本发明属于肾纤维化的防治
技术领域：
，涉及一种葫芦烷型四环三萜类化合物在制备预防和/或治疗肾纤维化疾病的药物和/或保健品中的应用。
背景技术：
：肾纤维化(包括肾小球纤维化、肾间质纤维化、肾血管纤维化)是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同通路，是各种慢性肾脏疾病主要的病理学表现之一，是各种肾小球、血管和小管间质本身疾病的最后结局。有研究表明无论何种病因的肾脏病，肾纤维化的发展均是进行性的，其中肾小球纤维化和肾间质纤维化在肾纤维化中起重要作用。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍，以及免疫反应等多种致病因素刺激，其固有细胞受损，发展到后期出现大量胶原沉积和积聚，造成肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失脏器功能。肾脏内固有细胞纤维化、硬化的过程也就是肾脏纤维化的过程。肾脏纤维化是以细胞外基质（ecm）的异常沉积为特征的。肾纤化的基本病理学原因是成纤维细胞的过度活化，抑制成纤维细胞的过度活化，可以有效抑制肾纤维化的发展。目前大多数肾纤维化治疗药物存在毒性大、安全性低、药理作用单一等问题，从天然植物中获取具有药理活性的提取物或者单体化合物，从而得到高效低毒的潜在药物有重要价值。葫芦烷型三萜苷类化合物是罗汉果中的主要药理成分，包括罗汉果苷v(mogrosidev);罗汉果苷ive(mogrosideive);罗汉果苷iiie(mogrosideiiie);罗汉果苷iia2(mogrosideiia2);罗汉果苷iiia1(mogrosideiiia1);罗汉果苷iva(mogrosideiva);罗汉果苷vi(mogrosidevi);赛门苷i(siamenosidei);11-o-罗汉果苷v(11-oxomogrosidev)等。罗汉果醇是罗汉果苷类化合物的苷元，可以通过酸水解得到。迄今为止，尚无葫芦烷型四环三萜类化合物在抗肾纤维化中的应用报道。技术实现要素：本发明公开了葫芦烷型四环三萜类化合物的医药新用途，即其可用于制备预防和/或治疗肾纤维化疾病的药物和/或保健品的用途。本发明的技术方案：葫芦烷型四环三萜类化合物在制备预防和/或治疗肾纤维化疾病的药物和/或保健品中的应用。所述葫芦烷型四环三萜类化合物的结构式如式i所示，其中r1为羟基或羰基，r2、r3、r4为氢或糖基；糖基为六碳吡喃糖、五碳吡喃糖、六碳呋喃糖、五碳呋喃糖或它们组成的二糖基，三糖基，四糖基。式i优选的，式i中r1为羟基。优选的，式i中r4为氢。优选的，式i中r2为氢，r3为氢或糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖或其组成的二糖基、三糖基、四糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。优选的，式i中r2为糖基，r3为氢或糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖或其组成的二糖基、三糖基、四糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。进一步，所述葫芦烷型四环三萜类化合物的结构式如下，分别为罗汉果苷iiie（式ii）、罗汉果苷iiia1（式iii）、罗汉果苷ive（式iv）、罗汉果苷v（式v）、罗汉果苷iia2（式vi）、mogrosideie1（式vii）、11-氧化-罗汉果苷v（式viii）或罗汉果醇(式ix)：式ii、式iii、式iv、式v、式vi、式vii或式viii式ix。更优选的，所述葫芦烷型四环三萜类化合物的结构式为式ii、式iv或式ix。上述葫芦烷型四环三萜类化合物在制备预防和/或治疗肾纤维化疾病的药物和/或保健品中的应用，其是将式i所示的化合物及其组合物与其他人体可接受的药用辅料制成片剂、颗粒剂、汤剂或胶囊。所述葫芦烷型四环三萜类化合物为降低肾间质中胶原堆积量的药物和/或保健品。所述葫芦烷型四环三萜类化合物为能减轻炎症程度，抑制胶原形成、抑制肾组织细胞成纤维化的抗肾纤维化的药物和/或保健品。附图说明图1罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive和罗汉果醇高剂量组与假手术组、模型组、阳性对照组实验大鼠肾脏病理显微观察结果。具体实施方式式i所示的葫芦烷型四环三萜类化合物在制备预防和/或治疗肾纤维化疾病的药物和/或保健品中的应用；其中r1为羟基或羰基；r2、r3、r4为氢或糖基；糖基为六碳吡喃糖、五碳吡喃糖、六碳呋喃糖、五碳呋喃糖及其组成的二糖基，三糖基，四糖基。式i优选的，式i中r1为羟基。