本发明涉及三叶青在制备在抑制呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)、单纯疱疹病毒1型(herpessimplexvirustype1，hsv-1)药物中的应用。
背景技术：
三叶青(tetrastigmatishemsleyani)为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤(tetrastigmahemsleyanumdielsetgilg)，其块根名为蛇附子，别名有石猴子、石抱子、拦山虎、雷胆子、破石珠、土经丸、搜夹风、三叶对、小扁藤、阴灵子、三叶扁藤、丝线吊金钟、金线吊葫芦、金线吊马铃薯等。主要分布于我国西南及浙江、广东、湖北、福建等地区，生于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下。宜冬至至惊蛰期间采摘，其药用部位为块根、果实或全草。《中国植物志》记载三叶崖爬藤全株供药用，有活血散瘀、解毒、化痰的作用，临床上用于治疗病毒性脑膜炎、乙型脑炎、病毒性肺炎、黄疸性肝炎等，特别是块根对小儿高烧有特效。其性味微苦，归经平，无毒，具有清热解毒、活血散结、消炎止痛、祛风化痰、理气健脾等功效。性状鉴别：攀援藤本。根粗壮，呈纺锤形或团块状，常数枚相连。茎细弱，下部节上生根。叶互生；掌状复叶，小叶3枚，狭椭圆形至卵状椭圆形，中央1枚较大，长3～7cm，宽2～3cm，先端尖或短尖，基部渐狭，边缘有刺状疏齿，两侧小叶较小，不对称，长2～4cm，宽1.3～2cm；小叶柄长3～5mm，总叶柄长2～4cm；卷须与叶对生，具吸盘。花杂性异株；伞形花序腋生；花瓣4，开张，花盘与子房基部合生；雌蕊1，柱头4深裂。小浆果，球形。种子卵状球形。根呈纺锤形、卵圆形、葫芦形或椭圆形，一般长1.5～6cm，直径0.7～2.5cm。表面棕褐色，多数较光滑，或有皱纹和少数皮孔状的小瘤状突起，有时还有凹陷，其内残留棕褐色细根。质硬而脆，断面平坦而粗糙，类白色，粉性，可见棕色形成层环。气无，味甘。
三叶青提取物在本专利中是指三叶青乙醇提取物正丁醇萃取部分和三叶青乙醇提取物乙酸乙酯萃取部分。其中正丁醇萃取部位可以鉴定出结构的化合物有9种，分别为表没食子儿茶素、原花青素b2、儿茶素、表儿茶素、山奈酚-7-o-鼠李糖-3-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素-7-o-β-d-葡萄糖苷、山柰酚-3-0-芸香糖苷、山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷。乙酸乙酯萃取部位可以鉴定出结构的化合物有12种，分别为β-谷甾醇、山柰酚、5,7,4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、槲皮素、5,7,3′,5′-四羟基二氢黄酮、3,4-o-二咖啡酰奎宁酸乙酯、山奈酚-7-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素-7-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-新橙皮糖苷、芦丁、山奈酚-7-o-鼠李糖-3-o-葡萄糖苷，其中5,7,4′-三羟基-3′-甲氧基黄酮、5,7,3′,5′-四羟基二氢黄酮、3,4-o-二咖啡酰奎宁酸乙酯为首次从三叶青块根乙酸乙酯部位分离得到；另外几种化合物(主要为生物碱)因含量较少难以鉴别出结构。
rsv是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染最重要的病毒病原。近年来又发现rsv感染是免疫抑制成人和老年人的重要病原。绝大部分rsv感染为上呼吸道感染，但很多婴儿可发展为肺炎和下呼吸道感染。
hsv-1是可引起单纯疱疹脑炎(hse)的病毒。单纯疱疹脑炎是中枢神经系统最常见的病毒感染性疾病，见于世界各地，无季节性倾向，无性别差异，任何年龄均可发病，且病情险恶，病死率高。
技术实现要素：
