纳米载药系统、其制备方法、药物组合物及在治疗癌症中的应用与流程

本发明涉及一种纳米药物，尤其涉及一种共包载的纳米药物。

背景技术：

肿瘤已成为世界性的公共卫生问题，严重威胁人们的健康。最新统计数据表明，2017年，美国新增肿瘤患者数量将达到169万，因肿瘤死亡人数也将增至60万。而在中国，据统计，2015年新增肿瘤患者数量达到430万，因肿瘤死亡人数亦达到281万。随着人口老龄化的加剧、生态环境的恶化以及生活方式的改变(吸烟、肥胖等)，以上数据仍呈逐年上升趋势。卫生部统计结果表明，自2010年以来，肿瘤已取代心血管疾病，跃升成为中国居民的首要死因。

化疗是目前治疗肿瘤最有效的手段之一，和手术、放疗一起并称肿瘤的三大治疗手段。手术和放疗属于局部治疗，只对治疗部位的肿瘤有效，对于潜在的转移病灶和已经发生临床转移的癌症就难以发挥有效治疗。而化疗是一种全身治疗的手段，无论采用什么途径给药(口服、静脉和体腔给药等)，化疗药物都会随着血液循环遍布全身的绝大部分器官和组织。因此，对一些有全身播撒倾向的肿瘤及已经转移的中晚期肿瘤，化疗都是主要的治疗手段。

阿霉素(doxorubicin,dox)是临床常用的蒽环类抗肿瘤化疗药物，可抑制rna和dna的合成，对rna的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。

上皮间质化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)现象最早发现于胚胎发育过程中，在emt进程中，细胞逐渐丧失极性，细胞间粘附能力减弱，表现出间质细胞表型，细胞迁移能力增强(radiskyd.epithelial-mesenchymaltransition.jcellsci,2008,68(23):9574-9583.)。随着研究的不断深入，研究者们发现，肿瘤细胞亦会发生emt(thieryj.,acloqueh.,huangr.,etal.epithelial-mesenchymaltransitionsindevelopmentanddisease.cell,2014,139(5):871-883.)。emt是肿瘤发生发展过程中的标志性事件之一，肿瘤细胞emt程度的加剧往往伴随着肿瘤细胞耐药性增加、干性增强及侵袭转移能力提升等现象的发生(hanahand.,weinbergr.hallmarksofcancer:thenextgeneration.cell,2011,144(5):646-674.；nietom.,huangr.,jacksonr.,etal.emt:2016.cell,2016,166(1):21-45.)。

然而，近年来的大量研究结果表明，肿瘤细胞经化疗刺激后更易发生emt。fanj.等发现，4t1细胞经dox处理后，波形蛋白(vimentin)上调、e-钙粘蛋白(e-cadherin)下调，表现出更多间质细胞表型(fanj.,zhengd.,rongl.,etal.targetingepithelial-mesenchymaltransition:metalorganicnetworknano-complexesforpreventingtumormetastasis.biomaterials,2017,139(3):116-126.)。fangs.等将骨肉瘤细胞u2os经过顺铂给药后，肿瘤细胞的emt进程加剧(fangs.,lingy.,meih.,etal.cisplatinpromotesmesenchymal-likecharacteristicsinosteosarcomathroughsnail.oncollett,2016,12(6):5007-5014.)；kajiyamah.等发现经紫杉醇处理后的卵巢癌细胞emt进程加剧，侵袭转移能力增强(kajiyamah.,shibatak.,terauchim.,etal.chemoresistancetopaclitaxelinducesepithelial-mesenchymaltransitionandenhancesmetastaticpotentialforepithelialovariancarcinomacells.intjoncol,2007,31(2):277-283.)。

因此，存在着消除或缓解体内使用化疗药物时所引起的emt程度加剧、易发生侵袭转移的需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服或减轻化疗药物，具体为体内给药dox时所导致的emt程度加剧，易发生侵袭转移的问题，以更好地发挥化疗药物，特别是dox的治疗效果。

在本发明的第一个方面，提供了一种共包载的纳米载药系统，包括：纳米载体，以及共包载在所述纳米载体中的tgf-β抑制剂和dox。

在一个实施方式中，所述tgf-β抑制剂选自由sb505124、ly364947、ly2109761和ly2157299所组成组中的至少一种，优选为ly2157299。

在一个实施方式中，所述纳米载体为脂质体或能形成胶束的聚合物；所述纳米载体优选为两亲性纳米载体，例如，经peg或hes修饰的纳米载体，更优选为hes与pla共聚物，最优选为hes的pla接枝共聚物。

在一个实施方式中，所述tgf-β抑制剂的量约为5wt％至30wt％，优选地，所述tgf-β抑制剂的量约为10wt％至20wt％，所述dox的量为2wt％至3wt％；更优选地，所述tgf-β抑制剂的量为14wt％至16wt％。

在一个实施方式中，所述dox的量约为1.5wt％至5wt％；优选地，所述dox的量约为2wt％至3wt％；更优选地，所述dox的量约为2.1wt％至2.7wt％。

在一个实施方式中，所述tgf-β抑制剂与dox的载药量之比约为3:1至10:1，优选约为5:1至8:1，最优选约为5.2:1至7.6:1。

在优选的实施方式中，所述tgf-β抑制剂和dox均为亲水形式，或均为疏水形式。

在更优选的实施方式中，所述tgf-β抑制剂和dox均为疏水形式。

在本发明的第二个方面，提供了一种制备本发明的纳米载药系统的方法，包括以下步骤：

1)提供纳米载体溶液；

2)提供dox和tgf-β抑制剂溶液a；

3)混合纳米载体溶液和溶液a并乳化。

在一个具体实施方式中，制备本发明的纳米载药系统的方法包括以下步骤：

1)制备纳米载体溶液；

2)制备dox溶液；

3)将tgf-β抑制剂加入到步骤2)中的溶液中并混匀，得到溶液a；

4)将溶液a滴加至步骤1)中纳米载体溶液中，同时进行乳化；

5)对乳化后的溶液进行匀质，得到共包载有tgf-β抑制剂和dox的纳米载药系统。

6)任选地，进行纯化和/或干燥。

在一个优选的实施方式中，步骤2)中的dox为疏水性的。

在一个优选的实施方式中，步骤2)中的dox溶液为dox三氯甲烷溶液。

本发明的第三个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明的纳米载体系统。

在某些实施方式中，通过将本发明的药物组合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合，制备用于储存和使用的制剂。

本发明的第四个方面，提供了一种药物套系，包括res巨噬细胞阻塞材料和本发明的纳米载药系统。

在一个优选的实施方式中，所述res巨噬细胞阻塞材料是接枝率为1～2，优选为1.4～1.8，更优选为1.62的羟乙基淀粉hes的聚乳酸pla接枝共聚物形成的纳米颗粒。

本发明的第五个方面，提供了本发明的纳米载药系统，或本发明的药物组合物，后本发明的药物套系在制备治疗癌症的药物中的用途。

本发明的纳米系统在体内给药时能够达到最佳的抑制肿瘤的emt进程，阻止肿瘤的侵袭转移效果；本发明的纳米载药系统有利于dox与tgf-β抑制剂同步到达同一肿瘤区域，发挥药效。

附图说明

图1示出了纳米粒表征结果，(a)dox/ly@hes-pla纳米粒水化直径；(b)通过电镜表征dox/ly@hes-pla纳米粒形貌照片；(c)通过原子力显微镜表征dox/ly@hes-pla纳米粒形貌：ⅰ,纳米粒形貌照片；ⅱ,纳米粒高度图；(d)hes-pla、dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla纳米粒zeta电位；(e)dox/ly@hes-pla纳米粒在pbs及10％fbs1640培养基中的稳定性；

图2为dox/ly@hes-pla纳米粒在不同释药介质中的释药行为曲线图；

图3示出了4t1细胞经不同浓度dox、dox+ly、dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla孵育后的存活率，a：孵育24小时；b孵育48小时；误差棒，均值±sem，重复四次(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；