优选的，式i中r4为氢。优选的，式i中r2为氢，r3为氢或糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖或其组成的二糖基、三糖基、四糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。优选的，式i中r2为糖基，r3为氢或糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖或其组成的二糖基、三糖基、四糖基；更优选的，所述糖基为六碳吡喃糖的二糖基或三糖基。进一步，所述罗汉果苷类化合物选自以下化合物中的一种：罗汉果苷iiie（式ii）、罗汉果苷iiia1（式iii）、罗汉果苷ive（式iv）、罗汉果苷v（式v）、罗汉果苷iia2（式vi）、mogrosideie1（式vii）、11-氧化-罗汉果苷v（式viii）或罗汉果醇(式ix)：、式ii、式iii、式iv、式v、式vi、式vii式viii或式ix。更优选的，所述葫芦烷型四环三萜类化合物为罗汉果苷iiie（式ii）、罗汉果苷ive（式iv）或罗汉果醇（式ix）。葫芦烷型四环三萜类化合物在制备预防和/或治疗肾纤维化疾病的药物和/或保健品中的应用，其是将式i所示的化合物及其组合物与其他人体可接受的药用辅料制成片剂、颗粒剂、汤剂或胶囊。所述药物和/或保健品为降低肾间质中胶原堆积量的药物和/或保健品。所述药物和/或保健品为能减轻炎症程度，抑制胶原形成、抑制肾组织细胞成纤维化的抗肾纤维化的药物和/或保健品。下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本发明以罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive和罗汉果醇为例来验证罗汉果苷类化合物抗肾纤维化疾病的部分药效学试验及结果。本发明罗汉果苷iiie，罗汉果苷ive和罗汉果醇的制备：天然罗汉果提取的罗汉果总苷里面罗汉果苷v的含量最高，罗汉果总苷采用β-葡萄糖苷酶水解之后，根据酶解时间长短可以得到含有不同罗汉果苷成分比例的提取物。罗汉果醇是罗汉果苷类化合物的苷元，可以通过酸水解得到。罗汉果苷iiie采用市售罗汉果提取物，经大孔树脂分离，高压反相制备色谱分离得到。纯度95%以上。或参考中国专利2010105610299制备罗汉果苷ⅳ的方法，将市售罗汉果提取物用β-葡萄糖苷酶水解后，经大孔树脂分离，高压反相制备色谱分离得到。纯度95%以上。罗汉果苷ive采用市售罗汉果提取物，经大孔树脂分离，高压反相制备色谱分离得到。纯度95%以上。或参考中国专利2010105610299制备罗汉果苷ⅳ的方法，将市售罗汉果提取物用β-葡萄糖苷酶水解后，经大孔树脂分离，高压反相制备色谱分离得到。纯度95%以上。罗汉果醇采用市售罗汉果提取物，用5%的硫酸水解，经硅胶纯化得到。纯度95%以上。实施例1葫芦烷型四环三萜类化合物对肾纤维化模型大鼠的作用慢性输尿管梗阻可引起梗阻侧肾小管间质增生，肾纤维化，从而导致肾功能衰竭。大鼠肾间质tgf-β1、sgk1和ctgf是肾纤维化的表达因子，它们表达水平升高，即意味着肾纤维化的发展。细胞凋亡是由生理或病理信号引发的自主性的细胞清楚过程，其与肾脏纤维化有着密切的关系。bcl-2是一种原癌基因，可抑制细胞凋亡，而bax具有促进细胞凋亡作用，bcl-2水平上调，bax水平下调，即表明肾脏细胞凋亡过程得到改善。此外细胞间质胶原的大量堆积也是造成肾纤维化的重要因素。本发明选用单侧输尿管结扎复制的大鼠肾间质纤维化动物模型进行活性评价，此模型目前是评价肾纤维化治疗方法的理想模型。1试验方法1.1材料及试剂罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇（按本发明提供方法自制）；贝那普利（北京诺华制药有限公司）；兔抗大鼠tgf-β1、ctgf多克隆抗体和sabc试剂盒；兔抗大鼠sgk1多克隆抗体（upstate公司，美国）；大鼠bcl-2蛋白多克隆抗体、大鼠bax多克隆抗体、大鼠细胞凋亡原位检测试剂盒、免疫组化sp试剂盒及dab试剂盒（博士德生物工程公司）；其余试剂均为分析纯或者分子生物级别；贝那普利，北京诺华制药有限公司生产；羟脯氨酸(hyp)试剂盒（南京建成生物公司）；纤维连结蛋白(fn)试剂盒（上海生物制品所）；ml11生物显微镜（olympus公司）；全自动定量绘图酶标仪（modelelx808,bio-tekintruments1.2试验方法清洁级成年雄性大鼠90只，体质量200±20g，随机分为9组：假手术组、模型组、对照组（30mg/kg，贝那普利）、罗汉果苷iiie高剂量组（50mg/kg，罗汉果苷iiie-h）、罗汉果苷iiie低剂量组（10mg