白屈菜红碱联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及白屈菜红碱联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品。

背景技术：

近年来，随着获得性免疫缺陷综合征(aids)患者的增多，广谱抗菌药物的广泛应用以及器官移植技术和导管技术等医疗技术的开展，侵袭性真菌感染的发病率和病死率逐年上升，特别是曲霉属和念珠菌属引起的感染，患者的生存率分别不足30％和70％。念珠菌感染对临床的威胁虽然没有曲霉菌感染所造成的威胁大，但由于这类真菌容易出现药物外排增强与基因靶位(如erg11)的改变等，使得对唑类抗真菌药物敏感的念珠菌不断出现耐药性，这给临床抗真菌感染带来极大的挑战。数据表明，aids患者晚期感染真菌后，超过三分之一耐药，对唑类药物耐药率更是高达65％。其中念珠菌尤其是白色念珠菌(candidaalbicans，ca)，是呼吸系统、血流感染、消化系统、泌尿系统真菌感染的常见分离菌。根据美国院内感染控制组织的资料显示，ca是第4位引起院内血流感染的病原微生物，是死亡率最高的致病菌，死亡率可高达40％。

氟康唑(fluconazole，flc)作为安全、有效、价格低廉的抗真菌药物，对白色念珠菌有很好的疗效。但随着flc在临床上的广泛应用，使得白色念珠菌对唑类药物的耐药性不断增高，因此寻找新的抗真菌手段迫在眉睫。白屈菜红碱(chelerythrine,cht),又名白屈菜赤碱、白屈菜季铵碱，它是从紫堇科、罂粟科、毛莨科和芸香科等植物中分离的异喳琳类的苯并菲啶型生物碱，具有抗肿瘤、抗菌和抗炎等药理活性。目前μcn-01，nk109(cht类似物)已分别在美国和日本作为抗肿瘤药物进入试验阶段。cht有望作为制剂应用于临床，用于治疗肿瘤、细菌感染和炎症。cht的药理活性与其分子的结构特点有着密切的关系，有研究表明，cht在不同的溶液条件下，cht具有不同的结构形式，所以对病原菌的抗菌活性也发生改变。目前，在抗念珠菌联合用药研究方面，仅有文献报道，cht和益康唑联用对临床分离的ca有协同作用。然而，对于白屈菜红碱和氟康唑的联用是否具有协同抗念珠菌的作用，目前尚无研究报道，具有广阔的研究前景。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明的发明目的是为了克服目前真菌耐药以及氟康唑单独使用量较大的问题，提供一种白屈菜红碱联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用及其产品。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种白屈菜红碱联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。

优选：所述产品为药物。

优选：所述真菌为白色念珠菌。

优选：所述白屈菜红碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：白屈菜红碱＝1:1。

所述应用时白屈菜红碱的最低抑菌浓度为：0.25μg/ml。

所述应用时氟康唑的最低抑菌浓度为：0.25μg/ml。

一种抗耐药白色念珠菌的药物组合物，其特征是：该药物组合物是以白屈菜红碱和氟康唑为主要活性成分。

优选：在该药物组合物中，所述白屈菜红碱与氟康唑的有效浓度配比为氟康唑：白屈菜红碱＝1:1。

所述白屈菜红碱的最低浓度为：0.25μg/ml。

所述氟康唑的最低浓度为：0.25μg/ml

结果表明，大于等于0.25μg/ml的白屈菜红碱与大于等于0.25μg/ml的氟康唑联合应用具有协同抗耐药白色念珠菌作用。

一种抗真菌的制剂，由白屈菜红碱和氟康唑以及药学上可接受的辅料组成。在本发明提供的制剂中，药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料，为本领域技术人员认为可行的常规辅料均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：

(1)白屈菜红碱与氟康唑联合应用时，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。

试验中发现，cht与flc联合抗真菌作用时，对耐药白色念珠菌呈现强协同作用，0.25μg/ml的白屈菜红碱与0.25μg/ml的氟康唑联用可杀灭80％以上的耐药白色念珠菌，但对白色念珠菌的敏感株和非白色念珠菌来说无协同作用，这表明真菌耐药机制是十分复杂的，同时也说明不同药物的抗菌作用难以进行有效预期。

