穿心莲内酯在制备治疗抑郁症的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是穿心莲内酯在制备治疗抑郁症的药物中的应用。

背景技术：

抑郁症是常见的情感障碍型精神疾病，其发病率一直高居不下；该精神疾病不仅影响个人的工作学习和生活质量，还因其较高的自杀倾向，严重影响着家庭和社会的稳定；主要表现为情绪低落，兴趣减低，悲观，记忆力下降，缺乏主动性等(参考文献：[1].bowden,c.l.,2005.treatmentoptionsforbipolardepression.j.clin.psychiatry66,3-6.[2].krishnan,v.,nestler,e.j.,2008.themolecularneurobiologyofdepression.nature455,894-902.[3].shelton,r.c.,2007.themolecularneurobiologyofdepression.psychiatr.clin.northam.30,1-11.)。目前的临床抗抑郁药多为化学合成药，主要包括三环类抗抑郁药、四环类抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取阻滞剂以及单胺氧化酶抑制剂；虽然种类不少，但有效率往往不足70％，且副作用不少，并存在复发的可能[4,5]。因此，从天然药物和中药方剂中寻找和研制理想的抗抑郁剂，愈来愈引起研究者的关注。

对于抑郁症的发病机理，上世纪曾认为是中枢单胺能递质(如5-羟色胺)系统的功能缺损介导抑郁症的发生，然而临床上针对此系统开发的一系列抗抑郁药物皆存在有药效周期长、治愈率不高、反复发作等缺点(参考文献：[4].berton,o.,nestler,e.j.,2006.newapproachestoantidepressantdrugdiscovery:beyondmonoamines.nat.rev.neurosci.7,137-151.[5].hirschfeld,r.m.,2012.theepidemiologyofdepressionandtheevolutionoftreatment.j.clin.psychiatry73,5-9.)。学术界在21世纪提出了新观点，即神经营养假说：认为抑郁症与中枢脑源性神经营养因子(bdnf)密切相关。bdnf在脑内有广泛分布，调控神经生长发育、突触可塑性等体内重要生理过程。已知bdnf可与其受体酪氨酸激酶b(trkb)结合，通过下游丝裂原活化蛋白激酶(mapk)/细胞外调节激酶(erk)、磷脂酰肌醇-3-激酶(pi-3k)/蛋白激酶b(akt)以及ca2+/钙调蛋白激酶(cam)几条信号通路来激活核内环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(creb)(参考文献：[6].qix,linw,wangd,etal.arolefortheextracellularsignal-regulatedkinasesignalpathwayindepressive-likebehavior.behavbrainres.2009,199:203-209.)。多篇研究报道证实，抑郁患者与抑郁症动物模型的血清中及海马神经元内bdnf蛋白表达量均明显低于正常个体；临床抗抑郁药物长期服用及电休克治疗(ect)等手段均能够逆转这些变化(参考文献：[7].dumanrs,monteggialm.aneurotrophicmodelforstress-relatedmooddisorders.biolpsychiatry.2006,59,1116-1127.[8].moltenir,calabresef,bedognif,etal.chronictreatmentwithfluoxetineup-regulatescellularbdnfmrnaexpressioninratdopaminergicregions.intjneuropsychopharmacol.2006,9,307-317.)。

穿心莲内酯(分子式c20h30o5，andrographolide)是天然植物穿心莲的主要有效成份，在国内中医药市场上有广泛应用，如穿心莲内酯片、穿心莲内酯滴丸、穿心莲内酯胶囊等。该药具有清热解毒、凉血消肿、解热抗炎、抗菌等功效，可用于胃肠炎，感冒，气管炎，肺炎，百日咳，肺结核，肺脓疡，胆囊炎，高血压，口咽肿痛，毒蛇咬伤等。最近有研究报道称穿心莲内酯能够促进细胞内bdnf的表达合成，提示其可能具备抗抑郁的疗效(参考文献：[9].xuf,wuh,zhangk,etal.pro-neurogeniceffectsofandrographolideonrsc96schwancellsinvitro.molmedrepl.2016,14,3573-3580.)。

但是关于穿心莲内酯在制备治疗抑郁症的药物中的应用目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供穿心莲内酯的新的医药用途。

