一种LNA小分子在制备BCAR4活性抑制剂中的应用的制作方法

一、技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及一种lna小分子在三阴性乳腺癌hippo-yap通路中针对长链非编码rna---bcar4靶点的小分子协同抑制剂的应用。

二、

背景技术：

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，主要由乳腺导管上皮出现恶性转化而引起，临床主要表现为乳腺肿痛、出现肿块、腋窝下淋巴结肿大等症状。据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，全世界每年约有140万女性患乳腺癌，其中约46万例患者因乳腺癌死亡。在我国，每年约有16.9万女性患乳腺癌，占全球总发病数的12.25％，仅次于美国(18.2万)，位列全球第二，每年约4.5万乳腺癌患者死亡。因此，寻找乳腺癌的特异分子标记，开发乳腺癌的早期诊断试剂盒和临床药物治疗的分子靶点，对乳腺癌的早发现、早诊断，个体化精准治疗具有十分重要的意义。

长链非编码rna(lncrna)指转录本长度大于200nt(nucleotide)且不翻译蛋白质的功能性rna分子。lncrna能够影响特定基因的表达，调节蛋白结合因子的活性，引导染色质修饰复合物的定位，并能够通过转录后加工产生大量具有5’帽结构的小rna，调节dna和特定染色质的修饰活性。越来越多的研究表明lncrna与乳腺癌、膀胱癌、肝癌和前列腺癌等多种癌症的发生和发展密切相关。

bcar4(breastcanceranti-estrogenresistance4)是一种在三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer,ntbc)中发现的表达上调的lncrna。bcar4参与了hippo-yap通路依赖的糖酵解过程，其表达水平与乳腺癌患者的yap活性正相关，低水平的bcar4可降低患者乳腺癌的复发，延长患者的存活期。bcar4不仅是hippo-yap通路依赖的糖代谢下游的重要分子，而且bcar4参与的yap-bcar4-糖代谢信号轴是乳腺癌临床治疗的一个作用靶点。因此，利用lna(lockednucleicacid)小分子封闭bcar4，模拟其低表达时的活性，将该lna小分子作为一种hippo-yap通路的协同抑制剂，为高效利用bcar4作用靶点提供了一个全新的思路。该发明不仅丰富了现有长链非编码rna的知识，拓宽了小分子抑制剂的种类，而且为有效利用长链非编码rna分子作用靶点，减轻患者痛苦带来福音，具有广阔的应用前景。

三、

技术实现要素：

本发明的内容是提供一种lna小分子在制备bcar4活性抑制剂中的应用，bcar4参与了hippo-yap通路依赖的糖酵解过程，所述lna小分子结合的靶点是长链非编码rna---bcar4，抑制其参与的yap依赖性糖酵解，进而抑制细胞增殖和肿瘤发生。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种lna小分子在制备bcar4活性抑制剂中的应用，所述的lna小分子是长链非编码rna---bcar4分子的反义封闭核酸，该lna小分子的核苷酸序列为：taggctcttgattgga。bcar4是乳腺癌临床治疗的一个作用靶点，利用lna小分子结合bcar4，封闭其活性，进而抑制肿瘤细胞能量代谢过程中相关代谢酶的活性，最终阻滞肿瘤细胞的增殖。

所述抑制剂是利用长链非编码rna的bcar4分子的反义封闭核酸lna抑制糖代谢酶hk2和糖代谢酶pfkfb3的活性。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：利用lna小分子封闭bcar4的活性可以直接影响肿瘤细胞的糖代谢，进而抑制肿瘤细胞的活性，起到杀伤肿瘤的作用，克服了传统治疗方法中手术治疗给患者造成的生理伤害，没有化疗的副作用，且不受雌激素受体、孕激素受体和人表皮因子受体2缺失的影响，具有良好的应用前景。