为了克服上述不足，本发明提供三叶青提取物在制药中的新用途。三叶青在制备抗rsv的药物中的应用。三叶青在制备抗hsv-1的药物中的应用。所述三叶青的应用具体为：先将三叶青进行前处理，然后将前处理得到的三叶青提取物用于制备抗病毒的药物，如可将提取物与医学上可接受的辅料一起制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液制剂等，将提取物进一步纯化也可以制成注射制剂。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
三叶青乙醇提取物正丁醇提取部位或三叶青醇提物乙酸乙酯萃取部分在制备抗rsv的药物中的应用。
现代药理作用研究指出：三叶青具有抵抗病毒感染、调节自身免疫的药理活性。但由于三叶青的抗病毒作用机理尚未阐明、三叶青醇提物用不同溶剂萃取的活性部位种类繁多，现有的三叶青药物对特定病毒的抑制作用弱、针对性差。为此，本发明在深入研究三叶青的抗病毒作用机理的基础上，通过大规模实验筛选发现：三叶青醇提物正丁醇萃取部分或三叶青醇提物乙酸乙酯萃取部分对rsv和hsv-1均有显著的抑制作用。
优选的，所述三叶青醇提物正丁醇萃取部分的制备方法为：
取三叶青乙醇总提取物混悬液，用正丁醇萃取，萃取液减压浓缩，烘干至恒重，称重。
优选的，所述萃取过程中，采用加热超声法进行破乳。
优选的，所述正丁醇和三叶青乙醇总提取物混悬液的质量比为1：1。
优选的，所述三叶青乙醇总提取物的制备方法为：在料液比15：1，乙醇浓度为60wt％，先超声提取20min，再回流提取20min。
本发明还提供了三叶青乙醇提取物乙酸乙酯提取部位或正丁醇提取部位在制备抗hsv-1的药物中的应用。
优选的，所述三叶青醇提物乙酸乙酯萃取部分的制备方法为：
取三叶青乙醇总提取物混悬液，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，烘干至恒重，称重。
优选的，所述萃取过程中，采用加热超声法进行破乳。
优选的，所述乙酸乙酯和三叶青乙醇总提取物混悬液的质量比为1：1。
优选的，所述三叶青乙醇总提取物的制备方法为：在料液比15：1，乙醇浓度为60wt％，先超声提取20min，再回流提取20min。
本发明的有益效果
(1)本发明中三叶青提取物对rsv、hsv-1两种病毒均有显著的抑制作用，这提示三叶青不仅有活血散瘀、解毒、化痰的作用，而且在治疗rsv、hsv-1病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。本发明为三叶青临床用于治疗病毒感染性疾病提供实验依据，对研制抗rsv和hsv-1病毒的药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。
(2)本发明提取方法简单、抑制效率高、实用性强，易于推广。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1三叶青提取物对病毒的作用研究：
(1)制备三叶青提取物：
将干燥的三叶青块根捣成粗粉末，并用高速药物粉碎机粉碎为100目细粉末，将全部粉末分批用15倍量的60wt％乙醇加热超声提取20min，加热回流提取20min，将提取液过滤并减压浓缩，滤渣用同样方法提取2次，将浓缩后的提取液用水混悬，得到混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取(萃取溶剂与三叶青提取液混悬液的体积比在1.5：1)，萃取过程中产生的乳化层用加热超声的方法破乳，至提取液几乎无色后停止萃取，将萃取液各部分分别减压浓缩并干燥至恒重。
(2)细胞株与病毒株：
均由山东省医学科学院基础医学研究所微生物室提供：ma104(恒河猴胚胎肾细胞，为rsv及hsv-1敏感细胞)；rsv(呼吸道合胞病毒，long株，2000年10月引自中国预防医学科学院病毒所毒种室)，hsv-1(单纯疱疹病毒1型，f株，1996年引自山东医科大学微生物学教研室)。
(3)细胞毒性测定：
参照文献王小燕，张美英，王亚峰等，槟榔提取物体外抗柯萨奇病毒b3及单纯疱疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究，时珍国医国药，2008；19(12)：2954～2955的方法，点在96孔板上的细胞长成单层，将药物用细胞维持液从第1孔开始2倍比稀释12个浓度，接种在96孔板上，每个稀释度设重复3孔，在37℃、5％co2条件下培养，显微镜下观察其cpe，持续观察药物毒性。cpe大于50％视为毒性。然后用mtt染色，设定测定波长为570nm，测其od值，细胞存活率为实验组与细胞对照组od值相比结果，用reed-muench方法计算得到其半数中毒浓度(toxicconcentration50％，tc50)。tc50＝[antilog(log高于50％病变率药物稀释度的值－pd)]×c首孔药物浓度。
