本发明属于药物制剂领域，涉及一种新型黄酮衍生聚合物纳米药物的构建及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术：
肿瘤的多药耐药、异质性及其与微环境之间的复杂联系等是当下肿瘤治疗中面临的严峻问题，单用某一种治疗方式可能难以实现较好的抗肿瘤效果。目前在临床上，肿瘤治疗的三大主要手段是手术切除、化学治疗和放射治疗，以上手段在肿瘤治疗中发挥了各自的优势，但同时不可避免地有一定的缺陷，如手术切除时难以切除微小病灶、容易复发，放射治疗周期长、易损害免疫功能和正常细胞，化疗药物毒副作用大等。近年来，一些新机制、新靶点的发现让更多元的组合治疗策略成为可能。不同机制的治疗手段或肿瘤治疗药物“多管齐下”，能有效弥补单一疗法的局限性，提高肿瘤杀伤效果，降低肿瘤耐药性和复发几率。
抗血管生成治疗被称为“第四种”肿瘤治疗的有效策略。其病理生理基础在于：当肿瘤细胞生长超过1-3mm3时，如果缺乏供养血管，肿瘤细胞将因缺乏充足的营养物质而停止生长甚至逐渐死亡。为了从机体获取更多营养物质，肿瘤细胞会分泌vegf、bfgf等促血管生成因子，诱导内皮细胞向肿瘤部位迁移，形成微血管，进而供养肿瘤细胞。血管和肿瘤细胞之间相互促进，产生正反馈，这将加速肿瘤细胞增殖、瘤体积增大，并可能增加肿瘤血行转移的几率。而抗血管生成治疗能有效阻断肿瘤血供，进而抑制肿瘤快速进展。肝素类多糖是一类亲水性糖胺聚糖大分子，具有良好的水溶性、生物相容性和生物可降解性。其能结合微环境中的vegf、bfgf等促血管生成因子，阻断其与血管内皮细胞上相应受体结合，抑制内皮细胞向肿瘤趋化和成管；同时，肝素类多糖还能与肿瘤细胞表面的肝素结合位点结合，并在该位点的介导下进入肿瘤细胞，下调促血管因子相关mrna，在转录水平抑制肿瘤细胞合成和释放促血管生成因子。从结构上看，丰富的羧基和羟基使其易于化学修饰，为制备纳米粒子和载药体系创造了良好的条件。
黄酮类小分子化合物是自然界储量丰富的天然产物，其抗肿瘤机制多样，如水飞蓟素具有抗氧化作用、抑制相关酶活性、诱导细胞周期阻滞等作用；白杨素能够促进抑癌基因表达、干预肿瘤细胞信号转导、逆转多药耐药、增敏放疗等；槲皮素的抗肿瘤活性与其抑制相关酶的活性、降低肿瘤细胞耐药性、诱导肿瘤细胞凋亡及雌激素样作用等有关。但黄酮类化合物在单独使用时，通常会出现疏水性强、体液中稳定性差、给药剂量高等不足之处，甚至在高剂量给药时带来毒副作用，使其作为天然产物安全性较好的优势随之削弱，限制了其在临床上的应用。
传统的化学治疗中，细胞毒药物占有很大比例，这些药物主要通过损伤和断裂肿瘤细胞dna骨架结构、改变dna碱基甲基化修饰程度、干扰dna复制和转录等方式，直接杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖。由于选择性低，全身主要器官毒性、免疫毒性、生殖毒性较为显著。如蒽环类抗生素之一的阿霉素能通过疏水驱动作用插入dna疏水区，干扰dna复制和转录相关酶系统的识别，因而起到抑制肿瘤增殖的作用，然而临床使用时需要密切监测其广泛的心脏毒性和肾脏毒性；又如长春碱类的伊立替康，可通过抑制拓扑异构酶i(topo-i)，损伤肿瘤细胞的dna复制，同时每日低剂量给药时还能抑制hif-1α、vegf及其mrna表达水平，进而产生血管生成抑制作用，但伊立替康可能导致中性粒细胞减少等血液毒性以及对胆碱能神经功能产生不良影响。
肿瘤细胞高表达环氧化酶，因而在肿瘤细胞内和肿瘤间质中产生高水平前列腺素类因子，后者能刺激血管内皮细胞增殖迁移、抑制免疫细胞对肿瘤的杀伤活性以及对微环境中巨噬细胞、成纤维细胞产生表型转化作用。非甾体抗炎药作为一大类脂质代谢干扰药物，能通过抑制环氧化酶，进而阻断花生四烯酸代谢为前列腺素类因子，起到解热、镇痛、抗炎作用，而此步骤也是其能够抗肿瘤抗血管的重要靶点之一。研究指出其通过抑制环氧化酶，进而阻断下游丝裂原活化蛋白激酶途径(mapk途径)和细胞外信号调节激酶(erk途径)介导的肿瘤侵袭，如塞来昔布能降低良性肠息肉转化为恶性肠癌的风险，其机制可能为上调结肠腺瘤性息肉基因(apc)这一抑癌基因，同时抑制原癌基因myc，进而抑制癌性病变；另外，有证据表明长期低剂量使用阿司匹林能有效降低消化道肿瘤的几率，因而其还可以作为一种肿瘤预防药物。然而，该类药物多为芳香酸结构，水溶性差，限制了其在全身给药中的应用；该类药物口服时，由于对分布在胃肠道的、起保护性作用的环加氧酶起到抑制作用，将产生不同程度的胃肠道损害；其中部分药物还有潜在的心血管毒性等。
光动力疗法是以激发光、光敏剂和微环境中的氧三者之间相互作用为基础的一种新的疾病治疗手段，是近年来肿瘤治疗领域的热点。光敏剂吸收特定波长的辐照光源而被激发，后又将吸收的光能迅速传递给微环境中的氧，使其被激发成活性氧(包括超氧离子、过氧化氢、单态氧等)，这些活性氧将破坏肿瘤细胞dna和细胞膜的完整性，产生强效的杀伤作用。此外，光动力疗法还能杀伤肿瘤微血管、增敏化疗药物以及激活机体免疫功能等。由于光动力疗法是一种局部治疗方法，即在光照区域内较特异地作用于靶组织、靶细胞，全身毒副作用小。然而其局限性在于：大多数光敏剂疏水性很强，在体内易被快速清除，且存在团聚、不稳定现象，造成全身给药困难；若使用有机溶剂增溶或助溶光敏剂，又要考虑溶剂的毒性；光敏剂进入体内后易与血浆蛋白结合，高结合率使之大部分被保留在血液循环中，而只有小部分有可能进入肿瘤组织；有研究者试图对光敏剂分子做亲水性修饰，如在芳环外部修饰葡萄糖、乳糖等亲水性基团，虽然水溶性有所增加，但仍然不能解决小分子光敏剂在全身弥散分布、选择性低的缺陷，以至于使用某些光敏剂时，患者需要避免阳光直射而不能在白天外出，给患者带来严重的身心损害。
