用于鼻黏膜的纳米级乳液免疫载剂及其制备方法与流程
本发明关于一种免疫载剂及其制备方法，尤其是指一种纳米级乳液免疫载剂及其制备方法，伴随抗原并经由鼻黏膜给予之后，能够增强该抗原的免疫效价。
背景技术：
乳剂是一种于药物剂型开发中相当广泛使用的分散统(dispersedsystem)类型，其目的是为了将不易溶解于水的固体药物或与水不互溶的液体药物能以细小液滴的形式分散于分散媒(medium)之中，以利进行药物的递送。乳剂主要是由内相(internalphase)及外相或连续相(externalorcontinuousphase)所组成，且依据不同的内外相组成，而分类成不同的乳剂类型，包含水相溶液做为内相而油相溶液做为连续项的油包水(w/o)乳剂型、油相溶液做为内相而水相溶液做为连续项的水包油(o/w)乳剂型以及油相溶液包覆水相溶液后做为内相而水相溶液做为连续项的水包油包水(w/o/w)乳剂型。乳剂的给药途径相当多元，依据不同的材料及乳剂型选用，可广泛应用于多种体外使用及体内使用的使用方法，包含皮下或肌肉使用的针剂、口服使用的乳剂、涂布于皮肤之上，或用于黏膜给予的外用型乳剂。其中，用于黏膜给予的乳剂更是近年来乳剂开发的主要课题。
鼻腔与口腔具有大面积的黏膜组织，分布有相当密集的微血管，相较于人体其他给药途径具有药物难以穿透的生物屏障，通过黏膜组织密集分布的微血管进行给药不仅可快速的吸收进人体血液统加快药物给药后的起效时间，亦能避免药物受到胃肠道的酵素降解作用或是药物在肝门静脉统通过肠黏膜和肝脏时被代谢失活的影响，提高药物的生物利用度，另一方面，由于黏膜组织有相当密集的微血管，因此它是生物体内免疫统反应发生最多的部分，也是发生局部特异性免疫反应的主要部位，因此黏膜免疫在生物体的免疫系统中具有相当重要地位，是生物体抵抗病原体人侵的第一道屏障，因此，越来越多的免疫制剂，即是以黏膜组织做为主要的给予标的。
近年来，医药组成物经由黏膜组织进行给药的发展日益渐进，一般而言，抗原对黏膜免疫统有效的刺激是疫苗产生有效免疫的必要条件，然而，要对黏膜免疫统进行有效刺激仍需要合适的黏膜免疫相关载体或佐剂，目前，已发现了数种具有黏膜免疫载体和佐剂活性的物质，例如说，使用离子型乳化剂所制备而成的小粒径的乳剂即是一种很有发展潜力的非病毒基因载体，其能和脱氧核醣核酸(dna)、抗原、抗体、蛋白质或其他小分子，通过溶液混合的方式组装形成粒径同样微小的复合物，这种小粒径的复合物更容易通过细胞膜被细胞摄取，若加上其带有的电荷特性，能与带有负电荷的细胞膜相互吸引，使复合物更容易靠近细胞膜而被细胞摄取，并提供充足的药物稳定性使成分在到达靶组织之前避免在体内遭受破坏。
而在乳剂应用于免疫载剂的用途时，需面临到的一个问题是，乳剂当中用以平衡油水二相的乳化剂，是否能被人体所代谢吸收且不会对人体造成危害。依现有制备技术所制备而成的免疫载剂，其多数都使用了离子型的乳化剂，其不仅会增加人体的代谢负担，另一方面，抗原中的膜糖蛋白如长期与离子型乳化剂接触，可能导致其发生变性作用，或可能导致溶血现象。
另一方面，目前在微小粒径等级的非离子型乳剂制备上遭遇到相当程度的瓶颈。由于其亲水基团的亲水性较弱，需要通过足够数量的亲水基才能使整个分子具有水溶性；此外，由于非离子型的乳化剂于溶液统不会离子化，因此在分散统中的亲脂性基团或亲水性基团大多带有电荷的环境下，无法有效提供电荷相斥的效应以增强分散相液滴的排斥力，或是无法于分散相外围形成吸附层，导致液滴之间的排斥力较一般离子型乳化剂来得低，容易有分散效果不彰的情况，其稳定溶液统的能力与一般离子型的乳化剂相比较为不足。在现阶段进行微小粒径等级乳剂的制备主要仍以水性液体及油性液体进行混合后进行均质化为主的情况下，通过上述制备方法所获得的乳剂，其粒径等级约为微米等级至次微米等级，除了无法提供更为微小的微粒以外，整体分散统的安定性在此一制备方法下亦较为不足。
因此，如何设计一种纳米级乳液免疫载剂及其制备方法，使该纳米级乳液能有效率地递送至鼻黏膜内诱发免疫反应，且不会增加人体的代谢负担，同时达到促进免疫效应及药物输送效率的目的，即成为相关领域中亟需解决的课题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种纳米级乳液免疫载剂及其制备方法。
为了达到上述的目的，本发明提供了一种纳米级乳液免疫载剂，伴随抗原并经由鼻黏膜给予之后，能够增强该抗原的免疫效价，由一含有h2o分子的连续水相、一含有油脂的油相物质及一用于稳定连续水相和油相界面且由乳化剂混合物所组成的乳化统，其中，该乳化统不含离子型乳化剂，且该乳液的粒径大小介于20纳米至200纳米之间。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该纳米级乳液免疫载剂的组成成分不含免疫刺激物质，包含类铎受体(tlr)激动剂或短链抗菌胜肽，如cpg的寡脱氧核苷酸(tlr-9)、宿主防御肽(tlr-4)、皂苷(tlr-2、tlr-4)、单磷酰脂质a(tlr-4)、鞭毛蛋白(tlr-5)。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该乳化统不含阳离子型乳化剂，所述该阳离子型乳化剂包含：卤化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumhalides)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloride)、卤化十六烷基三甲基(cetyltrimethylammoniumhalides)、卤化十六烷基二甲基乙铵(cetyldimethylethylammoniumhalides)、卤化十六烷基二甲基苄基氯化铵(cetyldimethylbenzylammoniumhalides)、卤化十六烷基三丁基(cetyltributylphosphoniumhalides)、卤化十二烷基三甲铵(dodecyltrimethylammoniumhalides)或十四烷基三甲基卤化铵(tetradecyltrimethylammoniumhalides)。