图4示出了体外实验中，4t1细胞经不同浓度ly2157299孵育24h及48h后的存活率；误差棒，均值±sem，重复四次；

图5示出了体外实验中，经不同药物处理48h后，4t1细胞的侵袭转移能力：(a)各组4t1细胞的侵袭能力的显微图像；(b)各组4t1细胞的相对侵袭数；(c)各组4t1细胞的转移能力的显微图像；(d)各组4t1细胞的相对转移数；误差棒，均值±sem，重复三次(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；

图6示出了荷瘤鼠分别注射游离dox、dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla，24h后，各组织中dox的分布情况；误差棒，均值±sem，重复六次(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；

图7示出了体内实验中，经不同药物给药后，小鼠皮下瘤生长曲线，黑色箭头指示给药时间；误差棒，均值±sem，重复六次(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；

图8示出了体内实验中各组肿瘤重量；误差棒，均值±sem，重复六次(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；

图9示出了体内实验中，最终剥取得到的各组肿瘤照片；

图10示出了体内实验中各组药物对肿瘤侵袭转移的抑制作用，(a)各组小鼠肺脏湿重；(b)各组小鼠肺部节结数；(c)各组小鼠典型肺部照片，虚线圆圈为肿瘤结节；(d)各组小鼠肺部切片h&e染色结果，虚线圆圈为肿瘤区域；*p<0.05；**p<0.01；

图11为dox及n-钙粘蛋白在肿瘤内的分布情况，ⅰ区域为dox荧光较强区域；ⅱ区域为dox荧光较弱区域；ⅲ区域为基本无dox荧光区域；随机绘制一条直线穿过ⅰ、ⅱ及ⅲ区域，通过imagej对该直线上各点的红色及绿色荧光信号进行定量分析，各组结果如最右列所示；

图12为dox及e-钙粘蛋白在肿瘤内的分布情况，ⅰ区域为dox荧光较强区域；ⅱ区域为dox荧光较弱区域；ⅲ区域为基本无dox荧光区域；随机绘制一条直线穿过ⅰ、ⅱ区域，通过imagej对该直线上各点的红色及绿色荧光信号进行定量分析，各组结果如最右列所示；

图13为药物生物相容性评价结果，(a)给药结束后，各组小鼠血液中ck含量；(b)给药结束后，各组小鼠血液中ldh含量；(c)给药期间记录各组小鼠体重，以各组小鼠初始体重为基数将各组小鼠体重归一化得到的小鼠体重变化曲线图，误差棒，均值±sem，重复六次(**p&lt;0.01；***p&lt;0.001)；

图14为药物生物相容性评价结果，给药结束后，取各组小鼠心、肝、脾及肾，包埋切片后h&e染色，通过显微镜观察记录切片形态结构。红色箭头所示为心肌细胞受损及炎症细胞浸润位置；

图15为通过检测各组小鼠血常规指标，评价药物生物相容性的结果，(a)各组小鼠血液中红细胞数；(b)各组小鼠血液中白细胞数；(c)各组小鼠血液中血小板数目；误差棒，均值±sem，重复六次(**p&lt;0.01；***p&lt;0.001)。

具体实施方式

目前，消除或缓解体内给药dox时所导致的emt程度加剧、易发生侵袭转移的问题已引起人们的关注。其中，令人感兴趣的是，bandyopadhyaya.等(bandyopadhyaya.,wangl.,agyinj.,etal.doxorubicinincombinationwithasmalltgf-βinhibitor:apotentialnoveltherapyformetastaticbreastcancerinmousemodels.plosone,2010,5(4):10034-10046.)报道了化疗药物dox在人乳腺癌细胞或鼠乳腺癌细胞中激活转化生长因子β(tgfβ)信号，而tgfβ1型受体激酶抑制剂(tβri-ki)可在体外显著抑制dox诱导的emt；并研究了转移性乳腺癌模型中tβri-ki与dox联用的潜在协同的抗肿瘤活性，发现与单独处理相比，dox与tβri-ki的组合在4t1原位异种转移模型中增强了dox在减少肿瘤生长和肺转移中的功效。

然而，本发明人在进一步研究中却意外地发现：与bandyopadhyaya.等的报道不同，虽然在体外实验中，取得了类似的结果，即dox与一种小分子tgfβ抑制剂ly2157299联合给药组相对于dox单独给药组表现出更强4t1的杀伤作用(见以下详述的实施例5及图3a和图3b)，但是在施用于4t1荷瘤小鼠体内的情况下，联合给药组与dox单独给药组相比，在减小肿瘤体积方面并没有显著性差异(见以下详述的实施例9及图7)。在上述结果的基础上，发明人进一步从肿瘤重量、肿瘤大小和小鼠生存期方面进行研究，结果表明联合给药组与dox单独给药组间仍无显著差异(见以下详述的实施例9、图8～9及表1)。

类似地，在评价肿瘤侵袭转移的过程中，也发现同样的问题，即：在体外实验中，联合给药组可以使4t1细胞侵袭转移能力相对于dox单独给药组显著减低(见以下详述的实施例6及图5b和图5d)；而在体内评价对肿瘤侵袭转移的抑制作用时，实验结果表明联合给药组与dox单独给药组在肺部结节数方面也无明显差异(见以下详述的实施例10及图10b)。

在大量实验的基础上，本发明人意外地发现了：与bandyopadhyaya.等的报道中给出的教导不同，在体内施用的情况下，dox与tgfβ抑制剂联合给药组实际上并未取得与体外实验相符合的抑制肿瘤生长和侵袭转移的效果。也就是说，虽然理论上dox与tgfβ抑制剂的联合给药应当能够抑制肿瘤侵袭转移，然而体内实验表明，这种联合给药实际上并没有产生如bandyopadhyaya.等的报道中声称的效果。

值得注意的是，bandyopadhyaya.等的报道中指出：体内实验首次表明了dox与tgfβ拮抗剂同时治疗以改善对肿瘤生长和肺/骨转移中的好处(见该文献第2页左栏第2段)；与(dox)单独处理相比，dox与tgfβ抑制剂的联合处理在体内已经有效地增强了对小鼠4t1细胞的肿瘤生长的抑制和自发性肺转移的抑制(见该文献第5页左栏第2段至右栏第1段及图6)。这实际上传达了一种错误信息，即dox与tgfβ抑制剂联用能够有效抑制肿瘤侵袭转移，而事实并非如此。

此外，从bandyopadhyaya.等报道的图6c中可以看出当使用高剂量的dox(8mg/kg)与tβri-ki联用时，对体内肺转移的抑制要优于低剂量的dox(4mg/kg)tβri-ki联用的情况，也就是说，似乎提高dox的用量可取得更好的抑制转移的效果。而本发明人的研究发现，dox的剂量并不是促进体内协同作用发挥的决定因素。

在经过大量工作的基础上，本发明人确证dox与tgfβ抑制剂联合给药存在并不能更有效抑制肿瘤生长及无法有效抑制肿瘤侵袭转移的问题。经过进一步探究出人意料地发现，dox与tgfβ抑制剂同步到达同一肿瘤区域是获得协同效果的先决条件。

为此，本发明提供一种共包载的纳米载药系统，该系统为以一定比例共包载了dox和tgfβ抑制剂的纳米颗粒，从而实现了两种药物同步到达同一肿瘤区域并能够同步从载体中释放，观察到与dox和tgfβ抑制剂联用使用但单独给药的情况相比明显改善的抑瘤效果和抑制肿瘤侵袭转移的效果，证实了本发明的纳米载药系统的同步递送和同步释放能够发挥出dox和tgfβ抑制剂的协同效果。

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

dox

dox是一种抗肿瘤抗生素，可抑制rna和dna的合成，对rna的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。

临床上用于治疗急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。

已上市的dox为其盐酸盐形式。

tgf-β抑制剂

转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β，tgf-β)在肿瘤细胞的上皮间质化过程中起着非常重要的作用：tgf-β可通过与肿瘤细胞表面受体结合，激活胞内smad通路，下调e-钙粘蛋白的表达，上调n-钙粘蛋白、波形蛋白等蛋白的表达，促进细胞emt进程。而通过tgf-β受体小分子抑制剂阻断smad信号通路的激活，可有效抑制肿瘤的侵袭转移。