(2)白屈菜红碱的药理作用广泛，其对氟康唑抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低氟康唑的最低有效抑菌浓度，从大于512μg/ml降低至0.25μg/ml，降低抗真菌药物氟康唑的用药量，从而降低药物的不良反应的发生，克服临床上真菌耐药问题。

(3)氟康唑可明显增强白屈菜红碱抗白色念珠菌作用，并且降低了白屈菜红碱的最低有效浓度，减少了白屈菜红碱抗真菌药物的用药量。

附图说明

图1.白屈菜红碱与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌ca10作用结果；

图2.白屈菜红碱与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌ca16作用结果。

其中：x轴代表氟康唑的浓度，y轴代表白屈菜红碱的浓度，z轴代表的是各个药物组合下的δe值，高于或低于平面(δe＝0)的值分别表示协同或拮抗作用，平面周围的值表示无关作用,图右侧的色彩编码条中，越靠近上端说明协同作用越强。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

术语解释：

白屈菜红碱：是一种化学药品，具有抗菌、抑菌，清热解毒、抗菌消炎的作用；熔点195-205℃，完全溶解于乙醇，cas号为34316-15-9，结构式如下所示：

正如背景技术所介绍的，长期大剂量使用氟康唑可导致白色念珠菌的耐药性不断增高，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种白屈菜红碱联合氟康唑在制备抗耐药白色念珠菌产品中的应用。

抗菌药物联合在体外或动物体内可表现为“无关”、“相加”、“协同”和“拮抗”四种作用，对于不同类的药物联用，由于药物的作用机制和作用方式不同，很有可能会增加毒性或因诱导灭活酶的产生或竞争同一靶位而出现拮抗作用；而且，同一类药物不一定都具有相同的作用，如头孢菌素类，一代头孢主要抗革兰氏阳性菌，三、四代头孢菌素主要抗革兰氏阴性菌，并且只有部分的三代头孢品种与四代头孢才具有抗铜绿假单胞菌的作用，因此，对于抗菌药物的联用而言，其联合使用后的抗菌效果具有极大的不可预测性。

为克服白色念珠菌对氟康唑的耐药性，本发明经过大量的试验研究发现了白屈菜红碱和氟康唑联合给药在抗耐药白色念珠菌中的意外改进的效果。当白屈菜红碱单用时，白屈菜红碱抗耐药白色念珠菌ca10和ca16的最低抑菌浓度为：2μg/ml；而将白屈菜红碱与与氟康唑联用时，呈现出强烈协同抗耐药白色念珠菌的作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，并且联合应用时，白屈菜红碱的浓度较低。

两种药物联用的浓度会影响两者的相互作用，为了使得白屈菜红碱与氟康唑联合应用时具有一定的协同增效作用，在本发明优选的实施例中，所述白屈菜红碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比为：氟康唑：白屈菜红碱＝1:1。

其中，联合应用时，所选药物浓度为：大于等于0.25μg/ml白屈菜红碱与大于等于0.25μg/ml氟康唑。

在本发明其中的一个优选实施例中，还提供了一种抗耐药白色念珠菌的药物组合物，该药物组合物是以白屈菜红碱和氟康唑为主要活性成分。

其中，所述白屈菜红碱与氟康唑联合应用时的有效浓度配比为：氟康唑：白屈菜红碱＝1:1；所述应用时白屈菜红碱的最低浓度为：0.25μg/ml；所述应用时氟康唑的最低浓度为：0.25μg/ml。

在本发明又一个优选实施例中，还提供一种抗真菌的制剂，由白屈菜红碱和氟康唑以及药学上可接受的辅料组成。在本发明提供的制剂中，药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料(比如：崩解剂、润滑剂、黏合剂等；优选为甘油、丁二醇等中的一种或多种)，为本领域技术人员认为可行的常规辅料均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。

本发明采用白色念珠菌进行研究，利用棋盘肉汤微量稀释法，评价白屈菜红碱与氟康唑联用抗耐药白色念珠菌作用。具体内容如下：

cht与flc联合抗耐药ca作用：采用棋盘肉汤微量稀释法测定联合用药时最低有效浓度，以fici法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1白屈菜红碱联合氟康唑抗耐药白色念珠菌作用测定