(4)抑毒试验：
参照文献王小燕，张美英，王亚峰等，槟榔提取物体外抗柯萨奇病毒b3及单纯疱疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究，时珍国医国药，2008；19(12)：2954～2955的方法，点在96孔板上的细胞长成单层，将药物用细胞维持液从第1孔开始2倍比稀释12个浓度，接种在96孔板上(50μl/孔)，每个稀释度重复3孔，设细胞对照、病毒对照，利巴韦林为阳性对照(10mg/ml)。除细胞对照外，各孔加100个tcid50的病毒50μl。37℃、5％co2条件下培养，显微镜下持续观察细胞病变，直至病毒对照cpe达到90％后终止培养。用酶标仪测定吸光度a值，cpe50％的稀释度视为药物半数有效浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)。ec50＝[antilog(log高于50％存活率药物稀释度的值－pd)]×c首孔药物浓度。根据所测药物半数中毒浓度(tc50)及药物半数有效浓度(ec50)，二者相比获得抑毒指数(ti)，ti大于4者判为有效。
(5)结果：
①药物半数中毒浓度tc50的测定：在显微镜下观察对照组细胞形态良好、贴壁生长致密。药物组细胞破碎、呈现中毒形态，测得od值，根据公式计算药物的tc50。
②药物抗病毒试验：显微镜下观察发现，对照组的细胞形态良好、贴壁致密；而rsv、hsv-1病毒对照组均在24h内出现90％以上的cpe，rsv在ma104中cpe以壁厚变圆，粘连破碎为主要特征；hsv-1在ma104中cpe以圆缩脱落为主，偶有融合为主要特征。
将试验的96孔板用5mg/mlmtt染色、在570nm处用酶标仪测吸光度值a，各组a值减掉病毒对照组a值后，各实验组a值与细胞对照组a值相比获得ec50，ec50与tc50相比获得ti：
a.抑制rsv在ma104细胞出现cpe效应(cytopathiceffect，cpe)，正丁醇部分抑毒指数ti为128，乙酸乙酯部分抑毒指数ti为64；
b.抑制hsv-1在ma104细胞发生cpe效应，正丁醇部分抑毒指数ti为64，乙酸乙酯部分抑毒指数ti为64。
实施例2
本实验通过对三叶青醇提物及其分别用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取得到的不同活性部位和正丁醇部位经大孔树脂分离的水洗脱部位和不同浓度乙醇洗脱部位(30％、50％、70％、95％)、以及制备液相分离纯化各阶段得到的样品和乙酸乙酯部位经硅胶柱层析、制备液相色谱分离纯化各阶段得到的样品进行抗病毒活性筛选，从而得到三叶青的抗病毒活性部位，为三叶青在抗病毒深入研究及阐明抗病毒作用机理，提供可靠的理论数据。
受试药物：
1～7:石油醚部分,2mg
1：石油醚：乙酸乙酯＝100:1洗脱
2：石油醚：乙酸乙酯＝50:1洗脱
3：石油醚：乙酸乙酯＝25:1洗脱
4：石油醚：乙酸乙酯＝15:1洗脱
5：石油醚：乙酸乙酯＝5:1洗脱
6：石油醚：乙酸乙酯＝2:1洗脱
7：石油醚：乙酸乙酯＝1:1洗脱
8～11：乙酸乙酯部分,2mg
8：甲醇：氯仿＝100：0洗脱
9：甲醇：氯仿＝100：15洗脱
10：甲醇：氯仿＝100：30洗脱
11：甲醇：氯仿＝100：45洗脱
12～16：正丁醇部分,20mg
12：水洗脱
13：30％乙醇洗脱
14：50％乙醇洗脱
15：70％乙醇洗脱
16：95％乙醇洗脱
17～21：水部位,20mg
17：水洗脱
18：30％乙醇洗脱
19：50％乙醇洗脱
20：70％乙醇洗脱
21：95％乙醇洗脱
病毒株
ev71：分离自济南市传染病医院手足口病患者，经全序列测定证实为ev71，本科室保存。
rsv：long株，2000年10月引自中国预防医学科学院病毒所毒种室，本科室保存。
hsv-1：f株，1996年引自山东医科大学微生物学教研室，本科室保存.