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该连续水相为纯水溶液、磷酸盐水溶液、柠檬酸盐水溶液碳酸盐水溶液、重碳酸盐水溶液、氯化钾水溶液、氯化钠水溶液葡萄糖水溶液或乳酸林格溶液。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该油相为一身体可代谢的油脂或脂肪酸。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该身体可代谢的油脂选自于动物油、植物油、天然油、合成油及半合成衍生物所组成的群组中的一者或其任意的组合。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该油相溶液进一步具有分散在该油相溶液或该油相溶液所形成的油壳内的至少一水相初乳微滴，形成一复合型乳剂。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该组成成分包含有：含量大于重量百分比99％的连续水相；含量小于重量百分比1％的油相物质；以及含量介于重量百分比0.01％至重量百分比0.2％的乳化统。
为了达到前述的目的，本发明亦揭示一种制备纳米级乳液免疫载剂的方法，能够增强该抗原的免疫效价，该方法包含下列步骤：取一乳化统的组成乳化剂，并将其溶解于第一水相溶液中，以获得第一水相混合物；取一乳化统的组成乳化剂，并将其溶解于油相溶液中，以获得油相混合物；将该第一水相混合物与油相混合物掺混，以获得油水混合物；将该油水混合物进行均质，形成一储存溶液；将该储存溶液以一第二水相溶液进行稀释之后，形成一稀释溶液；将该稀释溶液以加压的方式通过具有选定纳米孔径的一薄膜，以获得纳米等级的乳液。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该加压过薄膜的步骤，将具有所选定纳米孔径的该薄膜设置于一双向加压装置之间，并将该双向加压装置分成两侧，当该稀释溶液自该双向加压装置的一侧以加压的方式通过该薄膜至该双向加压装置的另一侧后，该稀释溶液可再从该双向加压装置的另一侧加压通过该薄膜至该双向加压装置的原侧。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该该来回加压过薄膜的步骤重复进行至少一次，直至该稀释溶液中乳液粒子的粒径大小与该薄膜的孔径相符，且其粒径分布均匀为止。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该于该加压过薄膜的步骤之后，将该薄膜更换为孔径较小的另一薄膜，并重复进行该加压过薄膜的步骤。
于本发明的一实施例中，其亦揭示该该双向加压装置为制备微脂体所用的标准挤压器。
本发明具有以下有益效果：
本发明所提供的纳米级乳液免疫载剂，其不含离子型乳化剂而不对人体造成毒性，并通过将抗原与该免疫载剂结合可提供一诱导高度免疫反应的疫苗制剂，进行鼻腔黏膜接种疫苗的剂型选择；
本发明所提供的纳米级乳液免疫载剂，其通过将肿瘤抗原与该免疫载剂混合后，可提供一抑制肿瘤生长的肿瘤疫苗制剂，作为一种癌症疫苗制剂的剂型选择；
本发明所提供的制备方法，可有效且稳定的制备出内含高度均一性纳米脂质微粒的纳米级乳剂，且充分掌握所述纳米脂质微粒的粒径大小(particlesize)。
附图说明
图1为本发明的一较佳实施例的纳米级乳液的制备方法步骤流程图；
图2为本发明的另一较佳实施例的纳米级乳液的制备方法步骤流程图；
图3为本发明的又一较佳实施例的纳米级乳液的制备方法步骤流程图；
图4a及图4b为本发明的一较佳实施例的纳米级pelc乳液(nanopelc)及纳米级slacl乳液(nanoslacl)的粒径分布示意图；
图5a至图5c为本发明的一较佳实施例的纳米级乳液做为鼻腔给药疫苗载体于鼻腔黏膜及全身性的b细胞免疫反应结果示意图；
图6a至图6f为本发明的一较佳实施例的纳米级乳液做为鼻腔给药疫苗载体的t细胞免疫反应结果示意图，其包含细胞存活的结果、细胞激素分泌量及rna表现量的结果；及
图7为本发明的一较佳实施例的纳米级乳液做为黑色素瘤疫苗的鼻腔给药载体，其小鼠肺脏感染癌症情况的示意图。
具体实施方式
下列实施例将进一步说明本发明的其它特征和优点，但该等实施例仅为示例而用，并非对本发明的限制。
本说明书中使用的术语通常在此技术领域中、本发明的范围内，以及特定的情境下有其既定的含义。以下说明及说明书其他地方使用的部分术语，可使施作者进一步了解本发明。本说明书中所讨论的示例及使用的术语均为例示的用，并非用以限制本发明或示例用术语的范围和含义。同样地，本发明并不限于本说明书中所举出的实施例。
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语的含义为本发明所属领域的普通技术人员所熟知。在含义有冲突的情况下，以本文件及其它界定的含义为准。
