一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体、制备及其应用的制作方法

本发明属于纳米生物材料领域，具体地，涉及一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体、制备及其应用。

背景技术：

利用过氧化物、自由基、超氧化物等活性氧类物质进行肿瘤治疗是当前肿瘤精准治疗的一类重要治疗方案。通常利用一定波长的激光对光敏物质进行激发，受到激发辐照的光敏物质把所接受的激光能量传递给周围的基态氧，生成氧化性很强的活性氧、超氧化物、氧自由基，对肿瘤细胞的DNA和线粒体造成氧化损伤，从而杀伤肿瘤细胞。此类疗法通常只对肿瘤部位进行激光照射，故对周围正常组织细胞不会产生损伤，且光敏物质通常细胞毒性较小，在未经激光照射会迅速发生“光漂白”，失去光学活性，故其毒副作用较小且可控。

尽管活性氧肿瘤疗法具有显著优点，但仍有很大的限制性：（1）光敏药物通常疏水性强，在血液中的运输能力差，很难直接使用并到达肿瘤部位，需要载体的帮助才能实现有效的肿瘤递送；（2）光敏药物半衰期短，会很快发生光漂白，不利用临床诊疗方案的执行；（3）光敏药物需经激光辐照才能产生活性氧和自由基，且选用激光的波长通常在550～680nm间，这段波长的激光穿透性差，很难有效穿透人体深处的肿瘤，限制了这类疗法的实际应用。

通过调控细胞内H₂O₂含量是肿瘤治疗的一种有效途径。通常，肿瘤细胞和正常组织细胞均需要一定量的H₂O₂维持细胞的正常生理功能，但是过量的H₂O₂会对细胞造成氧化损伤。Vc能通过促氧化作用在细胞中产生大量的H₂O₂，在临床上可用高剂量的Vc静脉注射病利用在肿瘤产生H₂O₂的氧化损伤来进行肿瘤治疗（Science，2015，350(6266)：1391；Redox Bio，2016,10:274-284）。同时由于正常细胞中含有大量的过氧化物酶，且剂量远超过肿瘤细胞，故不会对正常细胞产生氧化损伤。

利用温敏化学物质将药物固封在药物载体中是一类常见的“刺激——响应性”药物递送载体的制备方法，其在生理温度条件下为固态，经外部热刺激后升温融化并释放出所加载的药物，由此降低药物在体内递送和循环过程中的泄漏风险。当前常用的温敏包封材料主要为：氟碳化合物、丙烯酰胺衍生物、有机磷腈、普朗尼克/泊洛沙姆类物质等,这些温敏化学物质通常价格昂贵、制备工艺复杂繁琐，不利用批量化规模制备。

磁性纳米颗粒，包括Fe₃O₄、Fe₂O₃、FeO、Fe(COOH)₂、MnO₂、Mn_mZn_nFe_x、Ni_mCo_nFe_x等纳米级别颗粒，是一类常用的肿瘤靶向药物递送载体，其良好的磁性可用做肿瘤的磁定位靶向，而良好的超顺磁性使其在高频交变磁场的作用下，将磁场能转换为热能，成为温度响应性药物载体的制备基材。

另外，在肿瘤细胞的弱酸环境下，Fe₃O₄还能通过芬顿反应将H₂O₂催化成为氧化度更高的超氧自由基OH·和O₂^-·，造成细胞更高程度的氧化损伤,其作用机制为：

Fe²⁺ + H₂O₂→Fe³⁺ + OH^- + OH· ①

Fe³⁺ + H₂O₂→Fe²⁺ + O₂+ 2H⁺ ②

O₂ +Fe³⁺ →Fe²⁺ +O₂^-· ③

当前，利用磁性纳米颗粒搭载Vc并构建肿瘤靶向活性氧自生成的药物递送载体，并利用所产生的H₂O₂、OH·和O₂^-·的氧化作用杀伤肿瘤还未见报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的一在于提供一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体，目的二在于提供该Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体的制备方法，目的三在于提供所述Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体在制备抗肿瘤药物上的应用。

一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体，其是利用温敏化学物质将Vc或Vc的类似物/衍生物封装在中空磁性纳米颗粒的空腔中制得。

进一步的，所述温敏化学物质为全氟己烷、异丙基丙烯酰胺、有机磷腈、十四烷醇或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷嵌段共聚物中的一种或几种。