本发明的第一方面，提供穿心莲内酯在制备治疗抑郁症的药物中的应用。

优选的，所述的治疗抑郁症的药物是以穿心莲内酯作为唯一活性成份或者是包含穿心莲内酯的药物组合物。

优选的，所述的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型。

本发明的第二方面，提供一种治疗抑郁症的药物，由穿心莲内酯以及药学上可接受的辅料组成。

本发明的有益效果在于：

本发明使用多种抑郁症动物模型与测试方法进行研究，证实穿心莲内酯的腹腔注射给予(30,60mg/kg)能够明显逆转抑郁症模型引起的诸多抑郁样行为，且药效强度不弱于经典临床抗抑郁药物氟西汀；本发明发现穿心莲内酯的一种全新药理功效：有效缓解治疗抑郁症。

附图说明

图1.社会接触测试箱的结构示意图。

图2.穿心莲内酯在强迫游泳测试(fst)与悬尾测试(tst)中均显示显著抗抑郁效应。对正常c57bl/6j小鼠先分别腹腔注射给予溶剂(生理盐水)、氟西汀(阳性对照，20mg/kg)或穿心莲内酯(30，60mg/kg)，30分钟后进行fst/tst/自主活动性测试。(a)穿心莲内酯的注射给予显著降低正常c57bl/6j小鼠在fst测试中的不动时间，且效应不弱于氟西汀。(b)穿心莲内酯也明显降低正常c57bl/6j小鼠在tst测试中的不动时间，且效应不弱于氟西汀。(c)穿心莲内酯不影响小鼠的自主活动性。实验数据均以平均值±标准误表示(每组10只)；**p<0.01vs.溶剂对照组。

图3.穿心莲内酯在慢性不可预测应激(cums)抑郁模型中显示强效抗抑郁作用。使用c57bl/6j小鼠制造cums模型，为期8周，并于最后2周进行每日给予腹腔注射溶剂(生理盐水)、氟西汀(阳性对照，20mg/kg)或穿心莲内酯(30，60mg/kg)，之后进行行为学测试。(a)穿心莲内酯的注射给予显著降低cums抑郁模型鼠在fst测试中的不动时间，且效应不弱于氟西汀。(b)穿心莲内酯显著减少cums抑郁模型鼠在tst测试中的不动时间，且效应不弱于氟西汀。(c)穿心莲内酯同时明显升高cums抑郁模型鼠的糖水偏好率，逆转其快感缺失行为表现。实验数据均以平均值±标准误表示(每组10只)；*p<0.05，**p<0.01vs.溶剂对照组；^#p<0.05，^##p<0.01vs.cums模型+溶剂组。

图4.穿心莲内酯在慢性社会挫败应激(csds)抑郁模型中显示强效抗抑郁作用。使用c57bl/6j小鼠制造csds模型，为期10天，然后每日给予腹腔注射溶剂(生理盐水)、氟西汀(阳性对照，20mg/kg)或穿心莲内酯(30，60mg/kg)，持续14日，结束后进行行为学测试。(a)穿心莲内酯的注射给予显著降低csds抑郁模型鼠在fst测试中的不动时间，且效应不弱于氟西汀。(b)穿心莲内酯显著减少csds抑郁模型鼠在tst测试中的不动时间，且效应不弱于氟西汀。(c)穿心莲内酯明显升高csds抑郁模型鼠的社会接触时间，逆转其社交恐惧行为表现。(d)穿心莲内酯同时明显升高csds抑郁模型鼠的糖水偏好率，逆转其快感缺失行为表现。实验数据均以平均值±标准误表示(每组10只)；*p<0.05，**p<0.01vs.溶剂对照组；^#p<0.05，^##p<0.01vs.csds模型+溶剂组。

图5.穿心莲内酯的持续注射给予显著逆转cums抑郁模型引起的海马神经元内bdnf信号通路水平(bdnf，ptrkb，pcreb)降低。实验数据均以平均值±标准误表示(每组5只)；**p<0.01vs.溶剂对照组；^##p<0.01vs.cums模型+溶剂组。

图6.穿心莲内酯的持续注射给予显著逆转csds抑郁模型引起的海马神经元内bdnf信号通路水平(bdnf，ptrkb，pcreb)降低。实验数据均以平均值±标准误表示(每组5只)；**p<0.01vs.溶剂对照组；^##p<0.01vs.csds模型+溶剂组。

图7.穿心莲内酯在fst(a)与tst(b)测试中所展现的抗抑郁效应被bdnf通路阻断剂k252a明显阻断。实验数据均以平均值±标准误表示(每组10只)；**p<0.01vs.溶剂对照组。

