本发明属于生物医药领域，涉及一种柠檬苦素类提取物的制备方法，具体是涉及一种毛麻楝叶、小黄皮叶配方中柠檬苦素类提取物的制备方法。
背景技术：
柠檬苦素类似物（limonoids）是以柠檬苦素的化学结构为基本单位，包括有苦味的糖苷和无苦味的柠檬苦素 17-β-D-糖苷配体在内的一系列化合物，均称为柠檬苦素类似物，主要存在于芸香科（Rutaceae）和楝科（Meli-aceae）植物的组织中。现已分离得到 300 多种柠檬苦素类化合物。经研究表明，柠檬苦素的分子式为C26H30O8，分子量为 470.53。以苷元和糖苷两种形式存在，现已从柑橘属植物中分离出 38 种柠檬苦素类似物甙元及 20 种柠檬苦素类似物糖苷。大量动物实验表明，柠檬苦素类物质可以抑制由化学物质引起的肝癌、小肠癌、口腔癌、皮肤癌、结肠癌、乳腺癌和胃癌等病症，且作用强于抗癌药物他莫昔芬。国内外研究证实，柠檬苦素类化合物具有降低胆固醇、防止动脉粥样硬化、镇痛催眠、消炎抑菌、抗病毒、杀虫等作用。
毛麻楝叶：为系楝科楝属植物毛麻楝(Chukrasia tabularis var. velutina(Wall)King)的叶。毛麻楝，落叶乔木，树冠伞形，树姿开展。偶数羽状复叶，小叶10-18枚；小叶互生，纸质，卵状椭圆形，基部两侧不对称，两面被柔毛。圆锥花序顶生，花黄色带紫色，芳香。蒴果近球形或椭圆形，表面粗糙。花期春末夏初，果期秋季。
小黄皮叶：为芸香科小黄皮（Clausena emarginata Huang）的叶。性味：苦、辛，微温。有毒。功能主治宣肺止咳，行气止痛，通经活络。主治感冒头痛，风寒咳嗽，偏头痛，胃痛，神经痛，牙痛，风湿关节炎，跌打损伤。
国内外尚未见毛麻楝叶、小黄皮叶配方中柠檬苦素类提取物制备方法的相关文献或专利等报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供毛麻楝叶、小黄皮叶中柠檬苦素类提取物的一种制备方法。本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所用毛麻楝叶为楝科楝属植物毛麻楝(Chukrasia tabularis var. velutina(Wall)King)的叶；小黄皮叶为芸香科小黄皮（Clausena emarginata Huang）的叶。
柠檬苦素类提取物的制备方法，是通过如下步骤实现的:
（1）取毛麻楝叶7重量份、小黄皮叶4重量份，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，40℃提取6次，每次提取时间为4.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；
（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的甲酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，65℃提取3次，每次提取时间为5.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的13倍，滤过，合并甲酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；
（3）将步骤（2）甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比2:8的水-乙醇混合溶剂提取，55℃提取9次，每次提取时间为6小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的10倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；
（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，70℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的6倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；
（5）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比4:1混合均匀的MCI 凝胶-聚酰胺混合色谱柱，先用体积比5:95的甲醇-水洗脱，洗脱量为8个色谱柱体积，再用体积比25:75的甲醇-水洗脱，洗脱量为15个色谱柱体积，收集体积比25:75的甲醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；
（6）将步骤（3）得到的粗提物C，经过重量份数比6:4混合均匀的HPD100大孔吸附树脂-NKA9大孔吸附树脂混合树脂柱，先用体积比6:94的乙醇-水洗脱，洗脱量为3个树脂柱体积，再用体积比45:55的乙醇-水洗脱，洗脱量为4个树脂柱体积，收集体积比45:55的乙醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；
（7）按重量比3:1将步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。
本技术方案的柠檬苦素类提取物同时含有：老虎楝素B、新贝格木素A、新贝格木素B、山楝体G，且老虎楝素B、新贝格木素A、新贝格木素B、山楝体G的重量比例为6:2:4:1。