在此所称的“乳化剂组合物”是指一种具有亲水基的头端和亲油基的尾端结构的物质，当其一端亲近于水相且一端亲近于油相时，其可位于两相的交界处，通过降低表面的张力以稳定整体溶液相的物理化学性质。
在此所称的“离子型乳化剂”是指一种分子溶于水后，会通过解离产生正离子亲水基团或负离子亲水基团的一类乳化剂，并通过该些离子亲水基团达到降低表面的张力以稳定整体溶液相的功效。
在此所称的“非离子型乳化剂”是指一种分子溶于水后，不会产生解离的一类乳化剂，于此类乳化剂当中，达成降低表面的张力以稳定整体溶液相的功效的部分，并非离子态的官能基。
在此所称的“可生物降解的”一般应指大分子聚合材料降解后分散在体内(这一定义排除了环境、真菌或细菌降解)。生物降解的聚合统可能因受到生物分子的攻击而使其大分子统的完整性受到影响，分解出片段或其他降解的副产品。产生的片段可能离开作用位点但不一定在体内消失。
在此所称的“生物可吸收的”一般应指聚合物本体降解并在体内进一步被吸收，亦即，聚合物因降解的副产物能经自然途径代谢消除。生物再吸收因此反映了体外异物及副产品(低分子化合物)在没有副作用的情形下的本体降解，进而完全消除的概念。
在此所称的“生物活性剂”该包含一免疫刺激物，通过诱导活化或增加的任何组组成物的活性，以刺激免疫统的物质。
在本发明中，针对现有技术下多数乳液型免疫载剂多数都使用了离子型的乳化剂，增加人体的代谢负担，且可能导致其发生其他不良反应的状况，提供一种非离子型乳化剂的纳米级乳液免疫载剂，并针对其因为乳化剂为非离子型而导致稳定溶液统的能力较一般离子型的乳化剂不足，而不易制备生成纳米级微粒乳剂的情况，提供一种新颖的制备方法，藉以提供一种具有高诱发免疫反应效率且对人体无不良影响的纳米级乳液免疫载剂。
因此，本发明提供一种纳米级乳液免疫载剂及其制备方法，其乳化统不含离子型乳化剂，并通过于外部添加压力的方式将悬浮乳液通过具有纳米孔径的一薄膜，使悬浮乳液内部的脂质微粒可随薄膜的孔径调整其粒径大小，藉以克服一般以超音波震荡或均质机均质化处理时所具有的次微米等级限制，且能获得较上述方法更为均一化的纳米脂质微粒，能有效提升纳米级乳剂的剂型质量及药物输送效率。
基于上述方针，以下针对本发明所提供的纳米级乳液免疫载剂中，所使用的材料、材料性质及其制备方式进行进一步的说明：
本发明提供的一种纳米级乳液免疫载剂，伴随抗原并经由鼻黏膜给予之后，能够增强该抗原的免疫效价，由一含有h2o分子的连续水相、一含有油脂的油相物质及一用于稳定连续水相和油相界面且由乳化剂混合物所组成的乳化统，其中，该乳化统不含离子型乳化剂，且该乳液的粒径大小介于20纳米至200纳米之间。
于一较佳的实施例当中，该纳米级乳液免疫载剂的成分组成比例由含量大于重量百分比99％的连续水相；含量小于重量百分比1％的油相物质；以及含量介于重量百分比0.01％至重量百分比0.2％的乳化统所组成。
其中，该连续水相用于分散该内的可分散介质，所述的可分散介质包含具可溶性的化合物、油相物质或经由油相溶液所包埋的任何物质等。基于前述的原则，本发明所提供的该第一水相溶液可为一纯水溶液或一化合物水溶液，其中，于一较佳的实施例当中，该化合物水溶液的化合物可为一磷酸盐化合物、一柠檬酸盐化合物、一(重)碳酸盐化合物、一氯化钾、一氯化钠，或各式医疗用输液如一葡萄糖水溶液、一乳酸林格溶液。
其中，该油相物质于该乳液统当中属于一分散相，为一种医药可接受的油性物质，且为使该纳米级乳液免疫载剂得以在身体内顺利进行药理作用，于一较佳实施例当中，所述的该油相物质为身体可代谢的油脂或脂肪酸。基于上述的原则，本发明所提供的该油相物质选自于动物油、植物油、天然油、合成油及半合成衍生物所组成的群组中的一者或其任意的组合。
其中，该乳化统由乳化剂组合物所组成，该乳化剂(emulsifyingagents)组合物用以使互不兼容的油水两相彼此相互混溶，以协助溶液环境形成均匀的分散体或乳化体的物质，就其选择上需与乳液当中的其他成分兼容且不可影响乳剂中相关物质的安定性及有效性。于本发明所提供的纳米级乳液免疫载剂，由于该乳化剂组合物将油相物质稳定于该连续水相中，因此一般而言需要较高的亲水性，且该亲水性乳化剂的亲水－亲脂平衡数值(hydrophilic-lipophilicbalance,hlb)介于8至18之间。基于上述的原则，本发明所提供的该乳化剂可选自于聚氧丙烯甘露醇二油酸酯、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂油酸衍生物、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧丙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯(5eo)羊毛醇醚、失水山梨醇月桂酸酯、失水山梨醇月桂酸酯、聚氧乙烯脂肪酸、聚氧乙烯氧丙烯油酸酯、聚氧乙烯山梨醇蜂蜡衍生物、四乙二醇单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯(4eo)失水山梨醇单硬脂酸酯、六乙二醇单硬脂酸酯、聚氧丙烯(5po)羊毛醇醚、聚氧乙烯(5eo)失水山梨醇单油酸酯、混合脂肪酸和树脂酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯(20eo)失水山梨醇三硬脂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯(20eo)失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯氧丙烯油酸酯、聚氧乙烯羊毛脂衍生物、聚氧乙烯单油酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯单油酸酯、聚氧乙烯单油酸酯、聚氧乙烯单棕榈酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯(10eo)油醇醚、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯烷基酚、聚氧乙烯(10eo)乙酰化羊毛脂衍生物、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯植物油、聚氧乙烯(4eo)失水山梨醇单月桂酸酯、混合脂肪酸和树脂酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯(24eo)胆固醇醚、聚氧丙烯(20po)羊毛醇醚、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(20eo)失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20eo)油醇醚、聚氧乙烯(20eo)甲基葡萄糖苷倍半油酸酯、聚氧乙烯(16eo)羊毛醇醚、聚氧乙烯(25eo)羊毛醇醚、聚氧乙烯(9eo)乙酰化羊毛脂衍生物、聚氧乙烯(20eo)失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯单油酸酯、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯十八醇、聚氧乙烯油醇、聚氧乙烯脂肪醇、聚乙二醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20eo)失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯十六烷基醇、聚氧乙烯氧丙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇羊毛脂衍生物、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯(20eo)失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯单硬脂酸酯、聚氧乙烯单硬脂酸酯及油酸钠、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚(乙二醇)-聚(丙交酯-ε-己内酯)团联共聚物及聚乙二醇-聚乳酸团联共聚物所组成的群组中的一者或其任意的组合。
另一方面，本发明所提供的该纳米级乳液免疫载剂与现有技术下的乳液免疫载剂的特征差异在于，其仅使用非离子型的乳化剂做为安定溶液统的物质。通过提供仅使用非离子型的乳化剂做为乳化统的纳米级乳液免疫载剂，使其在递送至生物体时，相较于其他离子型的乳化剂所带有的生物毒性较低，虽然整体制备难度较高，但于药物递送使用中较为安全的一种乳化剂选择。
于本发明所提供的一较佳实施例中，该乳化统不含阳离子型乳化剂，而所述该阳离子型乳化剂包含：卤化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumhalides)、氯化十六烷基吡啶(cetylpyridiniumchloride)、卤化十六烷基三甲基(cetyltrimethylammoniumhalides)、卤化十六烷基二甲基乙铵(cetyldimethylethylammoniumhalides)、卤化十六烷基二甲基苄基氯化铵(cetyldimethylbenzylammoniumhalides)、卤化十六烷基三丁基(cetyltributylphosphoniumhalides)、卤化十二烷基三甲铵(dodecyltrimethylammoniumhalides)或十四烷基三甲基卤化铵(tetradecyltrimethylammoniumhalides)。
一般而言，该非离子型的乳化剂的ph值为3至10，溶于水或有机溶剂中时，呈现中性的分子或胶束(micelle)状态，因此在酸性、碱性及电解质的溶液中状态较为稳定而不致生成沉淀物；基于上述原则，该非离子型的乳化剂可为聚氧乙烯类物质或多元醇类物质。于一较佳实施例当中，该非离子型的乳化剂可选自于聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚(乙二醇)-聚(丙交酯-ε-己内酯)团联共聚物、聚乙二醇-聚乳酸团联共聚物、甘露醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐-聚(丙交酯-ε-己内酯)团联共聚物、聚乙二醇-聚乳酸团联共聚物、椰子油还原醇、十六醇、油醇、甘油、季戊四醇、壬基酚、辛基酚、辛基甲酚、山梨醇、乙醇胺、异丙醇胺、蔗糖、月桂酸、椰子油脂肪酸、十四酸、棕榈酸、油酸及硬脂酸所组成的群组中的一者或其任意的组合。
而在本发明提供的该纳米级乳液免疫载剂当中，为了让乳液免疫载剂在鼻腔进行高效率的给药，乳液当中微粒(particle)的粒径大小(particlesize)即成为相当重要的关键，乳液统内的纳米级微粒(particle)能在分布有密集微血管的鼻腔进行快速的给药，以加快药物给药后的起效时间，同时，小粒径的乳液与脱氧核醣核酸(dna)、抗原、抗体、蛋白质或其他小分子组装形成粒径同样微小的复合物时，将更容易通过细胞膜被细胞摄取，加上其带有的电荷特性，能与带有负电荷的细胞膜相互吸引，使复合物更容易靠近细胞膜而被细胞摄取，并提供充足的药物稳定性使成分在到达靶组织的前避免在体内遭受破坏；基于前述的原由，本发明提供的该纳米级乳液免疫载剂的微粒(particle)的粒径大小(particlesize)介于20纳米至200纳米之间。