图8.穿心莲内酯在cums抑郁模型中所展现的抗抑郁效应被bdnf通路阻断剂k252a明显阻断。(a)强迫游泳测试行为学数据结果。(b)悬尾测试行为学数据结果。(c)糖水消耗测试行为学数据结果。实验数据均以平均值±标准误表示(每组10只)；**p<0.01vs.溶剂对照组；^##p<0.01vs.cums模型+溶剂组。

图9.穿心莲内酯在csds抑郁模型中所展现的抗抑郁效应被bdnf通路阻断剂k252a明显阻断。(a)强迫游泳测试行为学数据结果。(b)悬尾测试行为学数据结果。(c)社会接触测试行为学数据结果。(d)糖水消耗测试行为学数据结果。实验数据均以平均值±标准误表示(每组10只)；**p<0.01vs.溶剂对照组；^##p<0.01vs.csds模型+溶剂组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、实验方法：

1.慢性不可预测应激模型(cums)

以雄性c57bl6小鼠(8周龄)为实验对象，随机分组，每组10只，除正常组每笼5只外，其余组别均单笼饲养。模型过程持续8周，每天给予小鼠一种刺激，包括禁食24h、禁水24h、夹尾1分钟、潮湿环境、昼夜颠倒、悬尾5分钟、冰水游泳(4℃，4分钟)。平均每种刺激每周各有一次，各周的刺激排序不同，使小鼠不能预测何种刺激。最后两周在给刺激的同时开始每天按组别和体重给药，以腹腔注射方式，按10ml/kg剂量，给药过程持续14天。结束后进行强迫游泳测试、悬尾测试以及糖水消耗测试。

2.慢性社会挫败性应激模型(csds)

首选挑选合适的icr/cd1小鼠作为攻击性工具鼠，于实验前开始。一个鼠笼内饲养一只cd1雄性鼠(50周龄)与一只cd1雌性鼠，让其配对共居，以便雄性cd1小鼠产生领地意识。一周后，对雄性cd1小鼠测试其攻击性：将鼠笼中的配对cd1雌性鼠取出，随后放入一只陌生的c57雄性鼠作为领地入侵者；若cd1鼠在1min之内就开始对后者发动攻击，则被视为攻击性cd1鼠。

随后开始正式实验，以雄性c57bl6小鼠(8周龄)为实验对象，随机分组。除对照组每笼2只小鼠外，其余均单笼饲养，先正常饮食饮水一周以适应环境。

应激过程如下：首先取一只模型组c57小鼠，将其放入一陌生雄性cd1小鼠的鼠笼中，并同时移走与该雄性cd1小鼠配对的cd1雌性鼠，使c57小鼠遭受雄性cd1小鼠的持续性攻击并持续约10min；然后将二者用铁丝网隔开，使两只小鼠虽无法直接接触但彼此仍可相互视见闻嗅，该状态持续2h；然后将此c57小鼠放回原笼，并放回cd1雌性鼠，此为第一天应激。第二天再将该c57鼠放入另一陌生cd1雄性鼠的笼中，按相同方式给予应激；第三天再放入第三只陌生cd1雄性鼠的笼中，按相同方式再次予以应激。按如此应激方式连续应激10d，并保证c57小鼠每天经受不同cd1雄性鼠的攻击。正常组c57小鼠则维持正常饮食饮水，保持2只一笼，每天相互更换同居对象。

连续10d应激刺激结束后，开始每天按组别和体重给药，以腹腔注射方式，按10ml/kg剂量，给药过程持续14天，然后进行强迫游泳测试、悬尾测试、糖水消耗测试以及社会接触测试。

3.强迫游泳测试(fst)

将测试小鼠放入高20cm，直径15cm，水深10cm，水温为25±1℃的水筒中使其被迫游泳6分钟，用秒表累计记录后4分钟内小鼠的不动时间，标准：小鼠全身只有头部露出水面，四肢不动处于漂浮或为使自己不溺亡所做的轻微动作均为不动状态。每只小鼠测定完后擦干，放回笼中。实验时房间内保持安静，光线柔和。实验采用盲法进行测定，以保证实验数据的客观性。

4.悬尾测试(tst)

将测试小鼠尾端末梢1cm处用胶布固定于铁杆上，身体处于倒挂状态，头部距离地面约50cm，周围用塑料板隔离，以排除周边环境对其干扰。观察时间持续6分钟，用秒表累计记录后4分钟内小鼠的不动时间，标准：小鼠四肢躯干完全不动。实验时房间内保持安静，光线柔和。实验采用盲法进行测定，以保证实验数据的客观性。

