共给药12次，活性部位t的给药剂量为50mg/kg，dmso对照组给予等量溶剂。每四天测量一次肿瘤体积和裸鼠体重。各时间点的肝癌hela肿瘤相对体积(rtv)见图15各时间点的肝癌hela肿瘤相对增殖率(rpr)见图16实验结束时，dmso对照组的平均瘤重为0.6148g，活性部位t组的平均瘤重为0.2816g，活性部位t对hela移植瘤的肿瘤重量抑瘤率为54.20％。7.红雪茶抗肿瘤活性部位与临床抗癌药物体内联合抗癌作用7.1活性部位d与环磷酰胺(cp)联合应用对小鼠移植动物肿瘤s-180的体内生长抑制作用实验方法：按照前述的动物肿瘤移植试验方法，接种后将小鼠称重并随机分成8组，分别为dmso溶剂对照组、cp阳性对照组、三个剂量活性部位d组和三个剂量活性部位d与cp联合用药组。活性部位d组剂量分别为25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。溶剂对照组给予dmso，环磷酰胺统一剂量为20mg/kg。于接种后的第二天开始每隔一天腹腔注射给药，每只小鼠每次给药0.05ml，一共给药5次。实验结束时，处死小鼠，完整剥取实体瘤并称重。按以下公式计算抑瘤率和q值并判断两药的联合效应,进行统计分析。抑瘤率(％)＝(溶剂对照组瘤重均数-给药组瘤重均数)×100/溶剂对照组瘤重均数。金氏公式：q＝e(a+b)/[ea+(1-ea)×eb]其中e(a+b)为两药合用的抑制率，ea和eb分别为两药单用的抑制率。q为0.85-1.15表示两药作用相加，q＞1.15表示两药作用协同，q≥1.50表示两药具有显著性协同作用，q＜0.85表示两药作用拮抗。活性部位d与环磷酰胺(cp)的体内联合作用结果见表12。表12.活性部位d与cp的体内联合抑制s-180细胞移植瘤作用(n＝12)与dmso对照组比较,*p＜0.05，**p＜0.01；与cp组比较，△p＜0.05。联合作用结果表明，活性部位d与cp联合用药对小鼠肉瘤s-180细胞移植瘤的生长有抑制作用；活性部位d在剂量为25、50、100mg/kg时，与环磷酰胺(20mg/kg)联合用药的q值分别为1.25、1.12和1.10，表明活性部位d与cp联合应用有协同或相加体内抗肿瘤作用。7.2活性部位t与顺铂(ddp)联合应用对小鼠移植人体肿瘤宣威肺癌(xwlc-05)的体内生长抑制作用试验方法：裸鼠体内移植瘤试验方法同前。在进行体内抗癌试验时，增加一个联合作用组，即活性部位t加顺铂ddp组。活性部位t的使用剂量为50mg/kg，ddp使用剂量为2.5mg/kg。各时间点的肿瘤相对增殖率(rpr)见图17。结果显示活性部位t与顺铂联合应用对人宣威肺癌xwlc-05具有显著性体内协同抗癌作用，给药4、8、12、16、20、24、28各时间点的q值分别为5.54、9.44、7.05、6.08、3.10、2.69和3.14，呈现显著性的体内协同抗宣威肺癌作用。随着给药次数的增加，肿瘤相对增殖率rpr下降，联合作用增强。不同时间点xwlc-05的肿瘤相对体积(rtv)见图18。活性部位t与顺铂联合组在各时间点的肿瘤相对体积明显低于单独用药组，联合组的肿瘤几乎无生长。实施例5：红雪茶抗肿瘤活性部位的抗肿瘤作用机制1.对癌细胞生长周期的影响肺癌a-549细胞、结肠癌hct-116细胞经红雪茶抗肿瘤活性部位k或活性部位l处理后，采用流式细胞仪(facs)检测细胞分布情况。结果显示，活性部位k和l能显著性导致癌细胞凋亡，将癌细胞阻滞于g2/m期，减少s期细胞。表13.药物处理a-549细胞24h后的流式细胞仪结果表14.药物处理hct-116细胞24h后的流式细胞仪结果2.对基因parp表达的影响采用westernblot技术检测发现，活性部位l能显著性增加肝癌细胞qgy-7703和结肠癌细胞hct-116中凋亡标志物cleavedparp的含量，从而促进癌细胞的凋亡。结果见图19、图20。实施例6：红雪茶抗肿瘤活性部位，按制剂需要的比例加入赋形剂，制粒压片制成片剂。实施例7：红雪茶抗肿瘤活性部位，按照给药剂量要求及制剂需要的比例加入赋形剂，可直接包装成各种规格的胶囊。实施例8：红雪茶抗肿瘤活性部位，可以采用食用植物油脂溶解成液体后制成软胶囊。实施例9：红雪茶抗肿瘤活性部位为浸膏状，可以按中药浸膏常规使用方式使用。实施例10：红雪茶抗肿瘤活性部位，按常规口服液制法制成口服液。实施例11：红雪茶抗肿瘤活性部位，按制剂需要的比例加入赋形剂，制成颗粒剂或冲剂。实施例12：红雪茶抗肿瘤活性部位，按产品需要的比例加入食品或其它载体，制成保健品或其它功能性用品。实施例13:红雪茶抗肿瘤活性部位，按治疗需要，与其它抗肿瘤药物按比例混合制成各种制剂，或在临床使用时联合应用，形成联合抗肿瘤药物组合物。以上所述实施例仅部分表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12