/kg，罗汉果苷iiie-l）、罗汉果苷ive高剂量组（50mg/kg，罗汉果苷ive-h）、罗汉果苷ive低剂量组（10mg/kg，罗汉果苷ive-l）、罗汉果醇高剂量组（50mg/kg,罗汉果醇-h）、罗汉果醇底剂量组（10mg/kg,罗汉果醇-l），每组10只大鼠，模型组大鼠用4%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉后，取右侧卧位，局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择左侧背部肋下约0.5cm为切口，一次切开皮肤至腹膜后，游离肾及输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起取中段部位，用止血钳夹住，在管两段各用丝线结扎后剪断输尿管，然后连续缝合皮肤，动物给予正常饮食、饮水。假手术组仅开腹，游离左侧输尿管，但不进行结扎、剪断。所有大鼠术后肌注青霉素（10u/d，连续5d）。假手术组及模型组每天灌胃给予生理盐水1ml，对照组及试验药物组按上述给药剂量于术前2天开始灌胃给药，连续给药2周。给药结束后分别随机处死各组中5只大鼠，取血，按纤维连结蛋白测定说明测定说明纤维联接蛋白(fn)。取左侧肾脏，一半浸泡于4%甲醛溶液中，进行病理学及免疫组织化学检查，另一半速冻-75℃冰箱，以备用。各组另5只大鼠，处死取左侧肾脏，进行肾脏bcl-2、bax的检查及羟脯氨酸的测定。2指标观察及检测2.1肾脏病理学检查肉眼观察肾脏病理变化，左侧肾组织经4%甲醛溶液固定，常规he染色，于光镜下观察大鼠肾组织病理情况。2.2肾脏tgf-β1、sgk1、ctgf的检测按sabc试剂盒说明书，检测肾间质中tgf-β1、sgk1、ctgf的表达。选取不含肾小球的肾小管间质区的高倍镜视野（×500），采用免疫组化分析软件系统分析视野内的棕色信号，计算各组大鼠肾组织tgf-β1、sgk1、ctgf的平均阳性表达率。2.3肾脏bcl-2、bax的检测按大鼠bcl-2、bax试剂盒说明，于光镜视野（50×10）下，分别观察切片中bcl-2、bax染色细胞，有棕色颗粒者即为阳性细胞。比较各组大鼠肾脏bcl-2、bax的平均灰度。2.4肾脏羟脯氨酸及纤维连接蛋白检测实验结束后处死大鼠取血，按纤维连结蛋白测定说明测定说明纤维联接蛋白(fn)。生理盐水反复灌洗后留取左侧肾脏，肾组织经4％的多聚甲醛缓冲液固定。切取适量肾组织，按羟脯氨酸试剂盒测定说明测定羟脯氨酸含量。本实验所有数据均采用spss14.0统计软件处理。计量资料均以均数±标准差表示，组间差异比较采用t检验，以p<0.05为差异具有统计学意义。3实验结果3.1肾脏病理观察假手术组大鼠肾脏大小、形态正常，呈红褐色，表面光滑、包膜光泽不紧张，无粘连，肾单位清晰，肾小球囊无扩张或炎性细胞浸润。模型组大鼠肾脏体积增大，颜色苍白，有囊性感，包膜紧张，少数区域包膜粘连，肾小管扩张明显，间质有大量炎症细胞浸润，呈明显纤维化状态。阳性药物对照组以及罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇的高剂量组实验大鼠肾脏略有肿大，颜色基本正常，但较假手术组浅，肾小管略微扩张，炎性细胞少量浸润，唯有明显的纤维化病变，相对于模型组都有较为明显的形态学改善，与模型组比较差异明显。罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇低剂量组效果稍微差，肾脏有肿大，颜色浅，与模型组比较差异不是特别明显（图1）。3.2肾脏中tgf-β1、sgk1、ctgf的表达实验结果发现，假手术组大鼠肾间质中基本无tgf-β1、sgk1、ctgf这些纤维化表达因子的表达。模型组中，纤维化程度明显，tgf-β1、sgk1、ctgf大量表达。低剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组的大鼠肾脏中，tgf-β1、sgk1、ctgf表达水平较模型组有降低，但无统计学差异（p>0.05）。阳性药物对照组和高剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组大鼠肾脏中tgf-β1、sgk1、ctgf表达水平显著降低，与模型组比较，统计学差异显著（p<0.01）。上述统计学结果表明，罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇均能抑制纤维化表达因子的分泌，具有抗肾纤维化作用，且具有一定剂量依耐性（表1）。