5.糖水消耗测试

测试之前首先使要接受测试的c57小鼠每只都处于单笼居住状态，每笼配一瓶1％蔗糖水和一瓶纯水并保持自由饮食饮水两天，期间每隔12h将糖水瓶和纯水瓶的位置对调,防止c57小鼠有位置偏爱，此为糖水偏爱训练。从第三天开始将两瓶水和饲料全部撤离，让c57小鼠接受禁食禁水24h。第四天正式测试，先将每笼的两瓶水都放回(糖水瓶与纯水瓶内溶液体积等量，并事先量好)，让c57小鼠自由饮用1h后再取下两瓶水；分别测量其剩余的溶液体积，计算糖水消耗体积a和纯水消耗体积b，以此得出a/(a+b)就是每只c57小鼠的糖水嗜好度。该数值与动物快感成正比：越大就表明动物越正常；反之则表示快感缺失越明显，动物越抑郁。

6.社会接触行为测试

实验原理：由于鼠类属于社交型动物，每只正常鼠遇到陌生鼠后会频繁与其接触，单位时间内二者的接触交流时间会比较长；而经过慢性社会应激后的c57小鼠会产生孤避、逃避打击和社交恐惧等抑郁样症状，在遇到陌生鼠后会极力躲开以避免可能遭受类似的前期经历(被cd1鼠攻击)，单位时期内接触交流时间会比较短。通过计算规定时期内实验c57鼠与陌生鼠接触的时间长短来评价该c57鼠是否产生抑郁样症状。

实验在一小型敞箱(44×44cm)内进行(如图1)，首先往敞箱内一侧的中央放入一铁丝笼(10×6cm，用来放置陌生鼠)，并在该笼周围划分一矩形区域作为接触区域(14×26cm)，测试中一旦实验c57鼠进入此区域与陌生鼠接触即计入接触时间。

该测试分为两阶段：

1.targetabsent阶段:先不放入陌生鼠，铁丝笼空着，将一只实验c57鼠放入箱中；以5min为规定时期，计算c57鼠在这5min内进入到接触区域内的时间长短，设为a；

2.targetpresent阶段：铁丝笼内放入一陌生cd1雄鼠(此鼠不是先前的任何一只攻击性cd1鼠，完全陌生)，再将同一只实验c57鼠放入箱中，以5min为规定时间，再次计算它在这5min内进入到接触区域内的时间长短，设为b；

用b与a的比值作为行为学指标，该比值越小说明动物的抑郁样症状越明显。

7.敞箱实验(openfieldtest)

将测试小鼠放入敞箱中央，对其在规定时间内水平穿越的格数进行观察统计，该指标被广泛用来判断动物的自主活动程度，实验规定小鼠每三只脚进入一格算一分，测定时间持续3分钟。采用盲法进行，实验过程中保持环境的安静，在暗室中进行，敞箱上方距离40cm处挂一只50w的灯泡。每只动物测定完毕后均对敞箱进行彻底清扫以消除气味对下一只样本的干扰。

8.westernblotting免疫印迹试验

提取组织蛋白，然后定量灭活，进行免疫印迹试验。

(1)制胶。

(2)配制电泳液(1000ml双蒸水含tris-base3.03g、甘氨酸18.8g、sds1g)，将制好的胶固定在电泳槽中，加入电泳液，液面没过银丝，拔掉塑料梳，加入蛋白样本和marker；100v电压条件下电泳90min。

(3)配制转膜液(1000ml双蒸水含200ml甲醇、tris-base3.03g、甘氨酸14.4g)，电泳结束后，按蛋白分子量大小选择切胶，并准备滤纸和硝酸纤维膜；将滤纸、纤维膜、海绵和胶按次序叠放在夹板上，随后固定夹板于转膜槽中，冰上转膜(260ma,90min)。

(4)转膜结束后，取出硝酸纤维膜，浸入5％脱脂牛奶tbst中，常温下震摇封闭2h。

(5)封闭结束后，tbst洗膜3×10min，一抗孵育，4℃下震摇封闭过夜；然后取出硝酸纤维膜并回收一抗，tbst洗膜3×10min，二抗孵育2h，再次tbst洗膜3×10min。