本发明首次对毛麻楝叶、小黄皮叶配方中柠檬苦素类提取物提取制备，采用MCI 凝胶-聚酰胺混合色谱柱、混合树脂柱相结合的方法，制备得到同时含有老虎楝素B、新贝格木素A、新贝格木素B、山楝体G的重量比例为6:2:4:1的柠檬苦素类提取物。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对毛麻楝叶、小黄皮叶中柠檬苦素类提取物的制备方法做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：柠檬苦素类提取物的制备
（1）取毛麻楝叶7kg、小黄皮叶4kg，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，40℃提取6次，每次提取时间为4.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；
（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的甲酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，65℃提取3次，每次提取时间为5.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的13倍，滤过，合并甲酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；
（3）将步骤（2）甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比2:8的水-乙醇混合溶剂提取，55℃提取9次，每次提取时间为6小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的10倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；
（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，70℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的6倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；
（5）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比4:1混合均匀的MCI 凝胶-聚酰胺混合色谱柱，先用体积比5:95的甲醇-水洗脱，洗脱量为8个色谱柱体积，再用体积比25:75的甲醇-水洗脱，洗脱量为15个色谱柱体积，收集体积比25:75的甲醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；
（6）将步骤（3）得到的粗提物C，经过重量份数比6:4混合均匀的HPD100大孔吸附树脂-NKA9大孔吸附树脂混合树脂柱，先用体积比6:94的乙醇-水洗脱，洗脱量为3个树脂柱体积，再用体积比45:55的乙醇-水洗脱，洗脱量为4个树脂柱体积，收集体积比45:55的乙醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；
（7）按重量比3:1将步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。
实施例2：柠檬苦素类提取物的制备
（1）取毛麻楝叶6kg、小黄皮叶5kg，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，40℃提取6次，每次提取时间为4.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；
（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的甲酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，65℃提取3次，每次提取时间为5.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的13倍，滤过，合并甲酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；
（3）将步骤（2）甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比2:8的水-乙醇混合溶剂提取，55℃提取9次，每次提取时间为6小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的10倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；
（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，70℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的6倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；
（5）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比4:2混合均匀的MCI 凝胶-聚酰胺混合色谱柱，先用体积比5:95的甲醇-水洗脱，洗脱量为8个色谱柱体积，再用体积比25:75的甲醇-水洗脱，洗脱量为15个色谱柱体积，收集体积比25:75的甲醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；
（6）将步骤（3）得到的粗提物C，经过重量份数比6:5混合均匀的HPD100大孔吸附树脂-NKA9大孔吸附树脂混合树脂柱，先用体积比6:94的乙醇-水洗脱，洗脱量为3个树脂柱体积，再用体积比45:55的乙醇-水洗脱，洗脱量为4个树脂柱体积，收集体积比45:55的乙醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；