针对上述肿瘤治疗中存在的问题，本发明使用了一种全新的合成方式，对天然疏水性黄酮类小分子进行脂肪族氨基衍生化处理，使其能被肝素类亲水性大分子的羧基共价连接，得到新型肝素-黄酮类衍生聚合物，进而制备新型黄酮衍生聚合物纳米药物。其优势在于：(1)有效改善了黄酮小分子中酚羟基反应性的问题，很好地解决了黄酮类小分子在体内水溶性低和稳定性差的问题。(2)肝素类多糖的羧基被疏水小分子占据后，能有效降低肝素类多糖的抗凝作用，增强静脉给药时的安全性。(3)该新型肝素-黄酮类衍生聚合物在功能上兼有黄酮类化合物和肝素类多糖的治疗优势，即促肿瘤凋亡作用和抗血管生成作用，其自身可单独作为一种抗肿瘤、抗血管生成药物，以此实现肿瘤治疗中的一级联用策略。(4)该聚合物在结构上为两亲性大分子结构，在体液等水性环境中能够自组装形成纳米尺度的药物递送系统，即新型黄酮衍生聚合物纳米药物。(5)该纳米药物通过π-π堆积作用和疏水驱动作用等分子间作用，强力装载其他不同机制的含有芳香结构的疏水性肿瘤治疗药物，如细胞毒药物、肿瘤脂质代谢干扰物以及光动力治疗药物，借助纳米制剂靶向性、高效性等的优势，有效改善了小分子肿瘤治疗药物水溶性差、全身非选择分布等带来的局限性，降低了全身毒性和脱靶效应；不同机制的肿瘤治疗药物纳入黄酮衍生聚合物纳米药物中，以此实现肿瘤治疗中的二级联用策略。(6)装载不同机制肿瘤治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物还可根据临床治疗需要彼此组合、灵活选用，在传统细胞毒药物对肿瘤直接杀伤的同时，通过抑制肿瘤新生血管，或降低脂质来源的致炎因子，以及利用光敏剂产生杀伤性活性氧，将多种治疗方式的独特优势通过两个及以上的纳米体系得以联合起来，实现肿瘤治疗中的三级联用策略。(7)本发明得到的新型黄酮衍生聚合物纳米药物可与其他药剂学可接受辅料配伍，制备成注射、口服等多途径给药的剂型，具有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种全新的针对疏水性黄酮类小分子的亲水性大分子修饰方法。黄酮类小分子化合物以酚羟基和芳香共轭环为主要特征。使用一端为溴原子的脂肪胺连接臂对酚羟基做衍生化处理，同时结合氨基保护与脱保护策略，大大提高了反应的选择性和产率。将高活性的氨基和肝素类多糖的羧基共价结合，得到经肝素类多糖修饰的疏水性黄酮类衍生物，即新型肝素-黄酮衍生聚合物，其能在水性介质中自组装，得到新型黄酮衍生聚合物纳米药物。
本发明的另一个目的是以上述新型黄酮衍生聚合物纳米药物为基础，提供一套全新的肿瘤治疗药物联用体系的构建策略。肿瘤的多药耐药、异质性及其与微环境之间的复杂联系等是当今肿瘤治疗中面临的严峻问题，单用某一种治疗方式可能难以实现较好的抗肿瘤效果。在本发明中，新型黄酮衍生聚合物纳米药物自身兼有抗血管生成和促肿瘤细胞凋亡作用，肝素类多糖和黄酮类小分子通过共价连接成为一个体系，可实现一级联用策略。此外，干扰肿瘤细胞dna传递和表达的细胞毒类药物能直接杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖，通过降低肿瘤脂质相关致炎因子的脂质代谢干扰药物能减少血管新生、抑制间质细胞表型转化进而改善微环境，通过产生活性单态氧的光动力治疗药物对肿瘤细胞造成不可逆损伤，将上述不同机制的肿瘤治疗药物纳入新型黄酮衍生聚合物纳米药物纳米体系，可实现二级联用策略。另外，装载不同肿瘤治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物，还可根据临床治疗需要灵活组合、一同给药，以实现其在肿瘤治疗中的三级联用策略。
本发明还有一个目的是以上述新型黄酮衍生聚合物纳米药物为基础，提供一种针对含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物的增效减毒的方式。疏水性肿瘤治疗药物在肿瘤治疗中存在的普遍问题包括稳定性差、易于沉降聚集、半衰期短、全身分布、选择性差、毒副作用大等等。本发明中，新型黄酮衍生聚合物纳米药物以黄酮的疏水共轭骨架为内核，通过与含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物之间产生π-π堆积作用、疏水驱动作用等分子间相互作用，实现对这些肿瘤治疗药物的强力装载，为这些疏水性肿瘤治疗药物提供了适宜其分散的疏水空间，进而起到有效的增溶作用；肝素类多糖构成的亲水外壳能有效保护内部疏水性肿瘤治疗药物在血液中不被快速代谢，延长这些药物的半衰期，进而起到有效的稳定作用；纳米药物是一种纳米尺度的药物传递系统，能通过epr效应和亲水外壳的长循环作用，增加肿瘤部位的靶向性，使药物在肿瘤部位富集，增强药物对肿瘤的治疗效果，同时减少全身弥散分布，进而降低毒副作用。
本发明还有一目的是提供上述基于新型黄酮衍生聚合物纳米药物的制备方法。
本发明的最后一个目的是提供上述新型黄酮衍生聚合物纳米药物在肿瘤治疗中的应用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种新型黄酮衍生聚合物纳米药物。从两端分别为溴原子和氨基的、间隔不同碳原子数的连接臂出发，利用亲核反应原理和氨基保护与脱保护策略，对含有共轭结构的疏水性黄酮类小分子的酚羟基做氨基衍生化处理，使黄酮类小分子偶联高反应活性的脂肪族氨基，随后与肝素类多糖骨架结构的羧基通过化学偶联，形成新型肝素-黄酮衍生聚合物，其能在水性介质中自组装得到新型黄酮衍生聚合物纳米药物；通过简单的物理混合，装载细胞毒类药物、肿瘤细胞脂质代谢干扰物和光动力治疗药物这三大类肿瘤治疗药物，形成多机制于一体的纳米药物；装载不同机制肿瘤治疗药物的纳米体系彼此之间还能灵活组合、一同给药；上述组合方式可实现多种肿瘤治疗药物在肿瘤治疗中的逐级联用策略。新型黄酮衍生聚合物纳米药物制备工艺简单，产率高，重现性好；药物与载体之间依靠多种分子间作用力紧密结合，对这些疏水肿瘤治疗药物起到了显著的增溶效果；且粒度适宜，能充分利用纳米体系的epr效应蓄积于肿瘤组织，提高肿瘤治疗药物的靶向性和联合治疗效果。
所述的新型肝素-黄酮衍生聚合物，其中疏水性黄酮类小分子选自白杨素、黄芩素、汉黄芩素、槲皮素、甘草素、大豆素、葛根素、芹菜素、陈皮素；所述的新型肝素-黄酮衍生聚合物，其中肝素类多糖包括未分级肝素、低分子量肝素及脱硫酸化肝素。
所述的新型黄酮衍生聚合物纳米药物的制备方法，其中新型肝素-黄酮衍生聚合物的制备方法如下：
(1)将含有游离氨基的溴化物连接臂溶于适当有机溶剂，加入适量氨基保护剂，随后加入适量的活化剂和适量三乙胺，控制反应条件至反应完全，分别用酸性洗液、碱性洗液和饱和氯化钠溶液洗涤或通过硅胶柱色谱分离，旋干有机溶剂，得到粘稠液体，即为中间体i；
(2)将天然疏水性黄酮类小分子溶于适当有机溶剂，加入适量活化剂，加入适量中间体i，控制反应条件至反应完全，加大量水使沉淀析出，乙酸乙酯萃取，干燥，旋干后得到中间体ii；
(3)将中间体ii溶于适当有机溶剂，加入适量氨基脱保护剂，控制反应条件至反应完全，加入沉淀剂，所得沉淀洗涤、采用适当干燥方法干燥后，得到中间体iii；
