本发明属于兽用药物技术领域，涉及一种烯丙孕素制剂及其制备方法。
背景技术：
烯丙孕素是一种合成的三烯21碳甾体类孕激素，属于19-去甲基-睾丸酮，是一种口服的活性孕激素。与所有类固醇一样，烯丙孕素通过自身脂溶性可以渗透入靶细胞中然后与特定受体结合来发挥作用，以类似于天然孕酮的作用模式来抑制促性腺激素的释放。烯丙孕素通过抑制内源性促性腺激素lh和fsh在血液中的浓度，使增大的卵泡(>20～25毫米)退缩，进而阻断发情和排卵。在服药的后半阶段，当所有增大卵泡退缩后，紧跟着会出现一个fsh分泌的高峰，这将启动新一轮卵泡生长和成熟。在治疗后期会跟随者lh分泌的有规律的增加，促进卵泡的生长和成熟。这种内分泌作用可使受治疗的年幼母畜在停药后进入发情，因此烯丙孕素可用于家畜同期发情技术。同期发情可使家畜分娩时间集中，便于集中饲喂、集中断奶、全进全出、同期进入下一个繁殖周期，有效地提高家畜的繁殖率，减少病原的传播，实行严格的防疫制度和保证生物安全体系，利于规模化管理。
目前在我国兽医市场上尚无烯丙孕素制剂，欧洲ema和美国fda已批准了烯丙孕素用于诱导母马和母猪的同步发情。但烯丙孕素在酸性条件以及光照和热环境下稳定性较差，会受到一定的破坏，进而造成其生物利用度低、用药量加大、提高用药成本等，大大限制其在兽医临床的应用。
壳聚糖是通过甲壳素脱去部分或全部乙酰基而制得的一种天然聚阳离子多糖衍生物。壳聚糖具有无毒无害，可生物降解等优良特性，广泛用于生物技术、食品、药品、化妆品和医学等领域。但是壳聚糖的活性受本身脱乙酰度和分子量等诸多因素的影响，在大多数溶剂中溶解性差。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种稳定性好、生物利用度高的烯丙孕素制剂及其制备方法。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种烯丙孕素制剂，所述烯丙孕素制剂由包括如下质量百分比的原料制成，
烯丙孕素：0.3～0.5％，
苯甲醇：0.9～1.1％，
抗氧剂：0.012～0.016％，
改性多孔壳聚糖微球：3.0～6.5％
油剂：余量，
所述抗氧剂为叔丁基-4-羟基茴香醚(bha)和2,6-二叔丁基对甲酚(bht)的混合物，所述油剂为花生油、大豆油、蓖麻油或棕榈油中的任一种或多种。
本发明在烯丙孕素制剂中加入了改性多孔壳聚糖微球，其多孔结构和壳聚糖本身的性质决定了其具有较大的比表面积和较强的吸附能力，可将烯丙孕素吸附在其孔洞的表面，作为烯丙孕素的吸附载体，在胃酸及光热环境下对烯丙孕素起到保护作用，提高烯丙孕素制剂的稳定性和生物利用度，减少用药量。改性多孔壳聚糖微球作为烯丙孕素的承载者，改变了烯丙孕素进入体内的方式和在体内的分布、能够控制烯丙孕素的释放速率使其更好地发挥效力。而且，壳聚糖表面具有大量的碱性基团羟基和氨基，在胃酸环境中可首先与胃酸作用，可进一步避免胃酸对烯丙孕素的破坏。同时，壳聚糖还具有抑菌活性，且不影响有益菌的生长，可与苯甲醇协同作用，在烯丙孕素制剂中起抑菌作用。改性多孔壳聚糖微球的含量过少，起不到上述作用，含量过多会影响烯丙孕素在体内的释放与吸收。壳聚糖还具有良好的生物活性和生物可降解性，无毒且生物相容性良好，使用时不会对家畜造成损害。本发明通过对多孔壳聚糖微球进行改性有效提高了其在油剂中的溶解性，使得多孔壳聚糖微球能够充分发挥其作用。
苯甲醇具有较好的抑菌效果，并且能够促进烯丙孕素在油剂中的溶解和在改性多孔壳聚糖微球上的吸附，使原料中各组分达到最佳融合状态，从而使烯丙孕素制剂的药效达到最佳状态。bha和bht具有协同作用，起到抗氧化作用，有效延长烯丙孕素制剂的有效使用期。
作为优选，所述烯丙孕素制剂由如下质量百分比的原料制成，
烯丙孕素：0.4％，
苯甲醇：1.04％，
bha：0.007％，
bht：0.007％，
改性多孔壳聚糖微球：5.3％，
油剂：余量。
作为优选，所述改性多孔壳聚糖微球的表面通过接枝反应连接有脂肪链。
本发明通过在多孔壳聚糖微球表面接枝改性连接脂肪链，脂肪链与油剂相容性高，并且能够在壳聚糖微球之间形成隔离，脂肪链上的活性基团能够与烯丙孕素产生连接作用，从而增大了多孔壳聚糖微球在油剂中的溶解度和分散性，以及对烯丙孕素的吸附能力。