(7)显影室显影。

二、实验结果：

1.穿心莲内酯在fst和tst中有抗抑郁作用

穿心莲内酯的抗抑郁作用首先在强迫游泳测试(fst)中进行研究，fst是应用的十分广泛的一种用来检测药物潜在抗抑郁能力的实验手段。我们以氟西汀为阳性对照药物，设置溶剂对照组、氟西汀组(20mg/kg)、穿心莲内酯低剂量组(30mg/kg)和穿心莲内酯高剂量组(60mg/kg)4个组别。实验结果发现，穿心莲内酯在fst中表现出了明显的抗抑郁样作用(图2a)，其中60mg/kg穿心莲内酯引起了小鼠不动时间约40％的减少，与氟西汀类似。

随后我们采用悬尾测试(tst)，tst和fst类似，是另一种快速、可靠的抗抑郁药物筛选方法。tst结果与fst结果相似，穿心莲内酯的给予明显降低了小鼠的不动时间(图2b)，且60mg/kg穿心莲内酯的效果与氟西汀相似。

为了排除穿心莲内酯在fst与tst中的抗抑郁作用是通过影响小鼠的自发活动性而产生，我们又进行了旷场试验以排除这方面的可能。结果显示，各组小鼠在测试中无论是穿过旷箱中心或是边缘的区域数量都没有显著差异性(图2c)。

2.穿心莲内酯能够逆转治疗cums与csds抑郁模型引发的抑郁样行为

我们进一步采用慢性不可预测应激(cums)与慢性社会挫败应激(csds)抑郁模型中来探讨研究穿心莲内酯的抗抑郁作用；cums与csds这两种抑郁模型都能够在动物身上有效模拟人类抑郁症的许多症状，如快感缺失、社交恐惧、行为绝望等。我们先用小鼠制造cums/csds抑郁模型，然后给予氟西汀或穿心莲内酯进行治疗，再进行各种行为学测试。

cums模型行为学数据结果如图3所示，而csds模型行为学数据结果如图3所示。从中我们可以看出，穿心莲内酯的持续给予显著逆转抑郁模型引起的快感缺失、社交恐惧以及行为绝望这些抑郁样行为，且60mg/kg穿心莲内酯的效果甚至优于氟西汀，再结合图2中的测试结果，我们证实穿心莲内酯确实具有抗抑郁效应。

3.穿心莲内酯能够逆转恢复cums与csds抑郁模型引发的海马bdnf信号通路水平降低

为探讨穿心莲内酯的抗抑郁作用和机制，我们使用westernblotting技术研究了其对cums与csds抑郁模型鼠脑海马bdnf蛋白表达的影响，以β-actin作为蛋白内参。实验结果如图5和图6显示，相对于溶剂对照鼠，cums抑郁鼠与csds抑郁鼠的海马bdnf表达水平都显著下降，而30mg/kg和60mg/kg穿心莲内酯的连续给予都不同程度的逆转了这一变化。

之后，我们也检测了抑郁模型和穿心莲内酯对海马bdnf下游信号通路关键分子(trkb与ptrkb、creb与pcreb)的作用影响。结果如图5和图6所示，与bdnf一样，穿心莲内酯的持续给予显著逆转了cums应激与csds应激诱导的海马ptrkb与pcreb表达水平减少；相反，各实验组之间的总trkb与creb蛋白水平不变。这些结果综合表明，海马bdnf信号通路很可能参与穿心莲内酯的抗抑郁作用。

4.穿心莲内酯的抗抑郁作用需要海马bdnf系统

为了进一步确定穿心莲内酯的抗抑郁作用是否需要bdnf系统参与，我们使用了bdnf受体trkb抑制剂k252a。我们先对c57bl/6j小鼠进行k252a(25μg/kg,每天1次)持续3天给予，随后进行穿心莲内酯的fst实验。结果发现k252a的预处理明显阻断了穿心莲内酯在fst测试中的抗抑郁作用(图7a)；相似的，k252a预处理也阻断了穿心莲内酯在tst测试中的抗抑郁作用(图7b)。

此外，我们对cums抑郁鼠与csds抑郁鼠分别给予60mg/kg穿心莲内酯和k252a的同时注射，持续14天，然后后进行行为学测试。图8数据结果表明，穿心莲内酯在cums抑郁模型中所展现的抗抑郁效应被bdnf通路阻断剂k252a明显阻断；而图9数据结果显示，穿心莲内酯在csds抑郁模型中所展现的抗抑郁效应被bdnf通路阻断剂k252a明显阻断。所以，穿心莲内酯的抗抑郁疗效是通过促进海马bdnf系统功能所致。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。