进一步而言，于本发明的一较佳实施例当中，本发明所提供的该纳米级乳液免疫载剂具有高给药效率，其容易通过细胞膜被细胞摄取，并提供充足的药物稳定性使抗原在到达靶组织的前避免在体内遭受破坏；因此，本发明所提供的该纳米级乳液免疫载剂无须搭配其他生物活性剂使用，其中该生物活性剂包含一免疫刺激物，通过诱导活化或增加的任何组组成物的活性，以刺激免疫统的物质(药物和营养物)，举例而言，本发明所提供的该纳米级乳液免疫载剂所不具有的该些免疫刺激剂种类包含但不限于：类铎受体(tlr)激动剂或短链抗菌胜肽，如cpg的寡脱氧核苷酸(tlr-9)、皂苷(tlr-2、tlr-4)、单磷酰脂质a(tlr-4)、鞭毛蛋白(tlr-5)以及抗菌胜肽(tlr-4)。
另一方面，于本发明的一较佳实施例当中，所述的该油相物质，其进一步可具有分散在该连续水相或该连续水相所形成的油壳内的至少一水相初乳微滴，形成一复合型乳剂，其中，该溶液环境统内需包含一稳定结合介于水相和油相的亲脂性乳化剂，使该水相初乳微滴能稳定地存在于该连续水相或其所形成的油壳当中，该亲脂性乳化剂的亲水－亲脂平衡数值(hydrophilic-lipophilicbalance,hlb)介于1至7之间，较佳为3至6。基于前述的原则，于本发明一较佳实施例中，该亲脂性乳化剂选自于甘露醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、山梨醇酐-聚(丙交酯-ε-己内酯)团联共聚物及聚乙二醇-聚乳酸团联共聚物所组成的群组中的一者或其任意的组合；通过此一设计，该具有水相初乳微滴的乳剂可更为精准地控制乳剂搭载成分的释放，另一方面，当该乳剂作为疫苗的载体时，可增强病患身体对免疫原反应、及/或有效诱发抗原或抗原呈现细胞的活化。
以下，针对本发明所提供的纳米级乳液免疫载剂的制备方法中，所使用的材料、材料性质及其制备方式进行进一步的说明：
请参阅本发明的图1，其为本发明的一实施例的纳米级乳液免疫载剂的制备方法的方法流程图，如图所示，该纳米级乳液免疫载剂的制备方法其步骤如下：
步骤s11：取一乳化统的一组成乳化剂溶解于一第一水相溶液中，以获得一第一水相混合物；
步骤s13：取该组成乳化剂溶解于一油相物质中，以获得一油相混合物；
步骤s15：将该第一水相混合物与该油相混合物掺混并进行均质，形成一储存溶液；
步骤s17：将该储存溶液以一第二水相溶液进行稀释之后，形成一稀释溶液；
步骤s18：一加压过薄膜的步骤，将该稀释溶液以加压的方式通过具有选定纳米孔径的一薄膜，以获得该纳米级乳液免疫载剂。
如图示s11的步骤，本发明于一较佳实施例中所提供的纳米级乳剂的制备方法，先将一乳化剂于一第一水相溶液当中进行溶解，以获得一第一水相混合物。
其中，该第一水相溶液为整体纳米级乳剂当中的连续水相，用于分散该连续水相统内的可分散介质；该乳化剂(emulsifyingagents)用以使互不兼容的油水两相彼此相互混溶，以协助溶液环境形成均匀的分散体或乳化体的物质；该乳化剂及该第一水相溶液的定义与特性已于前述的纳米级乳液免疫载剂组成中进行描述，于此不再赘述。
另一方面，本发明所提供的纳米级乳液免疫载剂制备方法，其仅使用非离子型的乳化剂做为安定溶液统的物质，其在递送至生物体中时，相较于其他离子型的乳化剂所带有的生物毒性-较低，因此属于一操作难度较高但于药物递送使用中较为安全的一种乳化剂选择。该非离子型乳化剂的定义与特性已于前述的纳米级乳液免疫载剂组成中进行描述，于此不再赘述。
如图示s13及s15的步骤，其进一步于步骤s11的该第一水相混合物中添加一油相物质，使该第一水相混合物与该油相物质混合形成一油相混合物，而为了使油相物质能均匀的分布于该纳米级乳剂统当中，于此一实施例的制备的步骤中，进一步对该混合溶液提供一外部应力，配合水相溶液当中所具有的该乳化剂可降低油相与水相之间的表面张力的功效，使油相物质在受外部应力打散的情况下即受到该乳化剂及该水相溶液的包覆，进而让该油相物质稳定的分布于整体乳剂环境当中，而当外部应力提供的强度越强时，则油相溶液将会随的分散成越小的单元被水相溶液所包覆，且会更均匀的分散在该纳米级乳液免疫载剂当中，形成高度均质化及均一化的储存溶液。
其中，该油相物质为一种医药可接受的油性物质，且为使该纳米级乳液免疫载剂得以在身体内顺利进行药理作用，另一方面，于本发明的一较佳实施例当中，所述的该油相物质，其进一步可具有分散在该连续水相或该连续水相所形成的油壳内的至少一水相初乳微滴，形成一复合型乳剂；其中，该油相物质及该复合型乳剂的定义与特性已于前述的纳米级乳液免疫载剂组成中进行描述，于此不再赘述。
当在溶液统中提供油相物质或具有至少一水相初乳微滴的油壳之后，即针对该溶液统进行一均质的步骤，该均质步骤如同前述，为提供一外部应力于该混合溶液中使该混合溶液内的该油相连续水相均匀分布于该连续水相溶液的步骤，举例而言，该所述均质步骤可通过转子于溶液环境中高速平稳的旋转，形成高频、强烈的圆周剪切运动，并通过定子(stator)的作用于狭窄的间隙中形成强烈、往复的液力剪切、摩擦、离心挤压、液体流动碰撞等综合效应，使该油相物质细碎化而呈现安定的油滴状态；亦或是，对整体溶液施以超音波震荡的外力，利用超音波频率高、波长短的特性，在整体乳剂环境中快速形成许多真空气泡并迅速破裂，产生产生强而有力的剪切作用力，使该油相物质逐渐形成油滴的状态，以达到整体乳剂环境中水相及油相彼此之间均匀安定存在的目的。基于前述的目的，本发明所提供的一较佳实施例，其均质化的步骤包含超音波震荡、转子定子均质化或挤压式均质化。
