本发明属于兽用生物制药领域，具体是一种禽用二联活疫苗的制备方法。
背景技术：
禽脑脊髓炎(avianencephalomyelitis，ae)又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(aev)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病。种鸡群发病期间及发病前后各1个月内产蛋急剧下降，导致孵化率降低并引起子代雏鸡带毒发病。目前该病在我国流行日趋严重，由于没有特效的根治药物，因此主要依靠疫苗免疫进行预防。鸡新城疫疾病是由副粘病毒引起的高度接触性传染病，俗称“鸡瘟”，本病一年四季均可发生，尤以寒冷和气候多变季节多发。各种日龄的鸡均能感染，死亡率高。主要特征是呼吸困难，神经机能紊乱，粘膜和浆膜出血和坏死。传播速度快，死亡率高，危害严重，给养禽业带来巨大损失，目前也主要依靠疫苗免疫。
现有的禽脑脊髓炎主要为灭活疫苗，截止目前我国获批的禽脑脊髓炎活疫苗采用翅下刺种的方式接种，疫苗安全性存在一定隐患，同时灭活疫苗制备成本过高；新城疫虽然有活疫苗，但当二者混合感染时需要分别免疫，增加了免疫成本。有报道将二者分别接种spf鸡胚扩毒后再混合制备成二联苗，但该方法会在疫苗中引入过多的非有效物质，且该方法制备的新城疫病毒和禽脑脊髓病毒的二联疫苗存在抗原竞争抑制现象，无法获得理想的免疫效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法。
本发明的目的还在于通过同胚接种，降低疫苗生产成本的同时减少疫苗中非有效物质的含量，进而减少免疫应激。
本发明的目的还在于采用饮水免疫方法，降低了疫苗的接种成本和人为因素带来的免疫失败的风险，增加疫苗免疫的安全性，减少免疫应激，有利于规模化生产的需要和集约化养殖的需求。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法，其具体步骤为：
(1)选用6日龄鸡胚，于其卵黄囊中接种禽脑脊髓炎病毒；
(2)接种后，继续孵化培养，弃掉4～6天死亡的鸡胚。
(3)将存活鸡胚继续孵化至10-12日龄，于其尿囊腔中接种鸡新城疫病毒；
(4)接种新城疫病毒后2-6天，收集病料并制备抗原液；
(5)将抗原液与保护剂按处方比例混合、冻干，制成疫苗。
进一步的，步骤(1)所述的禽脑脊髓炎病毒的接种浓度为：103.5-104.5eid50/胚。
进一步的，步骤(3)所述的鸡新城疫病毒的接种浓度为：105.2-105.5eid50/胚。
进一步的，步骤(4)所述的收集病料包括：将2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集,放置于4-8℃冷库冷却，分别收集尿囊液和鸡胚组织，经研磨、混合、冻融、离心后最终收获抗原液。
进一步的，步骤(5)所述的保护剂中含有明胶8-12％、蔗糖22-25％、海藻糖5-10％，和山梨醇3-5％。
进一步的，步骤(5)所述的保护剂中含有明胶8％，蔗糖22％，海藻糖10％，山梨醇3％。
进一步的，步骤(5)所述的疫苗的冻干包括以下步骤：将抗原液与保护剂按照6～8:1的比例混合，充分混匀后分装，冻干。
进一步的，步骤(5)所述的疫苗的冻干包括以下步骤：将抗原液与保护剂按照7:1的比例混合，充分混匀后分装，冻干。
进一步的，所述二联活疫苗的免疫途径为饮水免疫。
采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：
(1)制备鸡新城疫毒液和禽脑脊髓炎毒液采用同胚接种的方式，降低了生产成本，降低了活疫苗中非有效物质的含量，减少免疫应激。
(2)本发明所提供的免疫方法采用饮水免疫方法，降低疫苗接种的成本，减少动物免疫过程中造成的应激，提高家禽生产性能。
(3)本发明涉及到的新型保护剂，降低冻干过程中的效价损失，提高饮水免疫过程中的稳定性，保证疫苗免疫效果。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法
(1)禽脑脊髓炎毒种接种
取6日龄spf鸡胚，将含量为105.5eid50/0.1ml的禽脑脊髓炎毒种进行100倍稀释，采用卵黄接种的方法，每胚接种0.2ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养，弃掉4-6天死亡的鸡胚。
(2)鸡新城疫毒种的接种
经步骤(1)中的存活的鸡胚，继续孵化至10-12日龄，将含量为108.5eid50/0.1ml的鸡新城疫毒种进行1000倍稀释，采用尿囊腔接种的方法，每胚接种0.1ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养。
(3)抗原的收获
将新城疫病毒接种后2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集，放置于4-8℃冷库冷却，全部分别收获尿囊液和鸡胚组织，研磨，将鸡胚组织与2倍体积的鸡胚尿囊液充分混合，冻融2次后5000～7000rpm/min离心，取上清即为收获的抗原液。