四、附图说明

图1为yap分子调节bcar4活性的结果；

图2为转染了ev空质粒和bcar4过表达质粒的细胞基因表达倍数变化(a)和葡萄糖摄取量(b)；

图3为抑制bcar4活性造成肿瘤增殖阻滞的结果；

图4为bcar4的表达水平和乳腺癌患者临床预后相关性的结果。

五、具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、bcar4是yap分子的直接靶分子

人乳腺上皮细胞mcf-10a购自美国标准细胞培养中心(atcc)，含10％fbs(bovogen)dmem/f12培养基(gibco)，37℃，5％co2培养箱培养，mycoalert试剂盒(lonza)检测细胞无支原体污染，无交叉污染，利用dharmafect4(thermoscientific)，按照使用说明书进行质粒转染，转染的质粒包括yap表达质粒、yap活性维持突变质粒(yap-5sa)和yap活性缺失的突变质粒(yap-s94a)。

利用gfp质粒(clontech)作为空对照(ev)。转染48h后收集细胞，依照trizol试剂盒(ambion)说明提取rna，采用iscript^tmgdnaclearcdnasynthesiskit试剂盒(bio-rad)逆转录为cdna，以此cdna为模板，itaq^tmuniversalsybrgreensupermix(bio-rad)进行荧光定量pcr(条件见表1)，分析yap、yap-5sa和yap-s94a质粒转染后bcar4的表达变化。荧光定量pcr的引物序列为：f：5’-gtcgtcctgcctcacagtaa-3’；r：5’-ggagagactgggggcaaatg-3’。荧光定量pcr的条件为：94℃预变性2min，94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环，然后计算熔解曲线。

表1：实时荧光定量pcr体系(10μl)

结果见图1，gfp质粒转染诱导的对照组bcar4表达水平为1±0.05，yap质粒转染组诱导的bcar4表达水平为3.79±0.14，二者比较差异显著(p<0.01)，表明有yap的活性可以诱导bcar4基因的上调表达。利用yap的突变质粒转染时，yap-s94a转染组诱导的bcar4表达水平为1.25±0.18，而yap-5sa转染组诱导的bcar4表达水平为6.77±0.21，差异显著(p<0.01)。进一步证明bcar4基因的上调表达有赖于yap分子的活性。综上可以证明bcar4的活性受到yap的直接调控，bcar4是yap基因的下游调控靶标。

实施例2、bcar4通过调控hk2和pfkfb3的表达参与调控糖酵解效应

人乳腺癌细胞系mda-mb-231购自美国细胞培养中心(atcc)，10％fbs(bovogen)的dmem培养液(gibco)于37℃、5％co2培养箱培养。mycoalert试剂盒(lonza)检测细胞无支原体污染，无交叉污染，利用dharmafect4(thermoscientific)，按照使用说明书转染bcar4过表达质粒，利用ev空质粒作为对照。转染48h后收集细胞，依照trizol试剂盒(ambion)说明提取rna，采用iscript^tmgdnaclearcdnasynthesiskit试剂盒(bio-rad)逆转录为cdna，以此cdna为模板，itaq^tmuniversalsybrgreensupermix(bio-rad)进行荧光定量pcr(体系同实施例1)，比较bcar4质粒转染后糖代谢相关基因，如aldoa、eno2、glut1、hk2、hk3、pdk2和pfkfb3等的表达变化。引物序列为：aldoa(f：5’-ccaatatccagcactgacccc-3’，r：5’-ttgtctaccttgatgcccac-3’)；eno2(f：5’-aggacaaatacggcaagg-3’，r：5’-ccagtgatgtatcgggaag-3’)；glut1(f：5’-gcttcctgctcatcaaccg-3’，r：5’-agatgctcgtggagtaatagaa-3’)；hk2(f：5’-gagccaccactcaccctact-3’，r：5’-ccaggcattcggcaatgtg-3’)；hk3(f：5’-accaccttcgaccataccct-3’，r：5’-cgtgctgcacaagctcaac-3’)；pdk2(f：5’-ttcccgaccgagtgctga-3’，r：5’-tcgccgtaggtgtccttgtac-3’)；pfkfb3(f：5’-gatgcccttcaggaaagcct-3’，r：5’-gaacacttttgtggggacgc-3’)。