另一方面，为简化其操作步骤，本发明一较佳实施例当中，其可将步骤s11、s13及s15的该第一水相溶液、该乳化剂及该油相物质同时加入至溶液环境进行混合后，直接进行均质以形成该储存溶液，当所选用的该第一水相溶液、该乳化剂及该油相物质彼此性质配合时，该混合溶液的混合顺序可不必依循步骤s11至步骤s15进行，当该些必要成分直接混合并进行均质后，其亦可自然的形成连续水相包覆微小油相物质的型态，与分批依序加入的操作步骤获得同样的该储存溶液。
接着，无论该储存溶液的形成步骤为何，于本发明一较佳实施例当中，如图2所示，更可进一步包含一步骤s16，其于该储存溶液制备完成后，与一抗原溶液进行混合，形成一抗原储存溶液。其中，该抗原溶液可为疏水性质或亲水性质，依照该抗原溶液所选用的抗原不同，可诱发体内不同免疫反应，而该抗原溶液内的抗原通过本身所具有的亲和性吸附于该储存溶液内的连续水相或油相物质，形成该抗原储存溶液，以通过该乳剂作为载体递送至目标生物体当中。
承续上段所述，所述的该抗原溶液除了包含抗原之外，不包含任何免疫刺激物，所述的免疫刺激物通过诱导活化或增加的任何组成物的活性，以刺激免疫统的物质(药物和营养物)；基于前述的原则，本发明所提供的该免疫刺激剂包含但不限于：类铎受体(tlr)激动剂或短链抗菌胜肽，如cpg的寡脱氧核苷酸(tlr-9)和宿主防御肽(tlr-4)、皂苷(tlr-2、tlr-4)、单磷酰脂质a(tlr-4)、鞭毛蛋白(tlr-5)以及抗菌胜肽。
如图示s17的步骤，本发明于一较佳实施例中所提供的该纳米级乳液免疫载剂的制备方法，将该储存溶液进行稀释，通过将该储存溶液稀释的过程，降低微乳颗粒于乳剂当中的密度，避免过度密集的微乳颗粒同时通过薄膜孔径，造成薄膜孔径的堵塞，另一方面，通过稀释该储存溶液，能有效降低该储存溶液通过薄膜时的压力，避免该薄膜因挤压的压力过大而导致破裂，而失去微小均一化微乳颗粒的功效。
如图示s18的步骤，本发明于一较佳实施例中所提供的该纳米级乳液免疫载剂的制备方法，将前一步骤获得的该稀释溶液通过施加外部压力，而通过具有目标纳米孔径的一薄膜，使该稀释溶液内部已于前述均质化步骤而细碎微小化的油滴状油相物质可在通过该薄膜所具有的纳米孔洞时，将油滴的粒径尺寸从微米或次微米的等级受纳米孔洞固定形体的限制，向下调整成该纳米孔洞的粒径大小，藉以确保乳剂内部油滴的粒径尺寸为纳米等级，以完成该纳米级乳液免疫载剂的制备。
其中，于一较佳的实施例当中，该加压过薄膜的步骤，进一步将具有目标纳米孔径的该薄膜设置于一双向加压的装置之间，且该双向加压装置的两侧皆各具有一容置空间以放置该稀释溶液，当该稀释溶液自该双向加压装置的一侧通过外部加压的方式通过该薄膜至该双向加压装置的另一侧后，该稀释溶液可再从该双向加压装置的另一侧加压通过该薄膜至该双向加压装置的原侧。通过此一方式，该稀释溶液得以在消耗较少乳剂体积的情况下完成该通过薄膜的步骤，且减少操作器具更换的繁复步骤，得以花费更少的时间及更具效率的方式完成该纳米级乳液免疫载剂的制备。
承续上段所述，于本发明另一较佳的实施例当中，该双向加压装置为制备微脂体所用的一标准挤压器，其包含位于中央的一薄膜支撑装置，及连接于该薄膜支撑装置左右两侧的二中空管柱，该些中空管柱具有一内部容置空间可用以容置该稀释溶液，且各自具有与该中空管柱内壁密合的一推杆，当该些推杆向该薄膜支撑装置的方向进行推挤时，能使该稀释溶液通过该薄膜支撑装置至另一侧中空管柱的该内部容置空间，再经由另一侧中空管柱的该推杆挤压而回到原来的中空管柱的该内部容置空间，其中，该薄膜支撑装置具有一挤压器外套管、至少一薄膜支撑器、一薄膜、一轴承及一紧固螺母，该些组件皆具有一内部空腔并连通于两侧中空管柱的该内部容置空间，使该稀释溶液能顺利通过薄膜进行微乳颗粒的微小均一化。
另一方面，于本发明另一较佳的实施例当中，该来回加压过薄膜的步骤可重复进行至少一次，直至该稀释溶液中的微乳颗粒的粒径大小与该薄膜的孔径相符，且微乳颗粒的粒子的分布均匀为止。通过此一步骤所获得的该纳米级乳液免疫载剂，由于微乳颗粒的粒径大小分布较一般仅通过挤压或均质化的微米级乳剂更为均匀，因此在做为药物递送的载体时，能更为平均的散布于给药的区段，以提升给药的效率，特别是当应用于以鼻腔作为给药途径的载体时，其可更为均匀的散布于鼻腔中的微血管群，达到更佳的给药效率，而当作为经由鼻腔进行给药的疫苗载体时，经由反复步骤所获得的纳米化微乳颗粒，其油相物质能更能提供较佳的生物活性，触发更强的免疫刺激反应，进而有效提升疫苗的效力。
承续上段所述，该来回加压过薄膜的步骤除了可重复进行复数次之外，如图3所示，更可进一步包含一步骤s19，其于该加压过薄膜的步骤之后，将该薄膜更换为孔径较小的另一薄膜，并重复进行该加压过薄膜的步骤。
其中，于此一步骤中更换的薄膜孔径尺寸可以不只一种，可依薄膜孔径的降序排列依序进行薄膜的更换及挤压过膜，此一操作步骤的优点，可避免乳剂中的微乳颗粒过大因薄膜孔径过小而无法顺利通过薄膜，甚至造成薄膜孔径堵塞的情况发生；同时，通过此一步骤，可在微乳颗粒均一的微小化至较小的粒径尺寸后，再进行下一个等级的均一微小化，在循序的微小化过程中能确保微乳颗粒的均一性，而不会发生部分微乳颗粒通过薄膜而部分未通过时，所导致的粒径分布范围过大的情况，如此将导致该纳米级乳液免疫载剂作为载体进行药物递送时的效率下降，影响药剂的有效性及其分布情况。
以下，以具体实施的范例作为此发明的组织技术内容、特征及成果的阐述的用，并可据以实施，但本发明的保护范围并不以此为限。