(4)将肝素类多糖溶于适当溶剂中，在惰性气体保护和冰浴条件下，加入适量羧基活化剂；再加入适量中间体iii，加入适量三乙胺；控制反应条件至反应完全，使用离心或滤膜除去不溶物后，用适当沉淀剂沉淀；收集沉淀，加水复溶，装入透析袋用单蒸水透析，透析完毕后采用适当干燥方法除去水分，即得新型肝素-黄酮衍生聚合物。
所述的制备方法中，步骤(1)中所述的溴化物连接臂包括中间碳原子数为2～6个的亚烷基溴胺及其氢溴酸盐或盐酸盐；所述的适当有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯；所述的氨基保护剂选自二碳酸二叔丁酯、氯甲酸苄酯；所述的活化剂选自n，n-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑；所述的酸性洗液为0.01～0.5mol/l的稀盐酸或稀硫酸；碱性洗液为碳酸氢钠饱和溶液。
所述的制备方法中，步骤(2)中所述的适当有机溶剂为甲酰胺、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中一种或几种的混合体系；所述的活化剂为碳酸钾、碳酸钠；
所述的制备方法中，步骤(3)中所述的适当有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、二氧六环；所述的氨基脱保护剂为三氟乙酸、盐酸、氢溴酸中一种或几种的混合体系；所述的沉淀剂为乙醚或无水乙醚；所述的适当干燥方法为挥干或旋干。
所述的制备方法中，步骤(4)中所述的肝素类多糖选自未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素；所述的适当溶剂为甲酰胺、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中一种或几种的混合体系；所述的羧基活化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑、或者二环己基碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺；所述的适当沉淀剂为冰丙酮或冰乙醇；所述的收集沉淀的方法为离心或减压抽滤；所述的适当干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
所述的新型黄酮衍生聚合物纳米药物，可单独作为良好的抗肿瘤、抗血管生成药物，由于肝素类多糖和黄酮类小分子通过共价连接成为一体，借此实现肿瘤治疗中的一级联合策略；该纳米药物还可作为纳米载体，通过π-π堆积作用和疏水驱动作用等分子间相互作用物理包载含有共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物，进而将这些抗肿瘤机制各具特色的药物共同纳入一个体系，以此构成二级联用策略。所述的含有共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物，包括细胞毒类药物、肿瘤细胞脂质代谢干扰物、光动力治疗药物中的任一疏水性药物。
所述的基于二级联用策略的新型黄酮衍生聚合物纳米药物的制备方法如下：
工艺i：将新型肝素-黄酮衍生聚合物溶于适量水中；将一定比例的含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物用适宜有机溶剂溶解，缓慢滴加到新型肝素-黄酮衍生聚合物溶液中。搅拌、超声后，采用透析法或超滤法除去小分子和有机溶剂，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，可得到粒径均一的聚合物纳米药物组合物。得到的聚合物纳米药物组合物可直接应用，也可干燥制成固体制剂。
工艺ii：将新型肝素-黄酮衍生聚合物溶于适量水中；将一定比例的含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物用适宜有机溶剂溶解。将两者混合，室温下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，采用离心法或柱分离法除去小分子，过0.8μm滤膜，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，可得到粒径均一的聚合物纳米药物组合物。得到的聚合物纳米药物组合物可直接应用，也可干燥制成固体制剂。
具体方案如下：
在含有共轭结构的天然疏水性黄酮类小分子上引入亲水性肝素类多糖，得到新型肝素-黄酮衍生聚合物，进而在水性介质中自组装得到新型黄酮衍生聚合物纳米药物，有效提高了疏水性黄酮类小分子在水性环境中的溶解性和稳定性；其亲水外壳有助于避免被网状内皮系统吞噬，延长其在血液中的循环时间；其纳米尺寸能充分利用epr效应，配合长循环作用实现肿瘤部位的富集，以此实现在肿瘤治疗中的一级联用策略；难溶性肿瘤治疗药物被物理包裹在该纳米体系中，能借助纳米体系优势，增加对肿瘤部分的选择性递送，降低全身毒副作用，以此实现在肿瘤治疗中的二级联用策略；装载不同机制肿瘤治疗药物的纳米药物可根据临床治疗的需要，灵活选择比例，彼此继续组合，以此实现在肿瘤治疗中的三级联用策略。上述纳米体系均粒径可控，均匀度好，载药量高，复溶后品质佳；还可加上相应的药用辅料，制备成相应的用于注射或口服给药的制剂。
所述的新型黄酮衍生聚合物纳米药物的制备及其在肿瘤治疗中联用策略的实现，其具体实施方案如下：
一、新型肝素-黄酮衍生聚合物的制备
(1)将含有游离氨基的溴化物连接臂溶于适当有机溶剂，加入适量氨基保护剂，随后加入适量的活化剂和适量三乙胺，控制反应条件至反应完全，分别用酸性洗液、碱性洗液和饱和氯化钠溶液洗涤或通过硅胶柱色谱分离，旋干有机溶剂，得到粘稠液体，即为中间体i。
合成路线如下：
(boc-r1：二碳酸二叔丁酯、氯甲酸苄酯；br-r2-nh2：中间碳原子数为2～6个的亚烷基溴胺及其氢溴酸盐或盐酸盐；活化剂：n，n-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑)
(2)将天然疏水性黄酮类小分子溶于适当有机溶剂，加入适量活化剂，加入适量中间体i，控制反应条件至反应完全，加大量水使沉淀析出，乙酸乙酯萃取，干燥，旋干后得到中间体ii。
合成路线如下：
(r3-oh：白杨素、黄芩素、汉黄芩素、槲皮素、甘草素、大豆素、葛根素、芹菜素、陈皮素；活化剂：碳酸钾、碳酸钠)
(3)将中间体ii溶于适当有机溶剂，加入适量氨基脱保护剂，控制反应条件至反应完全，加入沉淀剂，所得沉淀洗涤、采用适当干燥方法干燥后，得到中间体iii。