本发明中tgf-β小分子抑制剂可选自由sb505124、ly364947、ly2109761和ly2157299所组成组中的至少一种，优选ly2157299。

在一个实施方式中，本发明的tgf-β抑制剂为疏水性的。

纳米载体

“纳米载体”是指可负载药物活性成分形成尺寸在1～1000nm之间的微小粒子的有机或无机载体。在该尺度下，微粒会表现出一些独特的理化性质。合适粒径的纳米粒子在体内具有epr(高通透性和滞留)效应，可通过该效应被动靶向至肿瘤区域。因此，开发合适的纳米载药系统也是癌症治疗药物的一个热点。已开发出一系列纳米载体来向体内递送药物。纳米载体的粒径、亲疏水性、表面电荷、可变形性、靶向修饰等性质及负载药物可能会影响纳米粒子在体内传输过程中的命运及最终疗效。

本发明对纳米载体没有特别的限制，只要能够对dox和tgfβ抑制剂共包载，并能够同步释放的可药用纳米载体都可用于本发明。纳米载体可以是诸如脂质体或能形成胶束的聚合物，如peg、羟乙基淀粉(hydroxyethylstarch,hes)、hes与聚乳酸(polylacticacid,pla)的共聚物。

在一个实施方式中，所述纳米载体可为两亲性聚合物纳米载体。

如本文所使用的，术语“两亲性纳米载体”是指纳米载体外围为亲水部分，内部为疏水部分；其中，亲水层有利于纳米载体均一稳定地分散于水溶液中，疏水核心可有效负载疏水性药物。

适用于本发明的两亲性纳米载体可以是，例如经peg或hes修饰的纳米载体，优选为hes与pla的共聚物(如接枝共聚物或嵌段共聚物)等，但不限于此。

peg由环氧乙烷或乙二醇聚合而成，分子结构稳定，具有高度的亲水性，且无毒，无免疫原性，生物相容性良好，是少数几种已被fda批准可用作体内注射药用的聚合物之一。

在本发明一个实施方式中，可通过peg包覆纳米粒的表面来进行纳米载体外围的亲水性修饰。

hes是玉米来源的高分支支链淀粉经由酸水解再羟乙基化后所获得的产物，其具有良好的生物相容性、水溶性及生物可降解性，高度支化的hes在体内循环过程中更加稳定，随取代度的增加。此外，hes可被血液中的α-淀粉酶降解，具有更优的生物相容性。

适宜的hes的分子量可为70～480kda，优选70kda～250kda，更优选70kda，其中，羟乙基取代度为0.5。

在本发明另一个实施方式中，可通过hes包覆纳米粒表面的来进行纳米载体外围的亲水性修饰。

在一个具体的实施方式中，纳米载体为hes-pla接枝共聚物。

pla属于是聚酯家族中的一员，它是一种新型的生物基及可生物降解材料。pla是以乳酸为主要原料聚合得到的聚合物，原料来源充分而且可以再生，主要以玉米、木薯等为原料。pla的生产过程无污染，而且产品可以生物降解，是一种理想的绿色高分子材料。

本发明的pla分子量为10～30kda，10～20kda，更优选为10kda。

hes-pla接枝共聚物可具有如下的通式(i)：

其中，n在300至3000之间，m在70至300之间；优选地，n在300至1000之间，m在70至150之间，更优选n在300至500之间，m在70至100之间。在一个具体实施方式中，n为390，m为70。

所述pla在hes上的接枝率为0.5～1，优选为0.7～0.95，更优选为0.8～0.9。在一个具体实施方式中，接枝率为0.86。

hes-pla接枝共聚物的制备方法可参照例如公开在专利申请cn103467753a中的方法，该文献通过引用全文合并于本文。

根据一个优选的实施方式，本发明的以hes-pla接枝聚合物为载体的纳米载药系统的制备方法包括：

具体包括如下步骤：

(1)溶解pla并活化其末端羧基：向端羧基的pla中加入催化剂n-n’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，以无水二甲亚砜作为溶剂，50～70℃下反应25～45分钟，使其完全溶解，得到端羧基活化的pla；所述pla的分子量为10～30kda，优选为10kda，所述pla、n-n’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶的投料摩尔比为1:4:2；

(2)溶解hes：氮气保护条件下，在50～70℃下将分子量为70kdahes充分溶解于无水二甲亚砜中，得到hes的二甲亚砜溶液；所述hes的分子量为70～480kda，优选70kda，羟乙基的取代度为0.5；

(3)酯化反应：将步骤(1)得到的端羧基活化的pla与步骤(2)得到的hes的二甲亚砜溶液混合，发生酯化反应，在氮气保护下，50～70℃下反应24～36小时，纯化后得到所述两亲性hes偶联pla共聚物，其中所述pla与hes的投料摩尔比为1:4～1:7。

共包载纳米载药系统

如本文所使用的，“共包载”是指两种以上物质共同包裹运送。

根据本发明的共包载纳米载药系统包括纳米载体，以及共包载在所述纳米载体中的tgf-β抑制剂和dox。

在一个实施方式中，本发明的共包载纳米载药系统粒径为100nm～200nm，优选为140～170nm，更优选为150～160nm。在一个具体实施方式中，纳米载药系统的粒径为155nm。在此粒径范围，能够形成对药物的有效包裹，并且纳米颗粒更易于在体内递送，而能够尽量避免被巨噬细胞吞噬，因为巨噬细胞更容易识别出尺寸较大的颗粒。

在一个实施方式中，基于共包载纳米载药系统的总重量，所述tgf-β抑制剂的载药量为5wt％至30wt％，优选为10wt％至20wt％，更优选为14wt％至16wt％，具体地例如，约14wt％、约15wt％或约16wt％。

在一个实施方式中，基于共包载纳米载药系统的总重量，所述dox的载药量为1.5wt％至5wt％，优选为2wt％至3wt％，更优选为2.1wt％至2.7wt％，例如，约2.1wt％、约2.4wt％或约2.7wt％。

在一个实施方式中，所述tgf-β抑制剂与dox的重量比为3:1至10:1，优选为5:1至8:1，最优选为5.2:1至7.6:1，例如，约5.4:1、约5.6:1、约5.8:1、约6.0:1、约6.2:1、约6.4:1、约6.6:1、约6.8:1、约7.0:1、约7.2:1或约7.4:1。

取决于不同的纳米载体，本发明的tgf-β抑制剂和dox可均为亲水形式，或可均为疏水形式，以利于共同包载。根据优选的实施方式，本发明的tgf-β抑制剂和dox均为疏水形式。

本发明的共包载纳米载药系统优选为电中性的。

如本文中所使用的，“电中性”是指zeta-电位值为小于2mv且大于-2mv，例如，小于1.5mv且大于-1.5mv，小于1.0mv且大于-1.0mv，小于0.5mv且大于-0.5mv，但本发明不限于此。

在本文的“电中性”情况下，体内传输过程中更不易被res非特异性吞噬，更有利于药物的递送。

共包载纳米载药系统的制备

本发明还提供了用于制备本发明的纳米载药系统方法，包括以下步骤：

1)提供纳米载体溶液；

2)提供dox和tgf-β抑制剂溶液a；

3)混合纳米载体溶液和溶液a并乳化。

本发明的制备方法不限于按照以上列出的步骤顺序进行，其中一些步骤可以调换顺序，或者一些步骤可以合并为一个步骤或拆分为两个或更多个步骤。

在一个示例性实施方式中，本发明的制备方法包括：

1)制备纳米载体溶液；

2)制备dox溶液；

3)将tgf-β抑制剂加入到步骤2)中的溶液中并混匀，得到溶液a；

4)将溶液a滴加至步骤1)中纳米载体溶液中，同时进行乳化；

5)对乳化后的溶液进行匀质，得到共包载有tgf-β抑制剂和dox的纳米载药系统；

6)任选地，进行纯化和/或干燥。

在该实施方式中，本发明的制备方法不限于按照以上列出的步骤顺序进行，其中一些步骤可以调换顺序，或者一些步骤可以合并为一个步骤。例如步骤1)可在步骤3)之后进行。再如步骤2)也可以是制备tgf-β抑制剂溶液和3)可以是将dox加入tgf-β抑制剂溶液中，或者步骤2)和3)可以为将dox和tgf-β抑制剂分别制备成合适的溶液，然后再将两种溶液按一定比例混合。这些是本领域技术人员根据本发明的示例，容易按实际需要进行的变形。这些方案同样包括在本发明的范围内。

