固载天然抗菌剂的方法与流程

本发明涉及一种固载天然抗菌剂的方法，属于黏土矿物功能材料领域。

背景技术：

近年来，抗生素的滥用和抗生素污染成为热点话题。

长期使用抗生素会降低肠道微生物区系的多样性，破坏优势菌群区系，引起动物免疫机能下降，死亡率增多，并造成耐药细菌增多（mbio,2016,7:e02039-15）。抗生素在动物中的滥用和抗药性已经成了世界范围内公共卫生领域的重大问题之一，对人类健康构成潜在的威胁。

遏制抗生素污染迫在眉睫，探索可行的抗生素替代产品，为无抗养殖、绿色养殖、健康养殖提供可行的途径和技术支撑成为目前养殖行业急需解决的关键共性问题。相关研究表明，天然抗菌剂有望在动物安全养殖方面发挥作用，但是目前并没有成熟的应用技术，特别是兼具解决饲料存储和使用时均发挥效应的抗菌产品（cn00807423.2;微生物学通报,2016,43:1339-1344）。

凹凸棒石是一种天然纳米材料，具有大的比表面积，同时具有一定的孔道结构，其棒晶可以作为天然抗菌剂的有效载体。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种固载天然抗菌剂的方法，所得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂具有较高的热稳定性和抗菌持久性，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出强的抗菌活性，可以有效替代动物养殖过程中长期使用的抗生素。

本发明的原理是：以凹凸棒石基复合纳米结构载体材料为固载模板剂，利用复合基材的孔道结构和表面作用固载具有羟基或羰基结构的天然抗菌剂，同时利用无机纳米材料的热稳定性，提高复合基材的热稳定性，进而制备一种凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

本发明的技术解决方案是：先制备凹凸棒石基复合纳米结构载体材料，然后在机械搅拌、超声条件下，依次将载体材料和天然抗菌剂分散到一定比例的乙醇水溶液中，接着在恒温下震荡，离心、烘干，得凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂，其具体步骤如下：

（1）凹凸棒石基复合纳米结构载体材料的制备：采用高速搅拌配制质量分数2~8%的凹凸棒石悬浮液，向悬浮液中加入其质量10~20%的锌盐，搅拌30~60min，静置3~6h；接着在机械搅拌下向体系滴加质量分数2.5~10%的氢氧化钠溶液直至溶液中的锌离子完全沉积，离心、烘干，得凹凸棒石基复合纳米结构载体材料；

（2）复合基材固载天然抗菌剂：在250~450w超声辅助下，向乙醇水溶液中分散其质量分数5~20%的载体材料和其质量分数10~40%的天然抗菌剂；接着在37℃的恒温震荡箱中震荡18~24h，混合液经离心、45~60℃烘干、研磨、过200目筛子、包装，得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

其中，所述锌盐为硝酸锌、氯化锌、硫酸锌和醋酸锌水合物中的一种。

其中，所述凹凸棒石基复合纳米结构载体材料是在一维针状结构的天然纳米材料凹凸棒石棒晶表面沉积具有抗菌活性的zno纳米颗粒，复合基材在水溶液或是乙醇溶液中具有高度的分散性。

其中，所述的天然抗菌剂为香芹酚、百里香酚、牛至油、肉桂醛和柠檬醛中的一种或一种以上的混合物，加入量为复合体系质量分数的10~40%。

其中，所述的乙醇水溶液中的醇水比例为5:5~9:1。

本发明具有以下优点：1、在凹凸棒石棒晶表面沉积具有强抗菌活性的zno和天然抗菌剂，利用zno和天然抗菌剂分别对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌强的敏感性，进而制备一种安全、高效、广谱和生物相容性好的纳米复合抗菌剂，主要应用于动物饲料添加剂中，解决动物养殖过程中对抗生素的依赖性；2、本发明的工艺路径经济可行，来源广泛、廉价易得；3、所述的凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂具有较高的热稳定性和抗菌持久性；4、所述凹凸棒石基复合纳米结构载体材料是在一维针状结构的天然纳米材料凹凸棒石表面沉积具有抗菌活性的zno纳米颗粒，复合基材在水溶液或乙醇溶液中具有高度的分散性；5、本发明以天然纳米材料凹凸棒石为载体，通过充分利用复合载体的孔道结构和表面作用固载天然抗菌剂，进而制备一种复合抗菌剂，解决天然抗菌剂作用时间短和无机抗菌剂作用效果低的问题，同时解决饲料存储过程中的霉变问题，为动物安全、健康养殖提供技术支撑。