合成路线如下：
(氨基脱保护剂：三氟乙酸、盐酸、氢溴酸中一种或几种的混合体系)
(4)将肝素类多糖溶于适当溶剂中，在惰性气体保护和冰浴条件下，加入适量羧基活化剂；再加入适量中间体iii，加入适量三乙胺；控制反应条件至反应完全，使用离心或滤膜除去不溶物后，用适当沉淀剂沉淀；收集沉淀，加水复溶，装入透析袋用单蒸水透析，透析完毕后采用适当干燥方法除去水分，即得新型肝素-黄酮衍生聚合物。
合成路线如下：
(r4-cooh：未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素；羧基活化剂：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑、或者二环己基碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺)
上述步骤(1)中所述的溴化物连接臂包括中间碳原子数为2～6个的亚烷基溴胺及其氢溴酸盐或盐酸盐；所述的适当有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯；所述的氨基保护剂选自二碳酸二叔丁酯、氯甲酸苄酯；所述的适量氨基保护剂是指其与溴化物连接臂的摩尔比为1～5∶1；所述的活化剂选自n，n-二甲基-4-吡啶胺、4-吡咯烷基吡啶、1-羟基苯并三唑；所述的适量活化剂是指其与溴化物连接臂的摩尔比为1～5∶5；所述的适量三乙胺是指其与溴化物连接臂的摩尔比为1～5∶1；所述的酸性洗液为0.01～0.5mol/l的稀盐酸或稀硫酸；碱性洗液为碳酸氢钠饱和溶液；所述的反应条件为10～30℃。
上述步骤(2)中所述的适当有机溶剂为甲酰胺、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中一种或几种的混合体系；所述的活化剂为碳酸钾、碳酸钠；所述的适量活化剂是指其与疏水性黄酮类小分子的摩尔比为1～5∶1；所述的适量中间体i是指其与疏水性黄酮类小分子的摩尔比为1～5∶1；所述的反应条件为35～100℃。
上述步骤(3)中所述的适当有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、二氧六环；所述的氨基脱保护剂为三氟乙酸、盐酸、氢溴酸中一种或几种的混合体系；所述的适量氨基脱保护剂是指其与中间体ii的摩尔比为5～50∶1；所述的反应条件为10～30℃；所述的沉淀剂为乙醚或无水乙醚；所述的适当干燥方法为挥干或旋干。
上述步骤(4)中所述的肝素类多糖选自未分级肝素、低分子量肝素、脱硫酸化肝素；所述的适当溶剂为甲酰胺、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜中一种或几种的混合体系；所述的羧基活化剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺、或者1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑、或者二环己基碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺；所述的适量羧基活化剂是指其与肝素类多糖中羧基的摩尔比为1～10∶1；所述的适量中间体iii是指其与肝素类多糖中羧基的摩尔比为1～10∶1；所述的适量三乙胺是指其与中间体iii的摩尔比为2～20∶1；所述的反应条件为冰浴条件下先向肝素类多糖中滴加羧基活化剂，保持冰浴0.5～4h后，再加入中间体iii和三乙胺，继续室温反应6～72h；所述的适当沉淀剂为冰丙酮或冰乙醇；所述的收集沉淀的方法为离心或减压抽滤；所述的适当干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
二、基于二级联用策略的新型黄酮衍生聚合物纳米药物的制备
工艺i：将新型肝素-黄酮衍生聚合物与水按重量比(mg/mg)2～50∶1000的比例混合制成溶液；将一定比例的含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物用适量有机溶剂溶解；将肿瘤治疗药物溶液缓慢滴加到新型肝素-黄酮衍生聚合物溶液中，室温搅拌0.5～2h后，冰浴下探头超声10～30min；采用透析法或超滤法除去小分子和有机溶剂，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，即得；
工艺ii：将新型肝素-黄酮衍生聚合物与水按重量比(mg/mg)2～50∶1000的比例混合制成溶液；将一定比例的含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物用适量有机溶剂溶解；将两者混合，冰浴下探头超声10～30min，室温下敞口搅拌过夜或使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，后采用离心法或柱分离法除去小分子，过0.8μm滤膜，后采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥除去水分，即得。
工艺i和工艺ii中所述的一定比例是指肿瘤治疗药物与新型肝素-黄酮衍生聚合物的质量比(mg/mg)为1∶2～5；工艺i中所述的有机溶剂选自n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、乙醇、甲醇、二氯甲烷、吡啶、聚乙烯吡咯烷酮；工艺i中所述的适量有机溶剂是指其与水的体积比为1∶2～10；工艺ii中所述的有机溶剂选自二氯甲烷、乙醚、无水乙醚；工艺ii中所述的适量有机溶剂是指其与水的体积比为1∶2～10。