（7）按重量比1:1将步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。
实施例3：柠檬苦素类提取物的制备
（1）取毛麻楝叶3kg、小黄皮叶4kg，混匀，粉碎，过20目筛，用石油醚为溶剂，40℃提取6次，每次提取时间为4.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的12倍，滤过，合并石油醚提取液，减压回收石油醚，浓缩干燥得粗提物A，石油醚提取后的药渣备用；
（2）将步骤（1）石油醚提取后的药渣，用体积比1:6的甲酸乙酯-甲醇混合溶剂提取，65℃提取3次，每次提取时间为5.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的13倍，滤过，合并甲酸乙酯-甲醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物B，甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣备用；
（3）将步骤（2）甲酸乙酯-甲醇提取后的药渣，用体积比2:8的水-乙醇混合溶剂提取，55℃提取9次，每次提取时间为6小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的10倍，滤过，合并水-乙醇提取液，减压回收溶剂，浓缩干燥得粗提物C，水-乙醇提取后的药渣备用；
（4）将步骤（3）水-乙醇提取后的药渣，用水提取，70℃提取2次，每次提取时间为1.5小时，每次溶剂用量为毛麻楝叶、小黄皮叶总重量的6倍，滤过，合并水提取液，减压浓缩至浸膏，干燥得粗提物D；
（5）将步骤（2）得到的粗提物B，经过重量份数比4:5混合均匀的MCI 凝胶-聚酰胺混合色谱柱，先用体积比5:95的甲醇-水洗脱，洗脱量为8个色谱柱体积，再用体积比25:75的甲醇-水洗脱，洗脱量为15个色谱柱体积，收集体积比25:75的甲醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物E；
（6）将步骤（3）得到的粗提物C，经过重量份数比6:7混合均匀的HPD100大孔吸附树脂-NKA9大孔吸附树脂混合树脂柱，先用体积比6:94的乙醇-水洗脱，洗脱量为3个树脂柱体积，再用体积比45:55的乙醇-水洗脱，洗脱量为4个树脂柱体积，收集体积比45:55的乙醇-水洗脱液合并，回收溶剂，干燥得提取物F；
（7）按重量比2:1将步骤（5）得到的提取物E与步骤（6）得到的提取物F混匀，即得柠檬苦素类提取物。
实验例1：总柠檬素含量测定
采用高效液相色谱－蒸发光散射方法，分析柠檬苦素类提取物中柠檬苦素类成分的含量。采用YMC-Pack C18( 150 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱，以流动相甲醇-水-四氢呋喃( 49:46:5) 进行洗脱，流速 1.0mL/min，柱温25℃；采用蒸发光散射检测器，漂移管温度91.0℃，载气流速2.0L/min。结果表明，实施例1提取物所得柠檬苦素类成分含量占总提取物的75%，且老虎楝素B、新贝格木素A、新贝格木素B、山楝体G的重量比例为6:2:4:1。
表1 提取物中柠檬苦素类成分及含量
实验例2：柠檬苦素类成分结构鉴定
按实施例1方法制备柠檬苦素类提取物，再经200-300目硅胶柱层析，先以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.3-1:6），再用乙酸乙酯-甲醇（10:0-3:1）梯度洗脱薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，乙酸乙酯或丙酮重结晶，分别得到化合物1、化合物2、化合物3、化合物4，均为白色无定形粉末，以上各化合物的化学结构经质谱和核磁共振等波谱手段确证为：老虎楝素B（trichiconin B）、新贝格木素A（libiguin A）、新贝格木素B（libiguin B）、山楝体G（aphanamixoid G），纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
实验例3：柠檬苦素类提取物HPLC-MS分析
样品溶液制备：实施例1柠檬苦素类提取物，用甲醇制备供试品溶液，用0.45um有机微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
标准品溶液的制备：取自制的老虎楝素B、新贝格木素A、新贝格木素B、山楝体G，加甲醇适量，作为标准品溶液。
仪器：德国Thermo Fischer Scientific高分辨液相色谱质谱联用仪。
色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱（5μm，250mm*4.6mm），柱温：25℃，流速800μl/min，检测波长：550nm，进样体积：5ul。流动相：以乙腈为流动性A，以0.1%氨水为流动性B，进行梯度洗脱；
质谱条件：LTQ-Orbitrap XL型质谱，ESI离子源，鞘气50arb，毛细管温度275℃，辅助气10arb，毛细管电压25V，喷雾电压4.0kV。正离子模式扫描，m/z扫描范围100~1000。
结果：标准品和样品一级，二级总离子流分别吻合，结合一级，二级质谱，分子离子峰及碎片峰，鉴定出总柠檬苦素类提取物含有老虎楝素B、新贝格木素A、新贝格木素B、山楝体G共4个主要柠檬苦素类化合物。