实施例1
纳米级pelc乳液(nanopelc)及纳米级slacl乳液(nanoslacl)的制备
首先先进行聚乙二醇化聚脂(pegylated-polyester)共聚物的制备，其由丙交酯和ε-己内酯的开环聚合而合成，使用snoct2作为催化剂和mepeg5000作为引发剂。简言的，将预定量的mepeg5000(2.1克)、丙交酯(0.58克)和ε-己内酯(0.47克)置于聚合安瓿，将该混合物脱气并在真空下密封后，在140℃、真空下进行24小时聚合作用。该共聚物溶于丙酮后倒入乙醇中，收集沉淀的聚合物，经过滤及真空干燥，得到纯产物。
另一方面，另一种乳化剂－山梨醇酐-聚脂(sorbitan-polyester)轭合物的制备分成两阶段，首先，加入预定量的山梨醇到烧瓶中，简单地在磷酸环境中，使用
为制备获得pelc乳剂及slacl乳剂，本实施例将聚乙二醇-聚脂共聚物(peg-b-placl)的乳化剂120毫克(mg)溶解于0.8毫升(ml)的磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)中，以获得水相混合溶液，接着将该水相混合溶液与1.1毫升(ml)内含角鲨烯(squalene)及
接着将该微米等级的pelc乳剂及slacl乳剂以磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)稀释一千倍后，置入制备微脂体所用的标准挤压器，进行加压过膜的步骤，所选用的薄膜孔径大小依序为1000纳米(nm)、400纳米(nm)、200纳米(nm)及100纳米(nm)，该些微米等级的pelc乳剂及slacl乳剂依序挤压通过上述纳米孔径的薄膜，当该稀释溶液自该双向加压装置的一侧以加压的方式通过该薄膜至该双向加压装置的另一侧后，该稀释溶液再从该双向加压装置的另一侧加压通过该薄膜至该双向加压装置的原侧，并来回11次，以完成纳米级pelc乳剂(nanopelc)及纳米级slacl乳剂(nanoslacl)的制备，并将制备完成的乳液以粒径分析仪(particlesizer)观察乳液的粒径分布。
其结果如图4a及图4b所示，可观察到纳米级pelc乳剂(nanopelc)的粒径尺寸皆分布于100纳米以下(图5a)，而未纳米化的pelc乳剂则多数分布于200纳米至300纳米之间(图5b)；另一方面，纳米级slacl乳剂(nanoslacl)的粒径尺寸皆分布于100纳米至200纳米，而未纳米化的slacl乳剂，则多数分布于450纳米至1000纳米之间，由此可知，经由纳米化制程的pelc乳剂(nanopelc)及slacl乳剂(nanoslacl)其粒径尺寸皆有效的微小化，且符合纳米等级的定义。
实施例2
以纳米级乳液免疫载剂做为鼻腔给予疫苗载体的b细胞免疫反应结果
取六周龄大的balb/c母鼠分成六组(n＝6)进行实验，以每周一次的频率，将卵清蛋白(ovalbumin,ova)以五种剂型由鼻腔内给予的方式进行递送，剂型包含直接递送ova(100ug/剂,20ul)、ova以10％的微米等级pelc乳液进行包覆递送、ova以10％纳米级的pelc乳液、ova以10％的微米等级slacl乳液及ova以10％纳米级的slacl乳液进行包覆递送，并同时提供硝酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)的组别做为控制组，进行为期三周的免疫接种，接着在完成给药一周后，将小鼠牺牲并取其血清、鼻腔清洗液(nasalwashes)，利用酵素免疫分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassayelisa)进行该些检体中卵清蛋白特异性(ova-specific)igg、ige及iga的浓度检测，观察小鼠b细胞免疫反应受模拟抗原刺激后的的情况。
首先，小鼠血清及鼻腔清洗液中的卵清蛋白特异性(ova-specific)igg、ige及iga的浓度检测结果，如图5a至图5c所示，可以发现其经由纳米级的pelc乳液(ova/nanopelc)及纳米级的slacl乳液(ova/nanoslacl)搭载的卵清蛋白进行疫苗免疫的小鼠组别，其血清中卵清蛋白特异性的igg及iga含量，以及鼻腔黏膜中卵清蛋白特异性的iga含量都较pbs的控制组来得高，显见该些乳液能确实的将卵清蛋白进行递送，另外，经由纳米级的pelc乳液(ova/nanopelc)进行卵清蛋白递送的组别，又明显较单纯进行卵清蛋白递送的组别(ovaalone)递送效率更佳；另一方面，在血清中的ova-igg及鼻腔黏膜中的iga小鼠组别中，pelc乳液及slacl乳液经由纳米化后，其递送效率都较微米等级pelc乳液及slacl乳液来得高，显见以纳米化的乳液进行鼻腔给药的确能增加药物递送的效率，综合上述的实验结果，可以观察到经由鼻腔进行添加纳米化乳液的模拟抗原，能有效的诱发黏膜部位及全身性的抗原专一性免疫反应，其效果显著优于未添加佐剂以及添加次微米等及乳剂的疫苗抗原。
实施例3
以该纳米级乳液免疫载剂做为鼻腔给予疫苗载体的t细胞免疫反应结果