1.材料

1.1药品与试剂

氟康唑(fluconazole,flc)，大连美仑生物技术有限公司；

白屈菜红碱(chtlerythrine,cht)，大连美仑生物技术有限公司；

科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；

ttc-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；

酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；

蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；

葡萄糖，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

pbs磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

氢氧化钠，国营山东单县有机化工厂，批号940420；

磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。

rpmi1640原料药粉，美国gibco公司；

3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；

甲萘醌(menadione)，美国sigma公司；

xtt(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；

乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；

丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；

xtt-甲萘醌溶液的配制：取xtt粉末0.0500g，溶解于100ml已高压灭菌的林格氏液配成0.5mg/ml的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭；加入10μl的10mmol/l的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5ml丙酮)，使其终浓度为1μmol/l，摇匀，4℃避光保存。

药物溶液：氟康唑用无菌蒸馏水溶解，配成2560μg/ml的储备液，过滤分装；白屈菜红碱用无水乙醇溶解，配成2560μg/ml的储备液，过滤分装。所有药液于-20℃冰箱保存，备用。

pbs缓冲液：称取12gpbs磷酸盐缓冲剂至1l容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸馏水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保存。

酵母浸膏－蛋白胨－葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500ml锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌30min，冷却后4℃冰箱保存备用。

rpmi1640液体培养液：取rpmi1640(含l-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及mops粉6.906g，加蒸馏水至约为200ml，混合均匀后在22℃用1mol/l的naoh溶液调ph约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。

1.2仪器

1.3实验菌株

质控菌株：白色念珠菌atcc10231，山东大学药理教研室惠赠；

实验菌株：千佛山医院临床分离的白色念珠菌；

菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定。

菌液制备：-20℃下保存的菌株室温下解冻，接种到ttc-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，pbs配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时菌浓度约为1×10⁶cfu/ml，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。

2.内容与方法

2.1白屈菜红碱与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用测定

根据clsim27-a3方案的棋盘法，以rpmi-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选cht与flc联合应用的浓度范围,即cht终浓度为2～0.031μg/ml，flc的终浓度为16～0.031μg/ml。按浓度从低到高的顺序分别吸取flc药液50μl，分别加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取cht药液50μl，分别加入各96孔平板的第g～a行，除第12列外各孔再分别加100μl菌液，其余不足200μl的孔用rpmi-1640培养液补足。其中h1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含rpmi-1640液体培养基。根据clsim27-a3方案的要求，将加药的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，分别用xtt负载2h后以酶标仪测定od并记录结果。所有实验重复三次。

2.2评价方法与结果判定

2.2.1白屈菜红碱联合氟康唑抗耐药念珠菌

loeweadditivity理论

loeweadditivity(la)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractionalinhibitoryconcentrationindex,fici)，表述如下：

σfic＝fica+ficb＝ca/mica+cb/micb

mica和micb分别是药物a和b单用时的最小抑菌浓度，ca与cb为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。fici>4为拮抗作用，fici在0.5与4之间为相加或无关作用，fici≤0.5定义为协同作用。

3.结果

注：flc，氟康唑；cht，白屈菜红碱

3.1白屈菜红碱与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用结果

3.1.1白屈菜红碱与氟康唑联合的最低有效抑菌浓度

各孔中真菌生长百分数的计算方法为：

真菌生长百分数＝(各孔od值-空白对照孔od值)/生长对照孔od值

按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点。

cht与flc联合抗真菌作用时，对耐药白色念珠菌呈现强协同作用，但对白色念珠菌的敏感株和非白色念珠菌来说无协同作用。现把耐药株ca10和ca16在加药96孔板中的生长百分数实验结果列表如下(表1和2)所示。

表1.用棋盘表示cht与flc的联合用药抗耐药白色念珠菌ca10生长百分率(以fici法换算的药物最佳作用组合用斜体标出)。

表2.用棋盘表示cht与flc的联合用药抗耐药白色念珠菌ca16生长百分率(以fici法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。

3.1.2fici模型评价cht与flc联用的协同作用

fici模型的评价指标为fici值，fici≤0.5则定义为协同作用。由表3可以看出，各组合的fici值均小于0.5，表现为较强的协同作用。

表3.以fici模型评价白屈菜红碱和氟康唑联合用药抗耐药白色念珠菌作用

注解：flc：氟康唑；cht：白屈菜红碱；mic：最低抑菌浓度；mica：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；ca：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；micb：药物单用时白屈菜红碱的最低抑菌浓度；cb：药物联用时白屈菜红碱的最低抑菌浓度；fici：分数抑菌浓度指数。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。