所述的含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物包括：细胞毒类药物，包括阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌、达卡巴嗪、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、7-羟基香豆素、补骨脂素、蛇床子素、鬼臼毒素、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、拓扑替康、伊立替康及其活性代谢物sn-38、紫杉醇、多西他赛；肿瘤脂质代谢干扰药物，包括阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、美洛昔康、塞来昔布、罗非昔布；光动力疗法药物，包括酞菁、酞菁锌、酞菁铜、酞菁镍、酞菁硅、酞菁镓及这些酞菁化合物的衍生物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首先解决了含有共轭结构的、天然疏水性黄酮类小分子酚羟基反应性低的问题。酚羟基氧原子的电子云受到芳香环大π离域作用，反应活性比脂肪族羟基或氨基低，因此，利用一端溴原子的脂肪胺连接臂进攻酚羟基，通过亲核反应实现酚羟基的氨基衍生化，大大提高了黄酮类小分子的反应活性，拓展了其能参与的化学反应范围。另外，考虑到氨基和溴原子的反应性，在合成中还引入了氨基的保护和脱保护策略，简便易行、纯化方便、反应选择性和产率均较高。
(2)本发明中，疏水性黄酮类小分子利用衍生出的脂肪族氨基与肝素类多糖的羧基共价结合，很好地解决了黄酮类小分子在体内水溶性低和稳定性差的问题。黄酮类小分子在水性环境中倾向于聚结沉降，导致临床上血管内给药困难。而肝素修饰后的黄酮分子在水性环境中也会受到疏水作用驱动，产生聚集倾向，但由于与水溶性大分子连接，后者构成亲水外层将黄酮类小分子包裹在内部，抑制其聚结和沉降，大大提高了黄酮类小分子的水溶性和稳定性，便于其在血管给药中发挥作用。
(3)本发明中，利用黄酮类小分子衍生出的氨基与肝素类多糖的羧基相连，提高了肝素类多糖在全身给药中的安全性。肝素类多糖的羧基被认为可能导致出血时间延长，而氨基衍生化处理的黄酮通过化学反应占据肝素类多糖的游离羧基，有效降低了肝素潜在的抗凝、出血的副作用，大大提高了肝素多糖在肿瘤治疗中的安全性。
(4)本发明得到的新型黄酮衍生聚合物纳米药物在水溶液中外观澄清、均一稳定。肝素类多糖作为纳米药物的亲水性外壳，在水中充分伸展，产生强大的空间位阻，能有效降低被网状吞噬系统清除的几率，实现血液循环中较高的稳定性。同时，纳米尺寸的黄酮衍生聚合物纳米药物可充分利用epr效应带来的靶向作用，实现肿瘤部位高浓度富集，发挥抗肿瘤、抗血管作用，提高疗效，降低全身毒副作用。
(5)本发明得到的新型黄酮衍生聚合物纳米药物自身可以作为肿瘤治疗药物。肝素类多糖具有抗血管生成作用，而黄酮类小分子兼有促肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤血管生成的作用，共价偶联使两者合为一体，共同递送到肿瘤部位，实现协同肿瘤治疗作用，以此构成肿瘤治疗中的一级联用策略。
(6)本发明针对现有肿瘤治疗药物普遍存在的溶解性差的问题，向纳米体系中引入了天然疏水性黄酮类小分子这一结构。黄酮类小分子的骨架结构不仅具有很强的疏水性，而且其中的芳环结构具有突出的共轭特征，因而能通过π-π堆积作用和疏水相互作用等分子间作用力，实现对含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物的强力组装，提高这些肿瘤治疗药物在体内的溶解性和稳定性，充分体现出该新型黄酮衍生聚合物纳米药物的普适性，这也是本发明中所述的二级联用策略的基础。
(7)本发明中得到的新型黄酮衍生聚合物纳米药物能有效提高肿瘤治疗药物的靶向性。对于疏水性肿瘤治疗药物而言，强大的载药功能使其被高效地包覆于纳米药物内部，在血液循环中的物理稳定性和化学稳定性得到有效保证；血浆蛋白结合减少，体内半衰期延长，体内药动学行为明显改善；纳米体系充分发挥纳米递送的靶向、精准优势，提高细胞毒类药物、肿瘤脂质代谢干扰药物和光动力治疗药物在肿瘤及其微环境中的分布，进一步实现在降低给药剂量的同时，达到与游离的肿瘤治疗药物相同甚至更好的治疗效果。
(8)本发明中得到的新型黄酮衍生物聚合物纳米药物能有效降低肿瘤治疗药物的毒副作用。由于药物被包裹在内部，其体内行为取决于纳米体系，而长循环作用和epr效应使纳米药物在非靶器官的分布明显减少。细胞毒类药物的主要器官毒性如脱发、心脏毒性、肾脏毒性、血液毒性、骨髓毒性等均有效降低；由于被纳米体系装载，肿瘤脂质代谢干扰物的全身弥散分布效应减轻，因而对正常组织的脂质代谢无干扰，降低了胃肠道损伤、心血管风险等不良反应的发生率；对于光动力治疗而言，疏水性光敏剂在纳米体系中得到了增溶、稳定，减弱了其自身易于聚集、沉降的倾向，同时向正常组织的分布明显减少，降低了体表正常组织的光毒性。
(9)本发明中的新型黄酮衍生聚合物纳米药物可以实现更高级别的抗肿瘤药物联用策略。载药后的黄酮衍生聚合物纳米药物除了拥有肝素类多糖的的抗血管作用和黄酮类小分子的抗肿瘤、抗血管作用外，还联合了细胞毒药物、肿瘤细胞脂质代谢干扰药物或光动力治疗药物，以此构成肿瘤治疗中的二级联用策略；装载不同肿瘤治疗药物的纳米体系之间还能根据临床需要彼此组合、灵活选用，如患者需要接受多种肿瘤治疗药物时，可同时组合两个及以上装载不同肿瘤治疗药物的纳米体系，使它们稳定共存于同一水性体系，同时给药，避免常规联合治疗分开多次注射问题，同时亦可减轻患者因短时间内多次给药带来的痛苦，这是更广泛、更高水平的三级联用策略。
(10)本发明得到的新型黄酮衍生聚合物纳米药物，具有良好的生物相容性和生物可降解性。
(11)本发明得到的新型黄酮衍生聚合物纳米药物可与其他药剂学可接受辅料配伍，制备成注射、口服等多途径给药的剂型，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1：黄芩素-脱硫酸化肝素衍生聚合物的制备
称取2-溴乙胺氢溴酸盐置于茄形瓶中，加入二氯甲烷作溶剂，随后加入二碳酸二叔丁酯。二碳酸二叔丁酯与2-溴乙胺氢溴酸盐的摩尔比为1.05∶1。另称取n，n-二甲基-4-吡啶胺、吸取三乙胺于5mlep管，加入2ml二氯甲烷使溶解，缓慢滴入上述茄形瓶中。n，n-二甲基-4-吡啶胺与2-溴乙胺氢溴酸盐的摩尔比为2∶5，三乙胺与2-溴乙胺氢溴酸盐的摩尔比为2∶1。室温反应40min后，转移到分液漏斗，分别用0.1mol/l稀硫酸、碳酸氢钠饱和溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤三次。洗涤完毕后，将有机相转入锥形瓶，加无水硫酸钠吸水2h。转入砂芯漏斗抽滤，滤液旋蒸除去二氯甲烷，得中间体i。