根据优选的实施方式，纳米载体溶液为水性溶液，更优选为水溶液。

纳米载体如前文所定义。

在一个实施方式中，制备过程中所使用的dox与tgf-β抑制剂的原料质量比为1:1～1:3，优选约为1:2。

商购dox通常以亲水性的盐酸盐形式存在，而tgf-β抑制剂通常为疏水性药物，两者亲疏水性的差异使得将它们共包载于两亲性纳米载体较为困难。因此，本发明中使用脱盐酸的疏水性dox，从而与同为疏水性的tgf-β抑制剂共同溶解，以更有利于共包载。

根据一种实施方式，在步骤2)制备dox溶液之前对dox盐(如dox盐酸盐)进行脱去盐(如脱盐酸)的步骤。

根据一种实施方式，dox溶液所用的溶剂是能够良好溶解dox及tgf-β抑制剂的有机溶剂，并且对后续步骤无不利影响。在本发明中，tgf-β抑制剂的常用溶剂dmso经实验并不利于纳米颗粒的形成，经筛选发现三氯甲烷有利于制备共包载的纳米载药系统。

因此，在一个优选的实施方式中，dox溶液为dox三氯甲烷溶液。

药物组合物

本发明的药物组合物包括根据本发明的纳米载体系统。

术语“剂型”是指药物或药物组合物的特定形式，并取决于给药途径。例如，剂型可以是用于雾化的液体形式(如用于吸入)，片剂或液体(如用于口服递送)或盐溶液(如用于注射)。

在某些实施方式中，通过将本发明的药物组合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合，制备用于储存和使用的制剂。

本发明的药物组合物可以以任何数量方式进行局部或全身治疗。给药可以是局部给药(例如，阴道和直肠的粘膜递送)；肺部给药(例如，通过吸入或吹入气雾剂，包括通过雾化器；气管内、鼻内、表皮和经皮)；口服给药；或肠胃外给药，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输液；或颅内给药(例如，鞘内)。

在一个优选的实施方式中，本发明的药物组合物的给药方式为静脉注射。

合适的药学上可接受的载体包括但不限于：无毒缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂；碳水化合物，如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖如蔗糖、甘露糖醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物；以及非离子表面活性剂。

用途

依据本发明的纳米载药系统的有益效果，还提供了本发明的纳米载药系统在治疗癌症的中的用途。其中，癌症包括但不限于：急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。

在另一个实施方式中，本发明的纳米载药系统可用于抑制肿瘤侵袭转移。

在又一个实施方式中，本发明的纳米载药系统可用于抑制肿瘤，抑制肿瘤可以反应为肿瘤体积的减小、肿瘤重量的降低或受试者中位生存期的延长。

此外，还提供了本发明的纳米载药系统在制备治疗癌症的药物中的用途。

利用resblockade策略的肿瘤多步疗法

“resblockade策略”是指先通过较大粒径的纳米粒饱和巨噬细胞，再给药纳米药物，以此减少巨噬细胞对后续纳米药物的吞噬。

“网状内皮系统(res)巨噬细胞阻塞材料”是指本领域已知的任何可以阻塞res巨噬细胞以在一定程度上阻止res对纳米药物的非特异性摄取的材料。res巨噬细胞阻塞材料的例如但不限于硅球(如二氧化硅)、碳基材料、脂质体、乳胶微球、氯化钆、葡聚糖硫酸酯。

在又一方面，本发明提供了一种基于resblockade策略的肿瘤多步疗法药物套系，包括res巨噬细胞阻塞材料，和以上定义的本发明的纳米载药系统或药物组合物。优选的，所述res巨噬细胞阻塞材料为具有如下通式(ii)的hes-pla接枝共聚物：

其中，m’在70到300之间，n’在300到3000之间；优选m’在100到250之间，n’在500到2000之间；更优选m’在150到200之间，n’在1000到1500之间。

所述pla在hes上接枝率为1～2，优选为1.4～1.8，更优选为约1.62。

由此获得的通式(ii)的hes-pla接枝聚合物形成纳米颗粒的尺寸为500～3000nm，优选为500～2000nm，进一步优选为约500～800nm。

hes-pla接枝聚合物的制备方法与通式(i)聚合物类似，在此不再赘述。

按照本发明的另一个方面，提供了一种药物套系，包括res巨噬细胞阻塞材料以及本发明的纳米载药系统或本发明的药物组合物。

优选地，所述药物套系中的res巨噬细胞阻塞材料的剂量为200～600mg/kg，本发明的纳米载药系统的剂量为4～6mg/kg。

优选地，所述药物套系被制备用于：

(1)向肿瘤患者施用200～600mg/kg剂量的res巨噬细胞阻塞材料；

(2)等待0.5～4h的时间段向该患者施用4～6mg/kg剂量的本发明的纳米载药系统；

优选地，所述res巨噬细胞阻塞材料的剂量为400mg/kg。

优选地，本发明的纳米载药系统的剂量为4mg/kg。

优选地，所述时间段为1.5小时。

以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1hes-pla共聚物的制备

称取0.5ghes(华科大生命科技有限公司，羟乙基化率为0.5)置于105℃干燥箱中干燥2h后取出，将其溶解于20mldmso(60℃)。同时，将pla(mw5kda，济南岱罡生物工程有限公司)、二环己基碳二亚胺及二甲氨基吡啶按1：4：2摩尔比溶解于10mldmso中。将两种溶液混合后，置于圆底烧瓶中，氮气保护，油浴维持温度60℃，搅拌反应24h。反应结束后，收集产物，置于截留相对分子质量为3500的透析袋中，用超纯水透析3天。将透析后的产物冷冻干燥后，加入二氯甲烷通过索氏提取器对其进行纯化(70℃、24h)，除去未反应的pla。将抽提后得到的产物45℃真空干燥，得到最终产物hes-pla共聚物(接枝率0.86)。

实施例2共包载dox与ly2157299(以下简称ly)的纳米粒(dox/ly@纳米粒)的制备

称取6mgdox盐酸盐(北京华奉联博有限公司)，将其混悬分散于1ml三氯甲烷中。按照摩尔比dox:三乙胺＝1:3的比例，向该悬浊液中加入三乙胺。将该悬浊液超声1h后，3000rpm离心10min，取上清液，即为脱去盐酸的dox三氯甲烷溶液。再称取12mgly，加入该dox三氯甲烷溶液中，涡旋混匀至溶液中无明显颗粒。

称取实施例1所制取的30mghes-pla共聚物溶解于20ml超纯水中。在冰浴中，将上述1mldox/ly三氯甲烷溶液逐滴加入hes-pla水溶液中。逐滴滴加过程中，同时通过细胞超声破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司)使溶液乳化(功率：200w，工作时间：2s，间歇时间：2s，循环次数：50次)。将超声后得到的乳液通过高压均质(jn-02低温超高压连续流细胞破碎机，广州聚能纳米生物有限公司)2次，调整压力至1000bar，温度维持在10℃，获得粒径更小且更均一的乳液。37℃负压旋蒸除去乳液中三氯甲烷后，将烧瓶中溶液转移至透析袋中(mwco:3500)，用超纯水透析1天，除去未包载的dox、ly以及多余的三乙胺。最后，将透析袋中的溶液收集，冷冻干燥，得最终产物共包载dox与ly的纳米粒，其可均一稳定的分散于水溶液中。