分别转染了ev空质粒和bcar4过表达质粒的细胞在60mm培养皿中正常培养24h，换含10％fbs无糖dmem培养液继续培养18h，然后加入50μm2-nbdg(invitrogen)处理细胞1h，预冷pbs清洗两次，流式仪分选检测，分析葡萄糖摄取能力的变化。

结果见图2，bcar4过表达后仅有hk2上调了4.26±0.08倍左右，pfkfb3上调了4.05±0.18倍左右，而同时检测的其他糖酵解相关基因的表达仅在1倍左右，没有显著变化，而且bcar4过表达组的葡萄糖摄取能力由ev空对照组的44.67±0.85％升高到59.83±1.72％，差异显著(p<0.01)。表明bcar4可以通过上调hk2和pfkfb3基因的表达水平，进而调控糖酵解效应。

实施例3、抑制bcar4的表达可以抑制肿瘤的增殖过程

人乳腺癌细胞系mda-mb-231购自美国细胞培养中心(atcc)，10％fbs(bovogen)的dmem培养液(gibco)于37℃、5％co2培养箱培养至对数生长期后收集细胞。将细胞悬浮在pbs和matrigel混合液中(pbs与matrigel(基底膜基质)体积比1:1)中，皮下注射(10⁶细胞/只)到30只6周龄的balb/c雌性裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)体内，将注射后的裸鼠随机分为3组，10只/组，分别命名为空质粒对照组、随机lna注射组和bcar4lna注射组，spf级别环境饲养。10天以后，空质粒对照组仅注射5mg/kg空质粒，随机lna注射组注射yap-5sa质粒5mg/kg+25mg/kg随机lna(aacacgtctatacgc)，bcar4lna注射组注射yap-5sa质粒5mg/kg+25mg/kgbcar4lna(核苷酸序列taggctcttgattgga)，每两天尾静脉注射一次，共注射3次，由最后一次注射开始，每星期记录各组肿瘤体积的大小，连续观察3个星期后，处死裸鼠，摘除肿瘤、称重，绘制肿瘤生长曲线。

结果见图3，在第5周末，空质粒注射组的肿瘤体积为203±9.2mm³，bcar4lna注射组的肿瘤体积为196±8.9mm³，随机lna注射组的肿瘤体积为785±21.6mm³。表明尽管yap-5sa质粒诱导bcar4的表达可促进肿瘤的增殖，但bcar4lna核酸却可以封闭bcar4的活性，进而抑制bcar4诱导的肿瘤增殖，而随机lna不能封闭bcar4的活性，维持的bcar4活性促使了肿瘤细胞的持续增殖。

实施例4、bcar4的表达水平和乳腺癌患者的临床预后相关

收集南京医科大学附属宜兴市人民医院教学医院和美国杜克大学的乳腺癌临床样本171例，样品收集得到患者的知情同意。其中宜兴市人民医院的样本20例，患者预计存活期9-12年，杜克大学的样本151例，患者预计存活期10-23年。利用这些数据进行kaplan-meier生存分析，结果表明肿瘤细胞中bcar4表达较高患者的肿瘤无复发生存率仅为52.57±4.62％，而bcar4表达较低患者的肿瘤无复发生存率为75.39±2.86％，差异显著(p<0.05)，表明较低bcar4的表达水平有益于患者的预后生存(图4)。

本发明利用lna小分子结合bcar4，封闭其活性，通过降低糖代谢相关基因的表达水平，调控yap依赖的糖代谢通路，影响细胞的能量供给，最终抑制肿瘤细胞增殖和迁移。本发明为有效利用药物作用靶点提供了新的思路，具有广阔的应用前景。应当注意的是，以上实验列举的仅仅是本发明的若干具体实例，显然，本发明还有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种lna小分子在制备bcar4活性抑制剂中的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>16

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>1

taggctcttgattgga16

<210>2

<211>14

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>2

aacagtctatacgc14