称取一定量黄芩素和摩尔量5倍于黄芩素的碳酸钾装入茄形瓶，加入n，n-二甲基甲酰胺，50℃加热回流60min。中间体i溶于n，n-二甲基甲酰胺，逐滴加入上述茄形瓶，50℃加热回流下继续反应。黄芩素与中间体i的摩尔比为1∶1.05。5h后，加入大量水使产物析出。乙酸乙酯多次萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥2h，转入砂芯漏斗抽滤，滤液上旋蒸除去乙酸乙酯，得中间体ii。
称取中间体ii装入茄形瓶，加入二氯甲烷作溶剂，按摩尔比三氟乙酸：中间体ii＝20∶1逐滴加入三氟乙酸，室温搅拌40min。反应结束后，将整个体系倾入乙醚中，冰浴30min促进产物沉出。离心(4000rpm，2min)得沉淀，乙醚洗涤三次，沉淀物转移至圆底烧瓶，旋蒸除去残留乙醚，得到中间体iii。
称取适量脱硫酸化肝素溶于甲酰胺，脱硫酸化肝素的羧基与中间体iii的摩尔比为1∶2。加热至60℃辅助溶解后，冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、羟基琥珀酰亚胺与脱硫酸化肝素的羧基的摩尔比为4∶4∶1。冰浴活化2h后，将中间体iii的二甲基亚砜溶液加入活化的脱硫酸化肝素溶液中，加入摩尔量10倍于中间体iii的三乙胺，室温反应24h。反应结束后，离心除去不溶物，清液倾入10倍体积的冰丙酮，所得沉淀即为黄芩素-脱硫酸化肝素衍生聚合物。蒸馏水复溶，置于透析袋中透析48h，通过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得。
实施例2：白杨素-低分子量肝素衍生聚合物的制备
称取3-溴丙胺氢溴酸盐置于茄形瓶中，加入二氯甲烷作溶剂，随后加入二碳酸二叔丁酯。二碳酸二叔丁酯与3-溴丙胺氢溴酸盐的摩尔比为1.1∶1。另称取n，n-二甲基-4-吡啶胺、吸取三乙胺于5mlep管，加入2ml二氯甲烷使溶解，缓慢滴入上述茄形瓶中。n，n-二甲基-4-吡啶胺与3-溴丙胺氢溴酸盐的摩尔比为1∶5，三乙胺与3-溴丙胺氢溴酸盐的摩尔比为1.05∶1。室温反应40min后，转移到分液漏斗，分别用0.2mol/l稀盐酸、碳酸氢钠饱和溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤三次。洗涤完毕后，将有机相转入锥形瓶，加无水硫酸钠吸水2h。转入砂芯漏斗抽滤，滤液旋蒸除去二氯甲烷，得中间体i。
称取一定量白杨素和摩尔量5倍于白杨素的碳酸钾装入茄形瓶，加入n，n-二甲基甲酰胺，50℃加热回流40min。中间体i溶于n，n-二甲基甲酰胺，逐滴加入上述茄形瓶，50℃加热回流下继续反应。白杨素与中间体i的摩尔比为1∶1.05。5h后，加入10倍量水使产物析出。使用大量乙酸乙酯萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥2h，转入砂芯漏斗抽滤，滤液上旋蒸除去乙酸乙酯，得中间体ii。
称取中间体ii装入茄形瓶，加入2ml二氯甲烷，按摩尔比三氟乙酸：中间体ii＝10∶1逐滴加入三氟乙酸，室温搅拌60min。反应结束后，将整个体系倾入无水乙醚中，冰浴30min促进产物沉出。砂芯漏斗抽滤得沉淀，无水乙醚洗涤三次，沉淀物转移至圆底烧瓶，旋蒸除去残留无水乙醚，得到中间体iii。
称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，低分子量肝素的羧基与中间体iii的摩尔比为1∶2。加热至60℃辅助溶解后，冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、羟基琥珀酰亚胺与低分子量肝素的羧基的摩尔比为4∶4∶1。冰浴活化1h后，将中间体iii的二甲基亚砜溶液加入活化的低分子量肝素溶液中，加入摩尔量5倍于中间体iii的三乙胺，室温反应24h。反应结束后，离心除去不溶物，清液倾入10倍体积的冰丙酮，所得沉淀即为白杨素-低分子量肝素衍生聚合物。蒸馏水复溶，置于透析袋中透析48h，通过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得。
实施例3：槲皮素-未分级肝素衍生聚合物的制备
称取4-溴1-丁胺氢溴酸盐置于茄形瓶中，加入二氯甲烷作溶剂，随后加入氯甲酸苄酯。氯甲酸苄酯与4-溴1-丁胺氢溴酸盐的摩尔比为3∶1。另称取4-吡咯烷基吡啶、吸取三乙胺于5mlep管，加入2ml二氯甲烷使溶解，缓慢滴入上述茄形瓶中。4-吡咯烷基吡啶与4-溴1-丁胺氢溴酸盐的摩尔比为3∶5，三乙胺与4-溴1-丁胺氢溴酸盐的摩尔比为3∶1。室温反应1h后，转移到分液漏斗，分别用0.1mol/l稀硫酸、碳酸氢钠饱和溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤三次。洗涤完毕后，将有机相转入锥形瓶，加无水硫酸钠吸水2h。转入砂芯漏斗抽滤，滤液旋蒸除去二氯甲烷，得中间体i。
称取一定量槲皮素和摩尔量3倍于槲皮素的碳酸钠装入茄形瓶，加入n，n-二甲基乙酰胺，50℃加热回流60min。中间体i溶于n，n-二甲基乙酰胺，逐滴加入上述茄形瓶，50℃加热回流下继续反应。槲皮素与中间体i的摩尔比为1∶2。5h后，加入大量水使产物析出。乙酸乙酯多次萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥2h，转入砂芯漏斗抽滤，滤液上旋蒸除去乙酸乙酯，得中间体ii。
称取中间体ii装入茄形瓶，加入二氯甲烷作溶剂，按摩尔比三氟乙酸：中间体ii＝20∶1逐滴加入三氟乙酸，室温搅拌40min。反应结束后，将整个体系倾入乙醚中，冰浴30min促进产物沉出。离心(4000rpm，2min)得沉淀，乙醚洗涤三次，沉淀物转移至圆底烧瓶，旋蒸除去残留乙醚，得到中间体iii。
称取适量未分级肝素溶于甲酰胺，未分级肝素的羧基与中间体iii的摩尔比为1∶5。冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑与未分级肝素的羧基的摩尔比为5∶5∶1。冰浴活化1h后，将中间体iii的二甲基亚砜溶液加入活化的未分级肝素溶液中，加入摩尔量10倍于中间体iii的三乙胺，室温反应48h。反应结束后，离心除去不溶物，清液倾入10倍体积的冰乙醇，所得沉淀即为槲皮素-未分级肝素衍生聚合物。蒸馏水复溶后，置于透析袋中透析48h，通过0.8μm微孔滤膜，真空干燥，即得。
实施例4：槲皮素-低分子量肝素衍生聚合物的制备