作为优选，所述脂肪链的碳数在3～10之间。
本发明将脂肪链的碳数控制在上述范围内，其原因在于脂肪链过长容易在壳聚糖微球表面造成空间位阻作用，影响对烯丙孕素的吸附作用。
作为优选，所述改性多孔壳聚糖微球的粒径为1～4μm。
改性多孔壳聚糖微球粒径过小，不利于烯丙孕素的吸附，且不利于在油剂中的分散，粒径过大，不利于烯丙孕素在生物体中的释放和吸收利用。
作为优选，所述改性多孔壳聚糖微球的孔隙率为52～70％，孔径大小为28～53nm。
合适的孔隙率和孔径大小有利于烯丙孕素的吸附和释放，孔径过大，不利于烯丙孕素在胃酸环境中的稳定性。
作为优选，所述油剂为大豆油。
本发明的另一目的在于提供一种烯丙孕素制剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
s1、取油剂总重量的25～30％冷却至50～70℃后，加入抗氧剂和苯甲醇，搅拌均匀，得到油溶液；
s2、将油溶液冷却至40℃以下后，加入烯丙孕素和改性多孔壳聚糖微球，搅拌均匀，得到初级药液；
s3、将初级药液加入到余下的油剂中，搅拌均匀，得到次级药液；
s4、将次级药液分别经50.0μm、30.0μm滤膜二级过滤，得到烯丙孕素制剂。
本发明整个制备过程中均维持在较低的温度条件下，能有效防止高温条件对原料各组分的破坏作用，并且降低了能耗和生产成本以及对加工设备的要求；尤其是在步骤s2中将搅拌温度降低到40℃以下，可有效防止在高温条件对烯丙孕素的破坏作用，提高烯丙孕素制剂的药效。
作为优选，所述步骤s1中，搅拌时的温度为50～70℃，搅拌速度为80～120rpm，搅拌时间为5～10min。
作为优选，所述步骤s2中，搅拌时的温度为30～40℃，搅拌速度为80～120rpm，搅拌时间为20～30min。
作为优选，所述步骤s3中，搅拌时的温度为20～30℃，搅拌速度为150～200rpm，搅拌时间为20～30min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的烯丙孕素制剂能有效调节牲畜内分泌，进行催情促孕，控制牲畜定期发情，以实现牲畜分组预产，达到全进全出的目的，从而极大提高牲畜场的生产效率和工业化管理水平；
(2)本发明的烯丙孕素制剂能够保持在胃酸和光热条件下的稳定性，可有效提高烯丙孕素制剂的保存期和烯丙孕素在生物体中的利用度；
(3)本发明的烯丙孕素制剂具有一定的缓释作用，可减少给药次数，从而提高劳动效率、降低人工和管理成本。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
下面通过具体实施例对本发明中的烯丙孕素制剂及其制备方法作进一步解释。
实施例1～4
实施例1～4中的烯丙孕素制剂由包括如下质量百分比的原料制成，
烯丙孕素：0.3～0.5％，
苯甲醇：0.9～1.1％，
抗氧剂：0.012～016％，
改性多孔壳聚糖微球：3.0～6.5％
油剂：余量，
抗氧剂为叔丁基-4-羟基茴香醚(bha)和2,6-二叔丁基对甲酚(bht)的混合物，油剂为花生油、大豆油、棕榈油或辛酸癸酸甘油酯中的任一种或多种。
改性多孔壳聚糖微球的表面通过接枝反应连接有脂肪链，脂肪链的碳数在3～10之间。改性多孔壳聚糖微球的粒径为1～4μm，孔隙率为52～70％，孔径大小为28～53nm。
实施例1～4中各原料及其质量百分比如表1所示，改性多孔壳聚糖微球的结构参数如表2所示。
表1：实施例1～4中各原料及其质量百分比
表2：改性多孔壳聚糖微球的结构参数
实施例5
(1)、按实施例2中的原料组分及质量百分比准备原料，将固体原料过60目筛后备用；
(2)、取油剂总重量的25％冷却至50℃后，加入抗氧剂和苯甲醇，在50℃温度、120rpm转速下搅拌5min，得到油溶液；
(3)、将油溶液冷却至30℃，加入烯丙孕素和改性多孔壳聚糖微球，在30℃温度、120rpm转速下搅拌30min，得到初级药液；
(4)、将初级药液加入到余下的油剂中，在25℃温度、150rpm转速下搅拌30min，得到次级药液；
(5)、将次级药液分别经50.0μm、30.0μm滤膜二级过滤，得到烯丙孕素制剂。
实施例6