进一步的，所述Vc的类似物/衍生物包括L-抗坏血酸、S-L-抗坏血酸、5,6-O-异丙基-L-抗坏血酸、抗坏血酸钠、L-抗坏血酸二水合物、N-甲基-L-抗坏血酸或4-(3-环丁氧)哌嗪-L-抗坏血酸。

进一步的，所述中空磁性纳米颗粒为中空的Fe₃O₄、Fe₂O₃、FeO、Fe(COOH)₂、MnO₂、Mn_mZn_nFe_x和Ni_mCo_nFe_x磁性纳米颗粒中的一种或几种。

进一步的，所述中空磁性纳米颗粒的粒径为5～200nm。

本发明还提供制备上述Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体的方法，包括以下步骤：

(A)温敏化学物质/Vc类物质混合溶液的制备：

称取1g～5g温敏化学物质和50mg～250mg Vc类物质共同加入玻璃容器中，将玻璃容器置于60℃～90℃的水浴锅中，以500～1000rpm的转速机械搅拌至温敏化学物质和Vc完全溶解，即得温敏化学物质/Vc类物质的混合溶液Ⅰ；

(B)中空磁性纳米颗粒载体对温敏化学物质/Vc类物质的装载：

称取10mg～500mg中空磁性纳米颗粒，加入至步骤(A)得到的混合溶液Ⅰ中，以300～500rpm/min的转速机械搅拌至中空磁性纳米颗粒完全分散在混合溶液Ⅰ中，继续搅拌15～30min，使液态的温敏化学物质/Vc类物质渗透进入中空磁性纳米颗粒的空腔中，得温敏化学物质/Vc类物质负载中空磁性纳米颗粒的混合溶液Ⅱ；

(C)温敏化学物质/Vc类物质负载中空磁性纳米颗粒的收集：

将玻璃容器从水浴锅中取出，将磁强为0.1T～1T的磁铁放置于玻璃容器底部，温敏化学物质/Vc类物质负载中空磁性纳米颗粒被磁铁吸附于玻璃容器底部，弃去上清，收集沉淀物；用乙醇洗涤所述沉淀物，然后置于-50～0℃的冷冻真空干燥箱中干燥24～72h，获得温敏化学物质/Vc类物质负载中空磁性纳米颗粒。

本发明另外还请求保护上述Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，在外界磁靶向作用下将所述Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体靶向递送至肿瘤部位，在高频交变磁场作用下利用其产生的高剂量活性氧物质对肿瘤细胞的氧化损伤原位杀伤肿瘤。

本发明所述的Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体，以中空磁性纳米颗粒为药物“罐车”、利用温敏化学物质将Vc封装在载体中，在磁导向作用下可将该活性氧自生成纳米载体靶向递送至肿瘤部位、在高频交变磁场（AMF）作用下能在肿瘤中产生高剂量H₂O₂，并通过芬顿效应产生将H₂O₂催化为氧化态更高的OH·和O₂^-·，并利用活性氧物质H₂O₂、OH·和O₂^-·对肿瘤细胞的氧化损伤共同原位杀伤肿瘤。所述高频交变磁场（AMF）的参数为：电流200～600A、频率50～500 kHz、功率0.5kW～4.5kW、 时间5～120 min，产热温度为40～80℃。

其主要有以下用途：

用途一：能携带细胞H₂O₂诱发剂——维生素c（Vc）并在外界磁靶向作用下将其靶向递送至肿瘤细胞中。

用途二：在外界高频交变磁场的作用下，能在肿瘤病灶部位释放出H₂O₂诱发剂Vc。

用途三：通过H₂O₂诱发剂Vc的作用，在肿瘤细胞中产生过量H₂O₂杀伤肿瘤细胞。

用途四：利用磁性Fe₃O₄纳米颗粒的芬顿效应将H₂O₂催化为氧化态更高的OH·和O₂^-·，氧化杀伤肿瘤细胞。

本发明以搭载Vc的中空磁性纳米颗粒为基础，通过所述制备方法制备性价比高、易规模化、生物相容性好的肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体，避免常规的光动力活性氧疗法组织穿透性差的缺点，并可将其应用于肿瘤的活性氧治疗中。