称取2-溴乙胺氢溴酸盐置于茄形瓶中，加入二氯甲烷作溶剂，随后加入二碳酸二叔丁酯。二碳酸二叔丁酯与2-溴乙胺氢溴酸盐的摩尔比为1.03∶1。另称取n，n-二甲基-4-吡啶胺、吸取三乙胺于5mlep管，加入2ml二氯甲烷使溶解，缓慢滴入上述茄形瓶中。n，n-二甲基-4-吡啶胺与2-溴乙胺氢溴酸盐的摩尔比为1∶5，三乙胺与2-溴乙胺氢溴酸盐的摩尔比为1.1∶1。室温反应40min后，转移到分液漏斗，分别用0.2mol/l稀盐酸、碳酸氢钠饱和溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤三次。洗涤完毕后，将有机相转入锥形瓶，加无水硫酸钠吸水2h。转入砂芯漏斗抽滤，滤液旋蒸除去二氯甲烷，得中间体i。
称取一定量槲皮素和摩尔量5倍于槲皮素的碳酸钾装入茄形瓶，加入n，n-二甲基甲酰胺，60℃加热回流60min。中间体i溶于n，n-二甲基甲酰胺，逐滴加入上述茄形瓶，60℃加热回流下继续反应。槲皮素与中间体i的摩尔比为1∶1.5。5h后，加入大量水使产物析出。乙酸乙酯多次萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥2h，转入砂芯漏斗抽滤，滤液上旋蒸除去乙酸乙酯，得中间体ii。
称取中间体ii装入茄形瓶，加入二氯甲烷作溶剂，按摩尔比三氟乙酸：中间体ii＝15∶1逐滴加入三氟乙酸，室温搅拌60min。反应结束后，将整个体系倾入无水乙醚中，冰浴30min促进产物沉出。砂芯漏斗抽滤得沉淀，无水乙醚洗涤三次，沉淀物转移至圆底烧瓶，旋蒸除去残留无水乙醚，得到中间体iii。
称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，低分子量肝素的羧基与中间体iii的摩尔比为1∶3。加热至60℃辅助溶解后，冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、羟基琥珀酰亚胺与低分子量肝素的羧基的摩尔比为4∶4∶1。冰浴活化1.5h后，将中间体iii的二甲基亚砜溶液加入活化的低分子量肝素溶液中，加入摩尔量5倍于中间体iii的三乙胺，室温反应24h。反应结束后，离心除去不溶物，清液倾入10倍体积的冰丙酮，所得沉淀即为槲皮素-低分子量肝素衍生聚合物。蒸馏水复溶，置于透析袋中透析48h，通过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得。
实施例5：黄芩素-低分子量肝素衍生聚合物的制备
称取4-溴1-丁胺氢溴酸盐置于茄形瓶中，加入二氯甲烷作溶剂，随后加入二碳酸二叔丁酯。二碳酸二叔丁酯与4-溴1-丁胺氢溴酸盐的摩尔比为1.03∶1。另称取4-吡咯烷基吡啶、吸取三乙胺于5mlep管，加入2ml二氯甲烷使溶解，缓慢滴入上述茄形瓶中。4-吡咯烷基吡啶与4-溴1-丁胺氢溴酸盐的摩尔比为1∶5，三乙胺与4-溴1-丁胺氢溴酸盐的摩尔比为1.05∶1。室温反应1h后，转移到分液漏斗，分别用0.2mol/l稀硫酸、碳酸氢钠饱和溶液和饱和氯化钠溶液分别洗涤三次。洗涤完毕后，将有机相转入锥形瓶，加无水硫酸钠吸水2h。转入砂芯漏斗抽滤，滤液旋蒸除去二氯甲烷，得中间体i。
称取一定量黄芩素和摩尔量3倍于黄芩素的碳酸钠装入茄形瓶，加入二甲基亚砜，50℃加热回流60min。中间体i溶于二甲基亚砜，逐滴加入上述茄形瓶，50℃加热回流下继续反应。黄芩素与中间体i的摩尔比为1∶3。5h后，加入大量水使产物析出。乙酸乙酯多次萃取，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥2h，转入砂芯漏斗抽滤，滤液上旋蒸除去乙酸乙酯，得中间体ii。
称取中间体ii装入茄形瓶，加入二氯甲烷作溶剂，按摩尔比三氟乙酸：中间体ii＝20∶1逐滴加入三氟乙酸，继续室温搅拌40min。反应结束后，将整个体系倾入乙醚中，冰浴30min促进产物沉出。离心(4000rpm，2min)得沉淀，乙醚洗涤三次，沉淀物转移至圆底烧瓶，旋蒸除去残留乙醚，得到中间体iii。
称取适量低分子量肝素溶于甲酰胺，低分子量肝素的羧基与中间体iii的摩尔比为1∶4。冰浴条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑与低分子量肝素的羧基的摩尔比为3∶3∶1。冰浴活化1h后，将中间体iii的二甲基亚砜溶液加入活化的低分子量肝素溶液中，加入摩尔量5倍于中间体iii的三乙胺，室温反应24h。反应结束后，离心除去不溶物，清液倾入10倍体积的冰丙酮，所得沉淀即为黄芩素-低分子量肝素衍生聚合物。蒸馏水复溶后，置于透析袋中透析48h，通过0.8μm微孔滤膜，真空干燥，即得。
实施例6：aptt法检测新型肝素-黄酮衍生聚合物的抗凝活性
采用活化部分凝血活酶时间(aptt)法检测新型肝素-黄酮衍生聚合物的抗凝血活性。兔耳缘静脉取血，置于含有1/10体积0.109m的枸橼酸钠抗凝液(1份抗凝液+9份全血)的塑料管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，收集上层液(血浆)。将0.1ml样品溶液(20μg/ml)加入0.4ml枸橼酸钠血浆中，再加入37℃预温的aptt试剂0.1ml，37℃孵育5min。同时以空白血浆作为对照。然后，加入37℃预温的0.025mol/l氯化钙溶液0.1ml，启动秒表，记录血浆凝固时间，每个样品做3个复管测定，取平均值。结果见表1。结果表明，疏水性黄酮类小分子与肝素类多糖共价连接后，能明显降低后者的抗凝活性，提高了肝素类多糖在血管给药中的安全性。
表1新型黄酮衍生聚合物的抗凝活性
实施例7：相对血红蛋白含量(rhb)测定评价新型肝素-黄酮衍生聚合物的抗血管生成活性
将基质胶与血管生长因子bfgf以及不同的肝素-黄酮衍生聚合物混合，分别皮下注射于雄性小鼠腋下，10天后处死小鼠，分离出基质胶，用低渗裂解液匀浆，离心，取上清液加入drabkin’s试剂，于540nm下测定吸光度(asample)，按公式(1)计算rhb含量。在此公式中，阴性对照组的吸光度为a0％，阳性对照组的吸光度为a100％。各肝素-黄酮衍生聚合物组的rhb含量测定结果见表2。结果表明，相比于两者单独使用时，疏水性黄酮类小分子与肝素类多糖共价连接后产生了更强的抗血管生成活性。
表2相对血红蛋白含量(rhb)测定评价肝素衍生物抗血管生成活性
实施例8：新型肝素-黄酮衍生聚合物固体状态和溶液状态的放置稳定性