(4)保护剂的配制
冻干保护剂中明胶10％，蔗糖25％，海藻糖5％，山梨醇5％，依次分别溶解在纯化水中，0.22um过滤器过滤除菌。
(5)疫苗冻干
将收获的病毒抗原与保护剂8:1的比例混合，充分混匀后，分装，冻干。
实施例2：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法
(1)禽脑脊髓炎毒种接种
取6日龄spf鸡胚，将浓度含量为105.5eid50/0.1ml的禽脑脊髓炎毒种进行100倍稀释，采用卵黄接种的方法，每胚接种0.2ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养，弃掉4-6天死亡的鸡胚。
(2)鸡新城疫毒种的接种
经步骤(1)中的存活的鸡胚，继续孵化至10-12日龄，将浓度含量为108.5eid50/0.1ml的鸡新城疫毒种进行1000倍稀释，采用尿囊腔接种的方法，每胚接种0.1ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养。
(3)抗原的收获
将新城疫病毒接种后2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集，放置于4-8℃冷库冷却，全部分别收获尿囊液和鸡胚组织，研磨，将鸡胚组织与2倍体积的鸡胚尿囊液充分混合，冻融3次后5000～7000rpm/min离心，取上清即为收获的抗原液。
(4)保护剂的配制
冻干保护剂中明胶8％，蔗糖22％，海藻糖10％，山梨醇3％，依次分别溶解在纯化水中，0.22um过滤器过滤除菌。
(5)疫苗冻干
将收获的病毒抗原与保护剂7:1的比例混合，充分混匀后，分装，冻干。
实施例3：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗制备方法
(1)禽脑脊髓炎毒种接种
取6日龄spf鸡胚，将含量为105.5eid50/0.1ml的禽脑脊髓炎毒种进行100倍稀释，采用卵黄接种的方法，每胚接种0.2ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养，弃掉4-6天死亡的鸡胚。
(2)鸡新城疫毒种的接种
经步骤(1)中的存活的鸡胚，继续孵化至10-12日龄，将含量为108.5eid50/0.1ml的鸡新城疫毒种进行1000倍稀释，采用尿囊腔接种的方法，每胚接种0.1ml，接种后石蜡封口，继续孵化培养。
(3)抗原的收获
将新城疫病毒接种后2-6天的死亡鸡胚和健活鸡胚分别收集，放置于4-8℃冷库冷却，全部分别收获尿囊液和鸡胚组织，研磨，将鸡胚组织与2倍体积的鸡胚尿囊液充分混合，冻融后5000～7000rpm/min离心，取上清即为收获的抗原液。
(4)保护剂的配制
冻干保护剂中明胶12％，蔗糖23％，海藻糖8％，山梨醇4％，依次分别溶解在纯化水中，0.22um过滤器过滤除菌。
(5)疫苗冻干
将收获的病毒抗原与保护剂6:1的比例混合，充分混匀后，分装，冻干。
实施例4：一种鸡新城疫、禽脑脊髓炎病毒二联活疫苗免疫效果
1.取5～8周龄的spf鸡，60羽，随机分为2组，每组30羽作为攻毒组，第一组为新城疫组，第二组为禽脑脊髓炎组，再取20羽spf鸡随机分为2组，每组10羽作为对照组，暂养一日后，进行后续试验；
2.选取上述实施例1-3中制备的二联活疫苗，按照下表进行攻毒试验，免疫后21～28天后，分别进行新城疫病毒和禽脑脊髓炎病强毒攻击试验，攻毒试验时不同攻毒组和对照组均应按分组隔离饲养，避免交叉感染。
表1鸡新城疫禽脑脊髓炎二联活苗攻毒保护试验
3.结果如表2所示，攻毒组1中，实施例1-3所制备的疫苗可以对新城疫病毒进行有效保护；攻毒组2中，实施例1-3所制备的疫苗可以对禽脑脊髓炎病毒进行有效保护。
表2鸡新城疫禽脑脊髓炎二联活苗攻毒保护试验结果
4.取5～8周龄的spf鸡，20羽，随机分为2组，每组10羽，暂养一日后，分别进行如下操作：
5.选取上述实施例2中制备的二联活疫苗，第一组spf鸡，每羽饮水免疫0.5ml，免疫后21～28天后，进行新城疫病毒和禽脑脊髓炎病强毒攻击试验，第二组作为空白对照组，结果如表2，均能达到标准要求。
表3鸡新城疫、禽脑脊髓炎二联活苗攻毒保护试验结果
实施例5：本配方疫苗与普通油剂疫苗免疫效果的对比
1.参照实施例1的试验方法，制备二联活疫苗；
2.取5～8周龄的spf鸡30羽，随机分为3组，每组10只，暂养一日后，分别进行如下操作：
第一组：设为本配方疫苗组，每羽饮水免疫0.5ml所制备的鸡新城疫、禽脑脊髓炎二联活疫苗，14天后再次饮水免疫0.5ml所制备疫苗。
第二组：设为油乳剂灭活疫苗组，每羽皮下注射疫苗0.5ml，14天后再次皮下注射疫苗0.5ml。
第三组：设为空白对照组。
上述三组受试鸡在二免后14天，每羽鸡用0.5ml的新城疫病毒和0.1ml的禽脑脊髓炎病毒攻毒。
结果：第一组9只保护，第二组9只保护，第三组9只发病，表明同胚接种法制备的鸡新城疫、禽脑脊髓二联活疫苗能具有和油乳剂灭活疫苗等同的免疫保护效力。