取六周龄大的balb/c母鼠分成六组(n＝6)进行实验，以每周一次的频率，将卵清蛋白(ovalbumin,ova)以五种剂型由鼻腔内给药的方式进行递送，剂型包含直接递送ova(100ug/剂,20ul)、ova以10％的微米等级pelc乳液进行包覆递送、ova以10％纳米级的pelc乳液、ova以10％的微米等级slacl乳液及ova以10％纳米级的slacl乳液进行包覆递送，并同时提供硝酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)的组别做为控制组，进行为期三周的给药，接着在完成给药一周后，将小鼠牺牲并取其脾脏并置备成细胞悬浮液，进行anti-cd4、anti-cd8及anti-cd107抗体染色以观察其细胞毒性t细胞(cytotoxiclymphocytes,ctls)的活性反应，另外，通过细胞存活性试验(mttassay)来观察测试添加于纳米化乳液的模拟抗原，其抗原的激活指数(antigen-stimulationindex)，以及通过细胞的萃取获得其免疫相关rna及细胞激素(cytokine)的表现量，通过上述的方法观察受疫苗注射的小鼠体内t细胞免疫反应相关的概况。
实验结果如图6a至图6f所示，首先在细胞存活性试验当中，经由纳米级的pelc乳液(ova/nanopelc)及纳米级的slacl乳液(ova/nanoslacl)搭载的卵清蛋白进行疫苗免疫的小鼠组别，其胰脏细胞的抗原激活指数(antigen-stimulationindex)皆较其他的实验组别来的高(如图6a所示)，而在细胞毒性t细胞的活性反应中，更可明显的观察到上述现象，通过观察脾细胞表面呈现的标记(surfacemarker)cd8及去颗粒作用(degranulation)标记cd107a可以发现，经由纳米级的pelc乳液(ova/nanopelc)及纳米级的slacl乳液(ova/nanoslacl)搭载的卵清蛋白能较一般的递送载体刺激更多的t细胞反应(如图6b所示)，以刺激活化更多的细胞毒性t细胞，且该些细胞毒性t细胞的活化亦连带使着细胞激素(cytokine)的分泌量增加(如图6c及图6d所示)，同时可明确观察到其通过分泌介白素-17(interleukin-17)及干扰素-γ(interferon-γ)以产生对应的免疫反应；另一方面，观察t细胞免疫反应相关细胞的rna表现，亦可发现到在与干扰素-γ及抗原特异性t细胞活化有关的t-betrna，以及与cd8细胞免疫反应相关的rorγtrna，在受纳米级的pelc乳液(ova/nanopelc)及纳米级的slacl乳液(ova/nanoslacl)搭载的卵清蛋白的刺激上，亦表现出较高的rna表现量(如图6e及图6f所示)，进而证明纳米级的pelc乳液及纳米级的slacl乳液在做为鼻腔给予疫苗载体时，对于t细胞免疫反应所产生的调节效果。
实施例4
以该纳米级乳液免疫载剂做为黑色素瘤疫苗的鼻腔给予载体的免疫效果
取六周龄大的c57bl/6母鼠分成四组(n＝6)进行实验，通过血管内接种(intravascularlyinoculated)的方式将b16-f10/ova黑色素瘤细胞株(每只小鼠5x105个细胞)植入小鼠体内，饲养一个礼拜。接着以每周一次的频率，将ova疫苗以三种剂型由鼻腔内给予的方式进行递送，剂型包含直接递送ova(100ug/剂)、ova以0.1％的微米等级pelc乳液进行包覆递送及ova以0.1％纳米级的pelc乳液进行包覆递送，并同时提供pbs的组别做为控制组，进行为期三周的免疫接种，接着在完成给药一周后，将小鼠牺牲并将其肺脏取出进行病理观察。
实验结果如图7所示，其中仅给予pbs的组别其病理观察的肺部颜色最黑，表示其被黑色素瘤细胞株感染的最为严重，其次是仅给予ova的实验组，其被黑色素瘤感染的区块不若pbs组严重，但仍具有一定的面积，接着是ova以0.1％微米等级的pelc乳剂进行包覆递送的实验组，其仍具有部分的黑色素瘤感染区域，但面积较直接给予ova的组别来的小，显见乳液剂型通过鼻腔黏膜途径进行给药的效果，最后是ova以0.1％纳米级的pelc乳液进行包覆递送，如图所示，该组的小鼠肺脏几乎没有被黑色素瘤细胞株感染的区域，证明同样是以乳液进行鼻腔黏膜途径进行免疫接种，纳米级的乳液其效用又较一般的乳液更为显著，证明所提供的乳液剂型不仅确实为纳米等级，且其用以作为癌症疫苗的效果的确较其他剂型进行免疫接种时来得显著。
综上所述，本发明确实通过有效的操作步骤提供一种纳米级乳液免疫载剂，其不仅较既有的乳液提供粒径尺寸更小的微乳颗粒，更能有效地将该些微乳颗粒的尺寸均一化而不至于有大小不一的情况，通过提供此种微乳颗粒粒径尺寸(particlesize)更小且更为均一的乳液，能有效提升乳剂的分散能力，尤其是此种纳米级乳液免疫载剂用于鼻腔递送的给药统时，更能有效的散布于鼻腔密集的微血管群之中，有效的提升给药效率；另一方面，此种纳米级乳液免疫载剂亦可加入抗原或其他免疫反应的刺激物作为疫苗的载体，同样通过鼻腔作为疫苗递送的途径，通过动物实验观察到以该纳米级乳液免疫载剂作为载体的疫苗能有效的诱发与抗原对应的b细胞及t细胞免疫统反应，亦可有效的作为癌症疫苗的载体而有效减缓癌症的发生；最后，通过次微米化及纳米化的乳液作为疫苗载体的效用比较，能发现纳米化的乳剂其油相物质能表现出其在次微米等级实难以达到的免疫刺激状态，生物活性皆能有效提升。因此，本发明所提供的该纳米级乳液免疫载剂及其制备方法，确实提供一种微乳颗粒粒径尺寸(particlesize)更小且更为均一的乳剂的一纳米级乳液免疫载剂，提供一种具有高诱发免疫反应效率且对人体无不良影响的免疫载剂。
综上所述，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非因此而限制本发明的专利保护范围，故举凡本发明说明书及附图所作等效变化等，皆应包括于本发明的保护范围内。
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