本发明提供的一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体，活性氧的诱发剂为Vc和磁性纳米颗粒，均是FDA认证通过的生物相容良好的药品或生物材料。由于肿瘤细胞中缺乏过氧化物/超氧化物酶，高剂量的Vc能通过促氧化作用使肿瘤细胞中的H₂O₂含量显著升高，而Fe₃O₄则能通过芬顿效应催化H₂O₂成为氧化程度更高的OH·和O₂^-·，在H₂O₂、OH·和O₂^-·的共同氧化作用下，有效杀伤肿瘤细胞。同时，正常细胞中富含过氧化物/超氧化物酶，故本发明所制备活性氧自生成纳米载体对正常细胞毒性较小。

同已有技术相比，本发明中所提供的一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体的突出优点是：

(A)制备简单。载体的制备过程简单易操作，只需在水浴锅中将温敏化学物质、Vc及其衍生物和中空磁性纳米颗粒简单混合，通过“一锅法”即可大批量制备肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体，易于批量化规模制备。

(B)性价比高。Vc是一种价格低廉、简单易得的物质，但其在肿瘤内的活性氧产生效率等同或高于传统的光敏药剂，且不会产生“光漂白”失活效应，能长期保持氧化活性。

(C)结构可控。通过简单调整中空纳米颗粒的结构形状、物相构成及粒径大小，即可通过“一锅法”制备纳米药物载体，满足临床具体诊疗方案的制定和改进。

(D)疗效优良。本发明Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体具有良好活性氧自生成能力，并且其对肿瘤抑制率接近100%；同时载体还具有良好的生物相容性，具有潜在的临床实用价值。

附图说明

图1是Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体——中空磁性纳米四氧化三铁纳米粒@1-十四烷醇@维生素C（HMNPs@Pent@Vc）制备及其在高频交变磁场作用下的细胞内活性氧自身成及肿瘤活性氧治疗作用机理示意图；

图2是活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc的透射电镜图；其中，比例尺——100（单位：纳米，nm）；

图3是活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc的磁学性能表征；

图4是在高频交变磁场作用下活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc的产热性能；

图5是在高频交变磁场作用下HMNPs@Pent@Vc中Vc释放比率；

图6是活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc在H₂O₂溶液中的活性氧生成性能；

图7是在高频交变磁场作用下活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc对肿瘤细胞的杀伤性能；

图8是活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc在肿瘤中的活性氧光声成像图；其中，蓝色（图中黑色块状区域）为活性氧分子，右侧标尺中颜色的深浅代表活性氧分子的含量；

图9是在高频交变磁场作用下，活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc对荷瘤裸鼠的实体瘤的治疗效果；

图10是在高频交变磁场作用下，利用活性氧自生成纳米载体HMNPs@Pent@Vc对荷瘤裸鼠进行治疗，治疗18天后实体瘤体积变化情况检测（所用直尺单位：厘米，cm）。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的解释说明。

实施例1

一种Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体-中空磁性纳米四氧化三铁/1-十四烷醇/维生素c (HMNPs@Pent@Vc)的制备，具体步骤如下：

步骤一、1-十四烷醇/维生素c（Pent@Vc）混合溶液的制备

称取1.0g的1-十四烷醇和50mg维生素Vc共同加入200mL烧杯中，并置于80℃的水浴锅中预热5分钟，然后利用转速为500rpm/min机械搅拌搅拌10分钟，至1-十四烷醇和维生素Vc完全溶解，即得1-十四烷醇/维生素c的混合溶液Pent@Vc。

步骤二、中空磁性纳米颗粒对1-十四烷醇/维生素c的加载（HMNPs@Pent@Vc）

称取0.1g中空磁性纳米颗粒（HMNPs）加入至实施例1中的Pent@Vc混合液中，利用转速为500rpm/min机械搅拌使颗粒完全分散在溶液中并继续搅拌15min，液态的Pent@Vc会逐渐渗透进入纳米颗粒HMNPs的空腔中，即得装载了1-十四烷醇/维生素c的中空磁性活性氧自生成纳米颗粒HMNPs@Pent@Vc。

步骤三、活性氧自生成HMNPs@Pent@Vc纳米颗粒的收集

取出烧杯，利用0.5T的磁铁将磁性的HMNPs@Pent@Vc颗粒吸附于烧杯底部，弃去上清，并用乙醇将所得HMNPs@Pent@Vc洗涤8次，用为-50℃的冷冻真空干燥箱将颗粒干燥72h。

上述制备的活性氧自生成纳米载体在高频交变磁场作用下能产生高剂量H₂O₂的药物载体，并通过芬顿效应产生将H₂O₂催化为氧化态更高的OH·和O₂^-·，并利用活性氧物质H₂O₂、OH·和O₂^-·对肿瘤细胞的氧化损伤共同原位杀伤肿瘤，作用机理如图1所示，因此可将其应用到抗肿瘤药物的制备中。