制备一批槲皮素-脱硫酸化肝素衍生聚合物，室温密闭放置，于0天、20天分别取适量溶于水中使成浓度为1mg/ml的纳米药物溶液，测定粒径和多分散系数(pdi)，以此评价新型黄酮衍生聚合物纳米药物在固体状态的放置稳定性。从表3可以看出，新型黄酮衍生聚合物纳米药物室温下保存的稳定性良好。
称取陈皮素-低分子量肝素衍生聚合物适量，溶于适量蒸馏水，制备成浓度为1mg/ml的纳米药物溶液，室温放置48h，分别在0h、24h和48h测定溶液的粒径和多分散系数(pdi)，借此评价新型黄酮衍生聚合物纳米药物溶液的放置稳定性。从表4可以看出，新型黄酮衍生聚合物纳米药物在溶液中稳定性良好。
表3槲皮素-脱硫酸化肝素衍生聚合物纳米药物(固体状态)的放置稳定性
表4陈皮素-低分子量肝素衍生聚合物纳米药物(溶液状态)的放置稳定性
实施例9：载酞菁锌的白杨素-未分级肝素衍生聚合物纳米药物的制备
称取适量酞菁锌溶于适量聚乙烯吡咯烷酮，称取适量白杨素-未分级肝素衍生聚合物纳米药物溶于蒸馏水，室温快速搅拌30min后，将酞菁锌的聚乙烯吡咯烷酮溶液逐滴滴入。酞菁锌与白杨素-未分级肝素衍生聚合物纳米药物的质量比为1∶3。混合后冰浴下探头超声30min，将混合体系转入超滤管以除去小分子和有机溶剂，真空干燥，即得。
实施例10：载塞来昔布的槲皮素-脱硫酸化肝素衍生聚合物纳米药物的制备
称取适量塞来昔布溶于二氯甲烷，称取适量槲皮素-脱硫酸化肝素溶于蒸馏水。塞来昔布与槲皮素-脱硫酸化肝素衍生聚合物纳米药物的质量比为1∶4。将上述两者混合，室温敞口搅拌过夜以挥去二氯甲烷。剩余液体于3000rpm离心10min以除去不溶性小分子，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得。
实施例11：载伊立替康的黄芩素-低分子量肝素衍生聚合物纳米药物的制备
称取适量伊立替康溶于n，n-二甲基甲酰胺，称取适量黄芩素-低分子量肝素衍生聚合物纳米药物溶于蒸馏水，室温快速搅拌30min后，将伊立替康的n，n-二甲基甲酰胺溶液逐滴滴入。伊立替康与黄芩素-低分子量肝素衍生聚合物纳米药物的质量比为1∶3。滴加速率为每分钟2～4滴。滴加完毕后，冰浴条件下探头超声30min，转入透析袋，透析24h，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得。
实施例12：装载表阿霉素、塞来昔布、酞菁锌的白杨素-低分子量肝素衍生聚合物纳米药物(固体状态)的放置稳定性
制备装载表阿霉素、塞来昔布、酞菁锌的白杨素-低分子量肝素衍生聚合物纳米药物，室温密闭放置，于0、20天分别取适量溶于水中使成浓度为1mg/ml的纳米药物溶液，测定衍生聚合物纳米药物溶液的粒径和多分散系数(pdi)，以此评价载药后的黄酮衍生聚合物纳米药物在固体状态下的放置稳定性。从表5可以看出，载药后的黄酮衍生聚合物纳米药物在室温下保存的稳定性良好。
表5载药后的新型黄酮衍生聚合物纳米药物(固体状态)的放置稳定性
实施例13：新型黄酮衍生聚合物纳米药物的取代度和载药量
取代度检测方法：采用紫外-可见分光光度法，对疏水性黄酮类小分子最大吸收波长处测定含共轭结构疏水小分子的含量，以公式(2)计算取代度。在此公式中，ms为含共轭结构的疏水小分子的含量(g)，由标准曲线计算得到；mt为称取的黄酮衍生聚合物纳米药物的质量(g)，ms为含共轭结构的疏水性黄酮类小分子的平均分子量，mhep为未分级肝素、低分子量肝素或脱硫酸化肝素的平均分子量。结果见表6。
载药量检测方法：采用高效液相色谱法，对含有共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物在其最大吸收波长处绘制峰面积对浓度的标准曲线。对载药后的黄酮衍生聚合物纳米药物在上述最大吸收波长处测得峰面积，再按照标准曲线计算浓度，并以公式(3)计算载药量。结果见表6。
表6新型黄酮-肝素衍生聚合物纳米药物的取代度和载药量
实施例14：新型黄酮衍生聚合物纳米药物的溶解度
考察溶解度的方法：分别称取1g新型肝素-黄酮衍生聚合物和装载了肿瘤治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物溶解在1ml水中。室温下每隔5min振荡30s，观察30min内是否能完全溶解。由表7可知，将疏水性黄酮类小分子共价连接到肝素类多糖之后，黄酮类小分子在水中的溶解性显著改善。同时，含有芳香共轭结构的疏水性肿瘤治疗药物溶解度也大大提高。
表7新型黄酮衍生聚合物纳米药物的溶解度
注：“-”几乎不溶，“+”可溶，“++”易溶。
实施例15：两种载药的新型黄酮衍生聚合物纳米药物组合后的稳定性
取两种载药的新型黄酮衍生聚合物纳米药物适量，混合后加水使总浓度为1mg/ml，即得到基于三级联用策略的新型黄酮衍生聚合物纳米药物溶液。室温放置48h，观察外观是否有可见异物或沉淀，借此评价载药后的新型黄酮衍生聚合物纳米药物混合后的放置稳定性。表8中可以看出，混合后48h，仍然未见可见异物或沉淀，表明各载药体系之间相容性较好，从药物调剂角度看无明显的配伍禁忌。
表8载药的新型黄酮衍生聚合物纳米药物组合后的稳定性
实施例16：mtt法检测载新型黄酮衍生聚合物纳米药物对hepg2细胞的抑制作用
取hepg2细胞以5×103个/孔接种于96孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入含不同浓度的肿瘤治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物培养基溶液200μl，37℃孵育48h后，加入40μl四甲基偶氮唑蓝(mtt，2.5mg/ml)，继续孵育4h；吸去各孔培养基，加入150μl二甲基亚砜，振摇10min使结晶充分溶解。于570nm下用酶标仪测定各个纳米药物的吸光度值(实验组od值)。并以相同方法测定空白组od值以及对照组od值，n＝6。对于使用光动力治疗药物的实验组，加入不同浓度的含有光动力治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物培养基溶液200μl后，采用10j/cm2激光照射10min，其余同上。按公式(4)计算受试细胞存活率，并以存活率结果计算新型黄酮衍生物纳米药物对hepg2细胞的半数抑制率ic50，ic50结果见表9。结果表明，装载肿瘤治疗药物的新型黄酮衍生聚合物纳米药物肿瘤有较强的肿瘤抑制作用；当两种新型黄酮衍生聚合物纳米药物联用时，肿瘤抑制作用更强。
表9新型黄酮衍生聚合物纳米药物对hepg2细胞的抑制活性