(1)、按实施例2中的原料组分及质量百分比准备原料，将固体原料过60目筛后备用；
(2)、取油剂总重量的30％冷却至60℃后，加入抗氧剂和苯甲醇，在60℃温度、100rpm转速下搅拌10min，得到油溶液；
(3)、将油溶液冷却至35℃，加入烯丙孕素和改性多孔壳聚糖微球，在35℃温度、100rpm转速下搅拌25min，得到初级药液；
(4)、将初级药液加入到余下的油剂中，在30℃温度、180rpm转速下搅拌25min，得到次级药液；
(5)、将次级药液分别经50.0μm、30.0μm滤膜二级过滤，得到烯丙孕素制剂。
实施例7
(1)、按实施例2中的原料组分及质量百分比准备原料，将固体原料过60目筛后备用；
(2)、取油剂总重量的27％冷却至70℃后，加入抗氧剂和苯甲醇，在70℃温度、80rpm转速下搅拌8min，得到油溶液；
(3)、将油溶液冷却至40℃，加入烯丙孕素和改性多孔壳聚糖微球，在40℃温度、80rpm转速下搅拌20min，得到初级药液；
(4)、将初级药液加入到余下的油剂中，在20℃温度、200rpm转速下搅拌22min，得到次级药液；
(5)、将次级药液分别经50.0μm、30.0μm滤膜二级过滤，得到烯丙孕素制剂。
实施例8
(1)、按实施例2中的原料组分及质量百分比准备原料，将固体原料过60目筛后备用；
(2)、取油剂总重量的26％冷却至65℃后，加入抗氧剂和苯甲醇，在65℃温度、115rpm转速下搅拌7min，得到油溶液；
(3)、将油溶液冷却至35℃，加入烯丙孕素和改性多孔壳聚糖微球，在35℃温度、110rpm转速下搅拌25min，得到初级药液；
(4)、将初级药液加入到余下的油剂中，在28℃温度、180rpm转速下搅拌20min，得到次级药液；
(5)、将次级药液分别经50.0μm、30.0μm滤膜二级过滤，得到烯丙孕素制剂。
实施例9～11
分别按实施例1、3、4中的原料组分及质量百分比准备原料，按照实施例6的制备方法进行烯丙孕素制剂的制备。
对比例1
烯丙孕素制剂的制备过程中未添加改性多孔壳聚糖微球，其它与实施例6相同。
对比例2
市售的其它生产厂家的烯丙孕素制剂。
使用实施例、对比例1和对比例2中制得的烯丙孕素制剂进行稳定性实验和动物实验，实验方法和结果如下：
(一)稳定性实验
实验方法：将实施例6、对比例1和对比例2中的烯丙孕素制剂分别于高温(60℃)和强光照度(4500lx±500lx)条件下，进行影响因素试验考察，分别在第5天和第10天取样，测定含量和有关物质，结果见表3：
表3烯丙孕素影响因素试验结果
表3的实验结果显示添加了改性多孔壳聚糖微球的烯丙孕素制剂稳定性比不添加改性多孔壳聚糖微球以及其他市售产品要好。采用本发明中实施例5、6～11中制备的烯丙孕素制剂进行上述实验，得到的结果与表3中实施例6的结果接近。
(二)药代动力学实验
试验动物：8～9月龄后备母猪16头，均经过1～2次发情周期，体重范围95～105kg，
试验方法：后备母猪分为两组，每组8头，分别饲喂实施例6、对比例1中的烯丙孕素制剂。
禁食12h后，按20mg/日/头(相当于0.2mg/kgb.w.)的剂量进行喷料给药，连续给药18天。具体给药时先将一顿饲料分成两份，给其中一份喷料给药，监督猪完全吃干净后再给另外一份饲料，保证每头猪每次将饲料全部吃完，第一天和第18天给药后，分别于给药后20min、40min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h、5h、6h、8h、10h、12h、24h采集血样，其它采血点为每日给药前(上午8点)和下午2点，连续给药18天后，于第20天下午2点采集血样。
首次喷料给药后血样中各项参数：终末消除半衰期(t1/2)、达峰时间(tmax)、血药峰值浓度(cmax)、药时曲线下面积(auc0-t)和平均滞留时间(mrt)如表4所示，连续18日喷料给药后血样中各参数：平均稳态血药浓度(css)、波动程度、auc0-t和平均滞留时间(mrt)如表5所示。
表4：首次喷料给药后血样中各项参数
表5：连续18日喷料给药后血样中各参数