实施例3仅包载dox的纳米粒(dox@纳米粒)的制备

除无需向dox三氯甲烷溶液中加入ly，其余步骤同实施例2，最终制备得到仅包载dox的纳米粒。

实施例4dox/ly@纳米粒的表征

形貌表征

通过激光粒度仪(nanozs90型激光粒度仪，malvern，英国)检测得，dox/ly@纳米粒的粒径约为155nm，pdi(多分散系数)＝0.24，如图1a所示。纳米粒经过磷钨酸负染后，通过电镜(h-7000fa透射电子显微镜，hitachi，日本)进一步观察其形貌。如图1b所示，纳米粒子粒径均一，呈规则圆球形，分散性好，无明显团聚。对图1b中所示纳米粒进一步放大，可观察到纳米粒外围为一层黑色环状结构。由于磷钨酸易与亲水性结构相结合，因此该黑色环状结构为hes形成的亲水层。经标尺比对，计算出亲水层层厚约为15nm左右。该厚度刚好与单纯hes分子(70kd,2mg/ml)的水化直径相同，说明纳米粒外围的hes水化层由单层hes分子组装而成。通过原子力显微镜(multimode8原子力显微镜，bruker，德国)观察纳米粒形貌(如图1cⅰ所示)，所得结果与tem及dls结果相吻合，纳米粒粒径约为155nm(如图1cⅱ所示)。

电位表征

通过激光粒度仪(nanozs90型激光粒度仪，malvern，英国)分别检测了hes-pla、dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla纳米粒的zeta-电位值。如图1d所示，hes-pla纳米粒子基本呈电中性(-0.42mv)。而在包载了dox后，dox@hes-pla纳米粒子的电荷为7.19mv。该纳米粒子带正电荷增加的现象可解释为脱盐酸后的dox自身带有的正电荷影响了最终纳米粒子的zeta电位。而在共同包载了dox及ly的纳米粒子dox/ly@hes-pla中，纳米粒子所带电荷又回归到接近电中性(-1.42mv)。三种hes-pla纳米粒子电荷的不同可从侧面证明，dox及ly已经被负载于hes-pla纳米粒子中。

稳定性表征

将纳米粒子溶解在两种不同的溶液中(pbs及10％fbs1640培养基)，于不同时间点通过激光粒度仪检测纳米粒子粒径的变化情况。因纳米粒子一般是以冻干粉剂的形式贮存，只在使用时将其溶解，因此只检测纳米粒短时间内(24h)在上述溶液中的稳定性。如图1e所示，无论在pbs或者是10％fbs1640培养基中，24h内，纳米粒的水化直径均维持相对稳定。且观察可得，溶液澄清透明，无明显沉淀。此结果说明，纳米粒子可在pbs及10％fbs1640培养基中均一分散且至少24h内维持稳定。

载药量表征

纳米粒负载dox的量的测定：先将dox标准样品溶解于dmso中，配置成一系列浓度梯度的溶液。通过紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)测量各浓度dox溶液在490nm的吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线。再称取适量样品，加入3mldmso，使纳米粒破乳，将纳米粒中的dox完全释放，溶解于dmso中。再通过紫外分光光度计测量该溶液吸光度，代入上述标准曲线中，计算得纳米粒中dox的量。

载药量＝纳米粒中dox的质量/称取的纳米粒的质量×100％

纳米粒负载ly的量的测定：将一定量的ly标准样品溶解于乙腈/水(v:v＝50:50)溶液中，配置成一系列浓度梯度的溶液。通过高效液相色谱，于238nm处(流动相为乙腈：水＝50：50)，测定各浓度ly溶液对应auc，根据ly标准品浓度及其对应auc，拟合得标准曲线。取1ml实施例1中透析前溶液，置于超滤离心管中(millipore,mwco:10000)，10000rpm离心20min，收集滤膜外液体。再向内管中加入乙腈/水混合液，将液体补足至1ml，重复上述离心、收集过程5次。将收集到的液体分别取200μl于液相进样瓶中，通过高效液相色谱检测各样品于238nm处吸收峰对应auc，带入上述标准曲线中，计算得未包载进hes-pla纳米粒中游离ly的量。

载药量＝(投入ly的质量-未包载的游离ly的质量)/最终冻干得到的纳米粒的质量×100％

结果dox的载药量约为2.4±0.3％，通过高效液相色谱(hp-1100型高效液相色谱仪，agilent，美国)计算得dox/ly@纳米粒子负载ly的载药量约为15.0±1.0％。

药物释放表征

称取20mgdox/ly@hes-pla纳米粒，分别溶解于2ml50％fbs(pbs稀释)及2mlpbs溶液中。将该溶液置于透析袋中(mwco:3500)，再将透析袋置于40ml释放介质中(pbs,5％tween-80)。将该体系置于恒温摇床中，37℃孵育，200rpm转速，于不同时间点(15min、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h及72h)取1ml释放介质并用等体积释放介质补足。将取出的待测样品均分为两份，分别用于检测ly的量及dox的量。

dox释放量的检测：称取一定量的dox标准品，将其溶解于释放介质后，稀释成一系列浓度梯度(19ng/ml～10μg/ml)。通过荧光分光光度计检测不同浓度dox溶液对应的荧光值(ex:488nm,em:556nm)，并根据此数据做dox浓度标准曲线。再通过荧光分光光度计检测上述待测样品的荧光值(ex:488nm,em:556nm)。带入标准曲线公式中，计算得不同时间点dox释放的量。

ly释放量的检测：如上文中载药量表征部分所述。

由图2可知，无论在pbs还是在50％fbs中均实现了dox与ly的同步释放。

实施例5用4t1细胞来评价不同药物在体外杀伤肿瘤的能力

对4t1细胞进行培养，后通过mtt实验检测了不同药物(dox、dox+ly、以上实施例2和3制备的dox@纳米粒及dox/ly@纳米粒)在不同浓度下(dox：0.25～1μg/ml；ly：1.5～6μg/ml)对4t1细胞的杀伤能力，其中dox与dox+ly中的dox均为盐酸盐形式且溶解于dmso中。如图3a所示，不同dox浓度下的上述四种药物与细胞孵育24h后，均显示出一定的对肿瘤细胞的杀伤能力，且杀伤能力随着药物浓度的升高而增加。其中，游离dox+ly组表现出了最强的杀伤4t1细胞效果：dox剂量为1μg/ml时(对应ly剂量为6μg/ml)，杀伤效果显著高于另外三组。24h时，纳米载体组(dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla)抑瘤效果弱于对应游离药物组(dox及dox+ly)。然而，如图3b所示，孵育48h后，纳米粒组(dox@hes-pla、dox/ly@hes-pla)对肿瘤细胞的杀伤能力相较于24h时明显增强，与对应游离药物组(dox、dox+ly)持平，这是由于48h时，纳米载体外围hes水化层被血清中α-淀粉酶所降解。

由此可知，游离组及对应纳米载体组之间，虽然释放时间有所不同，但在杀伤肿瘤能力方面并不存在显著性差异。

同时，通过比较单dox组及联合给药组(dox与dox+ly，dox@hes-pla与dox/ly@hes-pla)可以发现，无论24h或是48h，联合给药组对4t1表现出了更强的杀伤作用(如图3a、图3b所示)。为了考察这一更强的杀伤作用是否仅仅是dox及ly各自对细胞的杀伤能力直接叠加造成的，我们通过mtt实验检测了单一ly在1.5～6μg/ml浓度范围内，对4t1细胞的杀伤能力。如图4所示，在1.5～6μg/ml浓度范围内，孵育24h及48h，4t1细胞存活率均保持在90％以上，证明单一的ly在该浓度范围内并不会对4t造成杀伤作用。因此可推测，图3中联合给药组(dox+ly、dox/ly@hes-pla)更强的杀伤效果是由于ly促进了dox的药效。有相关研究表明，tgf-β可抑制细胞内抑癌基因p53的表达，而dox对于细胞的杀伤能力与p53密切相关。因此可推断，ly通过阻断tgf-β通路影响p53的表达，提升dox对4t1细胞的杀伤能力。

实施例6transwell(细胞体外实验)检测药物对4t1细胞侵袭转移能力的影响

在本实验中，所用到的药物浓度均为0.05μg/ml(100nm)dox及其对应的0.3μg/ml(813nm)ly，其中dox为盐酸盐形式且溶解于dmso中。由上述mtt实验结果可知，在该浓度下，药物对4t1细胞基本无杀伤能力，因此可排除药物对4t1细胞活性的作用对于细胞侵袭转移能力的影响。