细胞株
ma104：恒河猴胚胎肾细胞，为rsv、hsv-1敏感细胞，本科室保存。
rd：人横纹肌瘤细胞，为ev71敏感细胞，本科室保存。
培养液
细胞培养液：1640细胞培养液，gibco产品，含10％新生牛血清及100u/ml青霉素和链霉素，过滤除菌，分装置4℃备用。
细胞维持液：1640细胞培养液，gibco产品，含2％新生牛血清及100u/ml青霉素和链霉素；mdck细胞维持液：1640细胞培养液，gibco产品，含100u/ml青霉素和链霉素；过滤除菌，分装置4℃备用。
pbs：ph7.2，含nacl8g、kcl0.2g、kh2po40.2g、na2hpo42.9g，加双蒸水至1000ml，过滤除菌，分装置4℃备用。
细胞消化液：胰酶(diffico公司产品)2.5g用1000mlpbs溶解，过滤除菌，分装青霉素瓶，置-20℃冰箱备用。
仪器
co2恒温培养箱：日本三洋公司产品；
生物安全柜：济南鑫贝西公司产品；
离心机：贺立氏台式低温离心机；
–80℃冰箱：thermo公司产品；
–20℃冰箱：中科美菱公司产品；
酶标仪：thermo公司产品。
耗材
细胞培养瓶：德国greiner葛莱娜产品，规格：75cm2。
除菌针头滤器：美国颇尔公司(pallcorporation)产品。孔径：0.22μm，直径13mm。
移液器：德国eppendorf产品，型号：20-200μl；100-1000μl。
移液器吸头：德国eppendorf产品，与移液器配套。
试验室：
bsl-2试验室。
药物体外抗病毒试验
具体的细胞毒性测定、抑毒试验方法同实施例1。
药物抑制病毒效果(ti)
80药重复实验hsv-1
进一步实验，通过对三叶青醇提物及其分别用正丁醇、乙酸乙酯和石油醚萃取得到的不同活性部位和正丁醇部位经大孔树脂分离的水洗脱部位和不同浓度乙醇洗脱部位(30％、50％、70％、95％)、以及制备液相分离纯化各阶段得到的样品和乙酸乙酯部位经硅胶柱层析、制备液相色谱分离纯化各阶段得到的样品进行抗病毒活性筛选，结果见表2，表3，表4。
表2三叶青醇提物正丁醇部分抗rsv病毒结果
表3三叶青醇提物正丁醇部分抗hsv-1病毒结果
乙酸乙酯部位用石油醚-乙酸乙酯(10:1～1:1)、乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，收集洗脱液并减压浓缩，用铺好的薄层硅胶板展开洗脱液，用紫外分析仪观察产生的荧光，指导合并相同或相近的组分，得到4个组分(sy6-sy9)，并做显色反应和抗病毒活性筛选。
表4三叶青醇提物乙酸乙酯部位抗病毒实验结果(ti)
基于以上实验结果，本发明特定选择正丁醇萃取部分或乙酸乙酯萃取部分用于抑制呼吸道合胞病毒(rsv)或抑制单纯疱疹病毒1型(hsv-1)；比较上述表格中ti可知，正丁醇萃取部分或乙酸乙酯萃取两部分与其他提取部分相比，抗病毒活性更强。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。