由表4和表5可知，与对比例1相比，本发明实施例6中制得的烯丙孕素在单次给药后的达峰时间(tmax)相近，而终末消除半衰期(t1/2)、平均滞留时间(mrt)及连续18日喷料给药后平均滞留时间(mrt)相对较长，说明本发明的烯丙孕素制剂在生物体内作用时间长，具有一定的缓释效果，同时药时曲线下面积(auc0-t)较高，说明生物利用度高。
(三)诱导母猪同期发情试验
试验动物：215日龄后备母猪，初始体重、遗传性相似，且经兽医检查，行为学、生理和食欲正常的健康后备母猪120头。所有试验动物根据生长期的要求均喂以标准混合饲料，不得随意提高或降低营养成分，按常规方法进行饲养管理，试验前进行必要的防疫注射和驱虫，试验期间执行严格的防疫消毒措施。
试验方法：
将母猪随机分为5组，分别为试验ⅰ组、试验ⅱ组、试验ⅲ组、对比例1组、对比例2组药物对照组和阴性对照组，每组20头，试验ⅰ组、试验ⅱ组、试验ⅲ组分别按照10mg、20mg、40mg的剂量饲喂实施例6中制得的烯丙孕素制剂，对比例1组按照20mg的剂量饲喂对比例1中制得的烯丙孕素制剂，对比例2组药物对照组按照20mg的剂量饲喂其他生产厂家的烯丙孕素制剂，阴性对照组饲喂5ml大豆油，连续饲喂18天。
通过公猪诱情方法检测母猪发情，记录发情情况并对发情母猪进行配种，在配种过后23天、28天b超鉴定妊娠情况。
表6：烯丙孕素饲喂后对后备母猪发情影响
由表6可知，本发明的烯丙孕素制剂具有明显的调节母猪同期发情的效果，试验组和对比例2组药物对照组之间差异不显著(p＞0.05)，在试验期间，试验组和对比例组与阴性对照组相比，发情配种率差异不显著(p＞0.05)。与对比例1组相比，本发明的烯丙孕素制剂在控制母猪发情的效果更好。
分析母猪最集中相邻两天、9天内母猪集中发情配种率和烯丙孕素停喂9天后发情配种比例，统计后备母猪发情的集中度，结果见表7.
表7：烯丙孕素停喂后不同时间母猪发情及配种情况统计
由表6和表7可知，本发明的烯丙孕素制剂具有明显的促进集中发情的效果，在合适的添加比例下，可将母猪发情控制在2～3天内，试验组、对比例组后备母猪最集中相邻两天发情比例与阴性对照组相比差异极显著(p＜0.01)；试验组母猪最集中9天内发情配种率与对比例组之间差异不显著，但试验组、对比例组与阴性对照组相比差异显著(p＜0.05)；停喂9天内，试验组、对比例组的发情配种率分别与阴性对照组相比，差异极显著(p＜0.01)。结果表明烯丙孕素制剂可使母猪同步发情，并且相邻2～3天内发情更集中。从剂量上分析，10mg、20mg、40mg的添加剂量均有较好的促进同步发情、同步妊娠的效果，但10mg的剂量在生产应用时易造成口服剂量不足，影响使用效果，40mg的剂量使用成本较高，因此20mg的使用剂量较为合适。
(四)经口急性毒性实验
实验一
实验动物：清洁级健康icr小鼠40只，体重20±2g，雌雄各半，由扬州大学提供。
试验方法：将小鼠分为第一组(20只、雌雄各半)和第二组(20只、雌雄各半)，第一组又分为五小组(每组4只、雌雄各半)，禁食12h后分别按照100、500、1000、2500、5000mg/kgb.w.(烯丙孕素制剂中烯丙孕素的纯含量)五个染毒剂量饲喂实施例6中的烯丙孕素制剂，均未引起死亡；再以5000mg/kgb.w.的染毒剂量对第二组小鼠进行饲喂，饲喂后连续观察14天。
实验二
实验动物：清洁级健康icr大鼠40只，体重200±20g，雌雄各半，由扬州大学提供。
试验方法：按照经口急性毒性实验一的方法进行，饲喂后连续观察14天。
经口急性毒性实验一和经口急性毒性实验二在观察期间，小鼠和大鼠临床表现正常，无明显神经症状，皮肤和被毛无异常，至观察期结束，均未发现中毒和死亡现象；实验结束后剖检存活小鼠，包括胃、十二指肠在内的内脏器官以及生殖器官均未发现明显眼观病变。结果表明，本发明的烯丙孕素制剂对小鼠的经口ld50大于5000mg/kgb.w.，急性毒性较低。
综上所述，本发明中的烯丙孕素制剂具有明显的促进家畜同期发情、同期妊娠的效果，不会对母畜造成应激反应，制剂制备过程中添加的改性多孔壳聚糖微球对烯丙孕素起到保护作用，能降低胃酸和光热条件下烯丙孕素的不稳定性，提高其在生物体内的利用度，并且具有一定的缓释效果，可减少给药次数和给药量。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。