附图说明

图1为凹凸棒石基复合纳米结构载体材料未煅烧样品的场发射扫描电子显微镜照片。

图2为凹凸棒石基复合纳米结构载体材料的场发射扫描电子显微镜照片。

图3为实施例所得复合抗菌剂傅里叶变换红外谱图。

图4为复合抗菌剂热重曲线。

图5为实施例3凹凸棒石基复合纳米结构固载香芹酚对大肠杆菌（a）空白组，（b）阳性组，（c）2.5mg/ml，（d）1mg/ml，（e）0.5mg/ml，（f）0.25mg/ml和金黄色葡萄球菌（g）空白组，（h）阳性组，（i）5mg/ml，（j）2.5mg/ml，（k）1mg/ml，（l）0.5mg/ml的最小抑菌浓度测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：采用高速搅拌配制质量分数2%的凹凸棒石悬浮液，向分散液中加入其质量10%的硝酸锌，搅拌30min，静置6h；接着在机械搅拌下向体系滴加质量分数2.5%的氢氧化钠溶液直至溶液中的锌离子完全沉积，离心、烘干、煅烧，得凹凸棒石基复合纳米结构载体材料；在300w超声辅助下，向乙醇水溶液中分散其质量分数20%的载体材料和其质量分数10%的柠檬醛，醇水比5:5；再在37℃的恒温震荡箱中震荡24h，混合液经离心、60℃烘干、研磨、过200目筛子、包装，得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

实施例2：采用高速搅拌配制质量分数4%的凹凸棒石悬浮液，向悬浮液中加入其质量15%的氯化锌，搅拌50min，静置3h；接着在机械搅拌下向体系滴加质量分数5%的氢氧化钠溶液直至溶液中的锌离子完全沉积，离心、烘干，得凹凸棒石基复合纳米结构载体材料；在400w超声辅助下，向乙醇水溶液中分散其质量分数10%的载体材料和其质量分数20%的百里香酚，醇水比6:4；再在37℃的恒温震荡箱中震荡18h，混合液经离心、45℃烘干、研磨、过200目筛子、包装，得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

实施例3：采用高速搅拌配制质量分数6%的凹凸棒石悬浮液，向悬浮液中加入其质量20%的硫酸锌，搅拌40min，静置5h；接着在机械搅拌下向体系滴加质量分数8%的氢氧化钠溶液直至溶液中的锌离子完全沉积，离心、烘干，得凹凸棒石基复合纳米结构载体材料；在450w超声辅助下，向乙醇水溶液中分散其质量分数20%的载体材料和其质量分数40%的香芹酚，醇水比7:3；再在37℃的恒温震荡箱中震荡18h，混合液经离心、45℃烘干、研磨、过200目筛子、包装，得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

实施例4：采用高速搅拌配制质量分数8%的凹凸棒石悬浮液，向悬浮液中加入其质量10%的醋酸锌，搅拌50min，静置4h；接着在机械搅拌下向体系滴加质量分数10%的氢氧化钠溶液直至溶液中的锌离子完全沉积，离心、烘干，得凹凸棒石基复合纳米结构载体材料；在250w超声辅助下，向乙醇水溶液中分散其质量分数20%的载体材料和其质量分数30%的牛至油，醇水比9:1；再在37℃的恒温震荡箱中震荡20h，混合液经离心、60℃烘干、研磨、过200目筛子、包装，得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

实施例5：采用高速搅拌配制质量分数4%的凹凸棒石分散液，向分散液中加入其质量20%的硝酸锌，搅拌60min，静置6h；接着在机械搅拌下向体系滴加质量分数10%的氢氧化钠溶液直至溶液中的锌离子完全沉积，离心、烘干，得凹凸棒石基复合纳米结构载体材料；在350w超声辅助下，向乙醇水溶液中分散其质量分数15%的载体材料和其质量分数25%的肉桂醛，醇水比8:2；再在37℃的恒温震荡箱中震荡24h，混合液经离心、45℃烘干、研磨、过200目筛子、包装，得凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂。

凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂的抗菌性能评价采用最小抑菌浓度法，具体测试步骤如下：

（1）细菌菌液的制备：取-20℃保存的大肠杆菌k88或金黄色葡萄球菌解冻后接种到培养基中，在37℃振荡箱中培养12h，震荡频率160r/min，按照1:100的菌液与新鲜培养基体积比，再次接种到相应新鲜培养基中，培养3h进入对数期，备用；

（2）含抗菌材料培养基的配制：将适量的待测样与对应培养基混合均匀后经高压灭菌；待培养基冷却至50~60℃，加入灭菌平皿中，制备成相应浓度的待测样培养基，待冷却后备用；每个样品设3个重复；

（3）接种菌液：移取1μl菌液（含菌量10⁸cfu/ml）点种于含抗菌材料的平皿中，每个平皿分别在3个不同点点种；

（4）平皿培养及观察：将接种后的平皿置于37℃恒温培养箱中，倒置培养24h；培养结束后，若菌落生长，则在平皿中会形成直径约为5~8mm（每个点菌量为10⁵cfu）菌液圈；若菌落被抑制生长，则无菌落圈出现；单一菌落生长可忽略不计。

阳性对照组：以同样方法在不含抗菌材料的琼脂平皿中点种作为阳性对照。

空白对照组：不含抗菌材料的琼脂平皿不点种作为空白对照。

测试结果表明：凹凸棒石基复合纳米结构固载天然抗菌剂对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）的最小抑菌浓度均分别达到0.5mg/ml和1.0mg/ml。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明的说明书而对本发明的技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。