表1不同葫芦烷型四环三萜类化合物对tgf-β1、sgk1、ctgf表达的影响（面积百分比，n=10，x±s）组别tgf-β1sgk1ctgf假手术组2.15±0.585.08±1.694.25±1.03模型组13.55±1.87##16.72±2.83##11.38±1.29##贝那普利组6.98±0.87**8.91±1.74**6.28±1.16**罗汉果苷iiie-h6.81±1.12**8.74±1.65**6.39±1.02**罗汉果苷iiie-l11.87±0.9714.55±2.189.64±1.27罗汉果苷ive-h7.12±0.86**9.15±1.27**6.13±1.08**罗汉果苷ive-l10.76±1.1813.58±1.929.22±1.14罗汉果醇-h6.59±0.89**8.73±1.28**6.44±1.16**罗汉果醇-l11.35±1.2113.76±1.889.48±1.22与假手术组比较##p＜0.01，与模型组比较**p＜0.01。3.3肾脏中bcl-2、bax的表达量比较模型组和低剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组的大鼠肾脏中bcl-2、bax平均灰度值均显著升高，与假手术组相比，具有显著的统计学差异（p<0.01）。低剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组与模型组相比bcl-2表达水平有所升高，bax表达水平有所降低，但是无显著的统计学差异。阳性药物及高剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组的大鼠肾脏中bcl-2平均灰度值较模型组显著升高，bax平均灰度值较模型组有显著降低，两者均具有统计学差异（p<0.05）。上述统计学数据表明，罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇可以一定程度上上调bcl-2水平，下调bax水平，对细胞凋亡起到改善作用，能缓解肾纤维化程度，且具有一定剂量依耐性（表2）。表2不同葫芦烷型四环三萜类化合物对bcl-2、bax表达的影响（灰度值）组别bcl-2bax假手术组75.16±3.12135.74±5.21模型组158.66±5.37#201.38±6.15#贝那普利组215.73±6.55*156.71±6.49*罗汉果苷iiie-h221.87±6.89*152.33±8.12*罗汉果苷iiie-l168.75±4.83186.35±7.26罗汉果苷ive-h218.61±7.23*149.82±6.87*罗汉果苷ive-l165.37±5.28180.29±7.15罗汉果醇-h225.69±7.06*145.78±6.88*罗汉果醇-l166.32±6.37182.18±6.55与假手术组比较#p＜0.05，与模型组比较*p＜0.05。3.4肾脏中羟脯氨酸、体内纤维连接蛋白含量测定模型组中大鼠肾脏羟脯氨酸（hyp）含量及纤维连接蛋白（fn）含量具有显著提升，提示造模是成功的。低剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组大鼠肾脏中羟脯氨酸及纤维连接蛋白均有一定程度下降，但是与模型组相比并无显著统计学差异。阳性药物对照组与高剂量罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇实验组中大鼠肾脏中羟脯氨酸及纤维连接蛋白含量均有显著下降，与模型组比较具有显著性差异。上诉结果表明罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇能够下调体内羟脯氨酸及纤维连接蛋白含量，减少胶原累积，缓解肾纤维化症状，具有一定抗肾纤维化作用，且具有一定剂量依耐性。表3不同葫芦烷型四环三萜类化合物对hyp、fn含量的影响组别hyp(μg/g)fn(mg/l)假手术组3286.7模型组744#28.5##贝那普利组536*17.8*罗汉果苷iiie-h517*17.3*罗汉果苷iiie-l68925.7罗汉果苷ive-h489*16.5*罗汉果苷ive-l71223.9罗汉果醇-h506*18.2*罗汉果醇-l69324.9与假手术组比较#p＜0.05，与模型组比较*p＜0.05。通过以上实验表明，罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇能够有效抑制纤维化因子tgf-β1、sgk1、ctgf的表达；减少羟脯氨酸以及纤维连接蛋白的表达；同时还能够调节bcl-2、bax表达水平抑制肾脏细胞凋亡，进而从多角度控制缓解肾脏纤维化病变。实验结果表明罗汉果苷iiie、罗汉果苷ive、罗汉果醇具有一定抗肾纤维化活性，且有一定剂量依耐性，可以用来制备抗肾纤维化药物。当前第1页12