细胞侵袭模型：待细胞覆盖满瓶底80％面积后，按细胞传代步骤收集细胞。将细胞接入6孔板中继续置于培养箱中培养。待细胞过夜贴壁后，向孔中加入药物，置于培养箱中孵育48h。同时向transwell小室中加入50μlmatrigel稀释液(matrigel：培养基＝1：9)，使其平铺于transwell小室内孔中，置于培养箱中，备用。孵育结束后，按细胞传代步骤收集细胞。将收集得到的4t1细胞通过血细胞计数板计数后，用无血清培养基将细胞稀释至合适比例。将细胞加入transwell上层小室，每孔100μl，控制细胞数在8×10⁴左右。小室下层加入500μl完全培养基。同时设置tgf-β刺激组：下层培养基中加入3ng/mltgf-β1。将transwell置于培养箱中(37℃,5％co2)中孵育48h后，取出。用pbs漂洗一次transwell小室，将小室置于500μl4％多聚甲醛中固定20min。之后，再用pbs漂洗一次transwell小室，将小室置于500μl结晶紫溶液中染色20min。染色结束后，再用pbs将多余的结晶紫溶液漂洗净，用棉花将小室内部细胞轻轻擦去。通过显微镜选取不同视野，对小室底部被染成紫色的细胞拍照。拍照后，将transwell小室置于500μl33％醋酸溶液中，将进入细胞中的结晶紫抽提出，取300μl抽提液通过酶标仪测量570nm处吸光度，并通过如下公式计算出细胞转移率：

细胞侵袭率(％)＝(实验组吸光度-对应调零孔吸光度)/(对照组吸光度-对应调零孔吸光度)×100％

4t1细胞的侵袭情况：

在向transwell小室中接种细胞前，先在小室底部平铺一层基质胶(matrigel)，可模拟肿瘤区域致密的基质层，用于模拟肿瘤细胞从肿瘤区域穿越过基质层，进入血管这一过程，即肿瘤细胞的侵袭行为。为了更好的模拟体内的情况，另设6组，在这6组的下层培养基中加入3ng/mltgf-β，考察4t1细胞在药物及tgf-β共同作用下的侵袭行为。如图5a所示，4t1细胞在不加任何外源刺激(药物或tgf-β)的情况下，自身表现出了一定的侵袭能力(组ⅰ)，将该侵袭细胞数作为基准值，归一化为100％(图5b)。在加入tgf-β受体抑制剂ly后，4t1细胞的侵袭能力受到了抑制(组ⅱ)，侵袭率降至39％。而在经由低剂量游离dox及dox@hes-pla处理后，4t1细胞表现出了更强的侵袭能力(组ⅲ及组ⅴ)，侵袭率分别为157％及143％。在引入ly之后，经过联合给药组(dox+ly及dox/ly@hes-pla组)处理的4t1细胞侵袭能力有所减弱(组ⅳ及组ⅵ)，对应侵袭率为68％及51％。在加入了外源tgf-β后，未引入ly组(对照、dox及dox@hes-pla组)，4t1细胞侵袭能力明显增强(组ⅶ、ⅸ、ⅺ)。其中，dox组及dox@hes-pla组侵袭率分别为248％及261％，高于对照组(190％)。而在加入ly后(组ⅷ、ⅹ及ⅻ)，4t1的侵袭能力被大大削弱了，ly、dox+ly及dox/ly@hes-pla组的侵袭率分别为64％、89％及74％。

细胞转移模型：待细胞覆盖满瓶底80％面积后，按细胞传代步骤收集细胞。将细胞接入6孔板中继续置于培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，向孔中加入药物，置于培养箱中孵育48h。孵育结束后，按细胞传代步骤收集细胞。将收集得到的4t1细胞通过血细胞计数板计数后，用无血清培养基将细胞稀释至合适比例。将细胞加入transwell上层小室，每孔100μl，控制细胞数在8×10⁴左右。小室下层加入500μl完全培养基。同时设置tgf-β刺激组：下层培养基中加入3ng/mltgf-β1。将transwell置于培养箱中(37℃,5％co2)中孵育24h后，取出。用pbs漂洗一次transwell小室，将小室置于500μl4％多聚甲醛中固定20min。之后，再用pbs漂洗一次transwell小室，将小室置于500μl结晶紫溶液中染色20min。染色结束后，再用pbs将多余的结晶紫溶液漂洗净，用棉花将小室内部细胞轻轻擦去。通过显微镜选取不同视野，拍照记录小室底部被染成紫色的细胞。拍照后，将transwell小室置于500μl33％醋酸溶液中，将进入细胞中的结晶紫抽提出，取300μl抽提液通过酶标仪测量570nm处吸光度，并通过如下公式计算出细胞转移率：

细胞转移率(％)＝(实验组吸光度-对应调零孔吸光度)/(对照组吸光度-对应调零孔吸光度)×100％

4t1细胞的转移情况：同上述细胞侵袭实验，为了更好的模拟体内的情况，另设6组，在这6组的下层培养基中加入3ng/mltgf-β，考察4t1细胞在药物及tgf-β共同作用下的转移行为。如图5c所示，4t1细胞在不加任何外源刺激(药物或tgf-β)的情况下，自身表现出了一定的转移能力(组ⅰ)，将该转移细胞数作为基准值，归一化为100％(图5d)。在加入tgf-β受体抑制剂ly后，4t1细胞的转移能力受到了抑制(组ⅱ)，相对转移率降至69％。而在经由低剂量游离dox及dox@hes-pla处理后，4t1细胞表现出了更强的转移能力(组ⅲ及组ⅴ)，相对转移率分别为139％及129％。在引入ly之后，经过联合给药组(dox+ly及dox/ly@hes-pla组)处理的4t1细胞转移能力有所减弱(组ⅳ及组ⅵ)，对应转移率为78％及71％。在加入了外源tgf-β后，未引入ly组(对照、dox及dox@hes-pla组)，4t1细胞转移能力明显增强(组ⅶ、ⅸ、ⅺ)。其中，dox组及dox@hes-pla组转移率分别为257％及248％，高于对照组(208％)。而在加入ly组(组ⅷ、ⅹ及ⅻ)后，4t1的转移能力被大大削弱了，ly、dox+ly及dox/ly@hes-pla组的相对转移率分别为65％、119％及103％。

由此结果可知，无论是否经过纳米粒包裹，低剂量的dox均会引起4t1侵袭和转移能力的增强，而ly的加入可有效抑制4t1的侵袭和转移。ly作为一种tgf-β受体抑制剂，能很好的阻断tgf-β信号通路(ic50＝56nm)。而本实验中所用到的ly给药浓度为813nm，远高于该ic50，因此可认为4t1细胞的tgf-β信号通路被抑制，进而阻止了4t1细胞的侵袭转移。

实施例74t1皮下瘤动物模型的制备

4t1细胞经复苏后进行传代，待4t1细胞覆盖满瓶底80％面积后，按细胞传代步骤收集细胞。将收集的细胞用无血清培养基分散并计数。根据细胞计数，用无血清培养基将细胞悬液浓度调整为1×10⁷细胞/ml。将100μl细胞悬液通过1ml胰岛素注射器注射于balb/c小鼠(湖北省疾病预防控制中心、8周龄、雌鼠)背部右后侧皮下。游标卡尺测量肿瘤长宽，按如下公式计算肿瘤体积：

肿瘤体积＝(肿瘤长度×肿瘤宽度²)/2

实施例8定量检测药物在动物体内各组织的分布情况

制备荷4t1皮下瘤小鼠模型，待肿瘤体积到达200mm³左右时，将小鼠随机分为3组，每组6只小鼠。3组小鼠分别通过尾静脉注射dox盐酸盐、dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla，注射量为4mgdox/kg小鼠体重。注射后24h，处死小鼠，收集动物组织(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)，用天平称取记录各组织湿重。通过研磨器将各组织研磨后，向各组织混悬液中加入2倍体积甲醇，涡旋混匀，萃取得组织研磨液中的dox。涡旋后将该悬浊液静置20min后，10000rpm离心15min，取上清用于通过带荧光检测器的高效液相色谱检测dox浓度。

如图6所示，游离dox在心脏的分布远高于纳米粒组：游离组中，心脏中蓄积的dox量达到2.4μg/g组织；而纳米粒组中，心脏蓄积的dox量为1μg/g组织。同时，由于注射的dox盐酸盐是亲水性小分子，因此其在肝脏及脾脏的分布少于纳米粒组。值得注意的一点是，dox@hes-pla被肝脏非特异吞噬的量(10.8μg/g组织)显著高于dox/ly@hes-pla被吞噬的量(8.1μg/g组织)。这一现象可由纳米粒电位表征结果解释：相较于带正电荷的dox@hes-pla(7.19mv)，接近电中性的dox/ly@hes-pla(-1.42mv)更不易由于调理作用而被res非特异性吞噬，因此dox/ly@hes-pla拥有更好的长循环效果，可更有效的通过epr效应累积于肿瘤区域。

实施例9评价药物对4t1肿瘤的杀伤作用

待肿瘤体积到达80～100mm³左右时，将小鼠随机分为7组，每组6只小鼠，记为第0天。从第0天开始，每3天给7组小鼠分别通过尾静脉注射pbs、ly(24mg/kg)、hes-pla(167mg/kg)、dox(4mg/kg)、dox+ly(dox:4mg/kg,ly:24mg/kg)、dox@hes-pla(4mg/kg)及dox/ly@hes-pla(dox:4mg/kg,ly:24mg/kg)，共给药6次，每两天测量记录小鼠体重及肿瘤体积。

第20天时，处死小鼠，取肿瘤称重。同时取心、肝、脾、肺、肾及血液用于后续检测。将肿瘤拍照后，石蜡包埋，切片，部分切片经h&e染色后，光镜观察记录；部分切片经tunel、ki67及dapi荧光标记后，通过共聚焦显微镜观察记录。

如图7所示，箭头指示出给药时间，以第0天的肿瘤体积作为初始值，记为100％，后续测量值均通过该初始值进行归一化处理。pbs组、hes-pla组及ly组均无明显抑瘤效果，相对肿瘤体积达到900％以上。而dox组、dox+ly组及dox@hes-pla组中，三组的抑瘤效果无显著性差异，4t1皮下瘤受到了一定的抑制作用，最终的相对肿瘤体积为580％左右。在这7组中，dox/ly@hes-pla表现出了最强的抑瘤效果，最终的相对肿瘤体积为338％。第21天处死小鼠，剥取肿瘤称重，结果也与肿瘤体积结果相吻合。如图8所示，各组肿瘤平均重量如下：dox组，0.63g；hes-pla组，0.55g；ly组，0.54g；dox组，0.28g；dox+ly组，0.29g；dox@hes-pla组，0.28g；dox/ly@hes-pla组，0.12g。其中，dox/ly@hes-pla组瘤重显著低于其余6组，拥有最好的抑瘤效果，抑瘤率为80.7％。剥取的肿瘤照片如图9所示，可知dox/ly@hes-pla给药组小鼠皮下瘤明显小于其余6组。

重复上述小鼠模型及给药实验，但不处死小鼠。记录各组小鼠死亡时间，计算生存期中位数，以此评价各组药物对小鼠生存期的影响。

不同药物对小鼠生存期的影响如下表1所示，各组动物中位生存期如下：pbs组，48.5天；hes-pla组，52.5天；ly组，51.5天；dox组，50.5天；dox+ly组，53.5天；dox@hes-pla组，56天；dox/ly@hes-pla组，69天。前六组动物生存期无显著性差异，而dox/ly@hes-pla与其余六组相比较，显著延长了荷瘤小鼠的中位生存期(其中，相对于pbs，p＜0.01；相对于hes-pla、ly、dox、dox+ly或dox@hes-pla组，p小于0.05)。

表1：

上述结果均表明，dox、dox+ly及dox@hes-pla有一定的抑瘤能力，而dox/ly@hes-pla有最强的抑瘤效果。对于dox+ly组，在动物药效学实验中并没能获得与细胞药效学实验相吻合的良好效果。

实施例10动物实验评价药物对4t1肿瘤侵袭转移的抑制作用

处死上述实验小鼠后，收集各组小鼠完整的肺部，分别称重记录。再将肺通过bouin’s固定液固定染色过夜后，放于95％酒精中漂洗2天，将多余的黄色染料洗去。记录各肺部白色结节数，记为4t1侵袭转移结节数。最后将肺转移至4％多聚甲醛中固定过夜后，石蜡包埋，切片。切片经h&e染色后，光镜记录各组肺部结节情况。

如图10a所示，dox/ly@hes-pla组的肺重明显低于pbs组、hes-pla组及ly组，说明dox/ly@hes-pla可抑制4t1侵袭转移至肺部。最终肺部如图10c所示，前六组(pbs组、hes-pla组、ly组、dox组、dox+ly组及dox@hes-pla组)中，肺部结节数均无明显差别；而dox/ly@hes-pla组中，肺部基本无肿瘤结节(6只实验小鼠中，仅有一只小鼠肺部出现一个肿瘤结节)。图10b所示为各组小鼠肺部肿瘤结节数统计情况，与图10c所示趋势相同，前六组肺部结节数均值均在10个左右，无明显差异；而dox/ly@hes-pla明显抑制4t1细胞转移至肺部，肺部结节数均值为0，显著低于其余6组。图10d所示为各组肺部对应h&e染色结果：dox/ly@hes-pla组小鼠肺部呈正常肺泡结构；其余6组肺部均有实心结节出现。

与动物体内肿瘤杀伤结果类似，dox+ly并未取得与体外实验(实施例6)相符合的实验结果。这可解释为疏水性药物ly在体外实验中不存在体内分布的问题，可有效抑制4t1细胞转移；而在动物实验中，疏水性ly在体内分布效果不佳，易因调理作用而大量被res系统吞噬，无法有效富集于肿瘤部位，因此未表现出对肿瘤转移的抑制作用。

纳米载体的引入能很好的解决这一问题。将dox及ly共包载于hes-pla纳米粒中，能确保dox及ly同步的被运输到同一肿瘤区域，结合实施例4的释放结果，可以使dox及ly基本同步释放、作用于同一肿瘤区域。而如若仅仅将dox及tgf-β抑制剂通过物理混合后注射进入动物体内，由于两种药物在动物体内药代药动行为的差异，必然无法同步到达肿瘤同一区域，无法达到联合用药的目的。因此，本发明通过研究发现在这一联合给药体系(dox及ly)中，须通过纳米载体共包载二者，才能发挥最佳疗效。

实施例11药物对肿瘤内部emt进程的作用

将上述实施例9中收集得的皮下瘤冰冻切片后，通过免疫荧光(ix71倒置荧光显微镜，olympus，日本)分别标记出e-钙粘蛋白及n-钙粘蛋白表达情况。其中，当肿瘤细胞发生上皮间质转化时，细胞表面的e-钙粘蛋白、表达下调，细胞间粘附能力减弱；n-钙粘蛋白表达上调，肿瘤恶性程度增加、迁移能力加强。由于dox自带红色荧光(ex:488nm,em:561nm)，因此可直接通过观察红色荧光信号获知dox在肿瘤内部的分布情况。

如图11所示，根据dox列所示的红色荧光强度(即dox的量)的不同，将肿瘤切片划分为ⅰ、ⅱ及ⅲ区域：ⅰ区域为红色荧光较强区域，即dox在该区域蓄积量较多；ⅱ区域为红色荧光较弱区域，即有少量dox蓄积于该区域；ⅲ区域为基本无红色荧光区域，即无dox蓄积于该区域。pbs组肿瘤区域无红色荧光，整个肿瘤切片区域内绿色荧光较弱且分布均匀。而在dox、dox+ly及dox@hes-pla组中，肿瘤区域可按上述分区标准分为ⅰ、ⅱ及ⅲ区域：ⅰ区域dox累积量高，肿瘤细胞被dox有效杀伤，该区域基本无n-钙粘蛋白(绿色荧光)表达；在ⅱ区域有少量dox分布，该区域dox的浓度不足以杀死肿瘤细胞，而该区域的绿色荧光强度明显增强(即n-钙粘蛋白表达上调)，说明该区域肿瘤细胞上皮间质化程度加剧，更倾向于发生侵袭转移；而在ⅲ区域中，基本无红色荧光信号，绿色荧光强度也明显弱于ⅱ区域，与pbs组情况类似。在dox/ly@hes-pla组中，无论ⅰ或是ⅱ区域，绿色荧光强度明显弱于其余四组，说明肿瘤内n-钙粘蛋白表达受到了抑制。

随机绘制一条直线穿过ⅰ、ⅱ及ⅲ区域，对该直线上各点的红色及绿色荧光信号进行定量分析，结果显示：pbs组无红色荧光信号，绿色荧光信号维持在一个较低水平，峰值均低于30。dox、dox+ly及dox@hes-pla组中，ⅰ区域红色荧光信号峰值大于20，对应的绿色荧光信号峰值低于30；ⅱ区域红色荧光信号峰相对稀疏且峰值低于20，对应的绿色荧光信号峰密集且峰值大于30；而在ⅲ区域中，基本无红色荧光信号，对应的绿色荧光信号趋势与pbs组类似，峰值均低于30。对于dox/ly@hes-pla组，无论ⅰ区域或是ⅱ区域，绿色荧光信号峰值均低于10，明显低于其余组绿色荧光信号强度。

同样的，通过免疫荧光标记出肿瘤内e-钙粘蛋白(绿色荧光)的分布情况，结合肿瘤内dox(红色荧光)分布情况，观察另一上皮间质化标志蛋白e-钙粘蛋白随dox分布不同的变化情况。与上述分析方法相同，根据红色荧光强度(即dox的量)的不同，将肿瘤切片划分为ⅰ、ⅱ区域。随机绘制一条直线穿过ⅰ、ⅱ及ⅲ区域，对该直线上各点的红色及绿色荧光信号进行定量分析，结果显示：pbs组中无红色荧光，绿色荧光峰值高于40。而在dox、dox+ly及dox@hes-pla组中，ⅰ区域红色信号值强，绿色荧光信号峰值超过40；ⅱ区域红色荧光信号较弱，绿色荧光信号峰值较低。在dox/ly@hes-pla组中，无论ⅰ、ⅱ区域，均观察到较强的绿色荧光信号。

上述结果表明，在肿瘤内部，药物(dox)呈非均质分布：在dox蓄积量较高的区域，肿瘤细胞的生长受到抑制，可一定程度抑制肿瘤细胞上皮间质化的进程；而在dox蓄积量较低的区域，肿瘤细胞e-钙粘蛋白表达量下调、n-钙粘蛋白表达上调，上皮间质化程度加剧，更倾向于发生侵袭转移。而在dox/ly@hes-pla组中，通过ly阻断tgf-β信号通路，上调肿瘤细胞e-钙粘蛋白表达、下调n-钙粘蛋白的表达，有效抑制肿瘤细胞的上皮间质化进程，阻止肿瘤细胞侵袭转移。对比dox+ly及dox/ly@hes-pla两组结果可知，dox和ly必须经过纳米粒hes-pla的包裹共输送，才可同步到达同一肿瘤区域，发挥药效。因此，在这一给药体系中，dox、ly及hes-pla三者缺一不可。

实施例12动物实验评价药物体内安全性

将实施例9中收集得到的小鼠组织(心、肝、脾及肾)置于4％多聚甲醛中固定后，蜡块包埋切片，h&e染色，光镜(400×)观察切片。

将实施例9中收集到的血液分为两份，一份加入肝素钠抗凝处理后，进行血常规检测(红细胞、白细胞、血小板)。另一组血液37℃水浴0.5h后，置于4℃过夜后，3000rpm离心10min，取样品上层清液，即为动物血清样品，检测相关血生化指标(肌酸激酶、乳酸盐脱氢酶)。

上述实验已经证实dox/ly@hes-pla可有效杀伤4t1皮下瘤，同时抑制肿瘤细胞的侵袭转移。为了评价dox/ly@hes-pla的生物相容性，我们记录了给药周期内各组荷瘤小鼠体重的变化情况。如图13c所示，相较于其余5组，dox组及dox+ly组体重下降明显，dox组体重下降17％，dox+ly组体重下降10％；而dox@hes-pla组及dox/ly@hes-pla组动物体重基本维持在100％，证明经过纳米粒包裹后，药物表现出更小的毒性。

第21天处死小鼠后，收集小鼠血液用于检测相关血生化指标。由于dox的副作用主要表现为心脏毒性，因此我们检测了小鼠血液中磷酸肌酸激酶(creatinekinase,ck)及乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)的含量。如图13a所示，pbs组、hes-pla组、ly组及dox/ly@hes-pla组血液中ck含量维持在300u/l左右；dox@hes-pla组ck含量稍有上升，为533u/l；而dox组及dox+ly组中ck含量上升明显，分别为1256u/l及1014u/l，与其余五组相比有显著性差异。ldh结果与ck结果趋势相同，如图13b所示：pbs组、hes-pla组、ly组及dox/ly@hes-pla组血液中ldh含量维持在400u/l左右；dox@hes-pla组ldh含量稍有上升，为683u/l；而dox组及dox+ly组中ldh含量上升明显，分别为1487u/l及1117u/l，与其余五组相比有显著性差异。

收集各组小鼠的心、肝、脾、肾组织，包埋切片，h&e染色，从组织形态上评价药物对各组织的影响。如图14所示，pbs、hes-pla、ly、dox@hes-pla及dox/ly@hes-pla组心肌细胞形态正常，无病变出现；而在dox组，心肌细胞内出现空泡(如图中箭头所示)，该现象是心肌纤维化的标志；在dox+ly组，可观察到明显的炎性细胞浸润(如图中箭头所示)，是炎症的表现。通过心脏组织切片h&e染色观察到的结果与对应的血生化指标ck、ldh值的变化相吻合，证明dox及dox+ly均引起心脏毒性；而药物经hes-pla纳米粒负载后，其毒副作用明显降低。这可能是由于经hes-pla包裹后，药物在动物体内的分布得到了明显改善。如图6所示，注射药物24h后，游离组中，心脏中蓄积的dox量达到2.4μg/g组织；而纳米粒组中，心脏蓄积的dox量仅为1μg/g组织。通过观察脾脏切片可知，dox及dox+ly组脾小结结构消失，而其余五组脾脏形态结构正常，说明游离药物对脾脏有一定毒副作用。各组小鼠肝、肾组织h&e切片均未观察到异常。

dox的另一典型毒副作用表现为降低白细胞数。如图15a所示，各组小鼠的红细胞数无明显差别，均在1×10¹³/l。而对于血液中的白细胞数，游离药物影响显著。如图15b所示，pbs、hes-pla及ly组，小鼠血液中白细胞数为1.3×10¹¹/l；dox组及dox+ly组中，小鼠血液中白细胞数显著降低，为1.8×10¹⁰/l；dox@hes-pla组及dox/ly@hes-pla组中，小鼠血液中白细胞数目稍有下降，为1.18×10¹¹/l左右，但与pbs、hes-pla及ly组无显著性差异。dox及dox+ly对小鼠血液中血小板数目亦有影响，如图15c所示，相较于其余五组(1.7×10¹²/l左右)，dox及dox+ly组小鼠血小板数显著上升，约为3×10¹²/l左右。游离药物组血小板数目升高可能是由于给药结束后，骨髓抑制逐渐解除，而相较于白细胞，血小板恢复较快，反而造成了该两组血小板数目相对较高的现象。

相较于游离药物组，药物(dox及ly)经纳米载体hes-pla负载后，毒副作用显著下降：小鼠体重无下降；基本对心脏无毒性；给药后小鼠各项血常规指征维持在正常水平。因此，hes-pla生物相容性良好，且可通过改善药物分布情况及控制药物释放，有效降低药物对正常组织器官的毒副作用。