本发明的肿瘤活性氧治疗效果通过上述肿瘤靶向活性氧自生成药物载体HMNPs@Pent@Vc为基础开展。

肿瘤活性氧治疗：将HMNPs@Pent@Vc通过尾静脉注射至培养了移植瘤的裸鼠体内，在肿瘤部位放置磁铁（磁强：0.5T～1T），磁性药物载体HMNPs@Pent@Vc会通过磁靶向聚集在肿瘤瘤区。然后在肿瘤部位加载AMF（200A～500A，200kHz～500kHz，2kW～4kW）使颗粒产热（40℃～60℃），升高的温度使十四烷醇融化并释放出Vc，在肿瘤细胞中生成高剂量的H₂O₂，并经Fe₃O₄芬顿催化产生氧化态更高的OH·和O₂·，通过活性氧的氧化损伤杀灭肿瘤。

本发明进一步对Vc介导肿瘤靶向活性氧自生成纳米载体-中空磁性纳米四氧化三铁/1-十四烷醇/维生素c (HMNPs@Pent@Vc)的性能进行表征：

图2为HMNPs@Pent@Vc的透射电镜图，其表征方法为：将0.1mg HMNPs@Pent@Vc纳米颗粒溶于10mL酒精中，超声5min，然后取1μL滴加于铜网上用透射电镜观察。结果显示HMNPs@Pent@Vc纳米颗粒形貌规则，粒径均一，其直径约为125nm。

图3为HMNPs@Pent@Vc的饱和磁化强度，其表征方法为：将20μg HMNPs@Pent@Vc置于空心棉棒中压实，用振动样品磁强计测定其磁化强度。结果显示，HMNPs@Pent@Vc具有良好的超顺磁性，能够对外加磁场进行响应。

图4为不同浓度HMNPs@Pent@Vc纳米颗粒在高频交变磁场中的产热性能。表征方法：制取0.031、0.625、0.125、0.25、0.5mg/mL的HMNPs@Pent@Vc溶液，分别各取1mL置于离心管中并用高频交变磁场（4kW，300A，200kHz）中处理30分钟，利用红外测温仪记录产热情况。结果显示：0.5mg/mL的HMNPs@Pent@Vc在高频交变磁场（4kW，300A，200kHz）中处理30分钟后产热达47.5℃，能够满足肿瘤热疗需求。

图5为HMNPs@Pent@Vc在不同温度下的释放，表征方法：取0.25mg/mL的HMNPs@Pent@Vc溶液1mL，分别在室温20℃及37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃的水浴锅中，每隔2.5分钟检测Vc的释放量。结果显示：HMNPs@Pent@Vc在室温（20℃）及正常生理温度（37℃）下基本不释放，当温度超过38℃，药物释放明显，表明HMNPs@Pent@Vc具有良好的温度响应释放特性。

图6为成HMNPs@Pent@Vc在HepG2肝癌细胞中的活性氧OH·和O₂^-·的产出剂量，表征方法：将HepG2肝癌细胞与0.25mg/mL的HMNPs@Pent@Vc溶液共培养12小时后，用高频交变磁场（4kW，300A，200kHz）中处理30分钟，每7.5min打开/关闭高频交变磁场，同时检测活性氧OH·和O₂^-·的产出剂量。结果显示，经高频交变磁场处理后，HMNPs@Pent@Vc能在HepG2细胞中产生较高剂量的OH·和O₂^-·等活性氧物质，且OH·的产量高于O₂^-·。

图7为HMNPs@Pent@Vc在高频交变磁场作用下对HepG肝癌细胞的杀伤效应。其表征方法为：将HepG2肝癌细胞（细胞数量：1×106，培养基：2mL）与100μL的PBS、100μL浓度为0.25mg/mL的Pent、100μL不同浓度的Vc及100μL浓度为0.25mg/mL的HMNPs@Pent@Vc溶液共培养12小时后，用高频交变磁场（4kW，300A，200kHz）中处理30分钟，用MTT法检测细胞活性结果显示：与PBS对照组、单纯Pent处理组、单纯Vc处理组相比，HMNPs@Pent@Vc在高频交变磁场作用下显示了更高的肿瘤细胞杀伤效应。

图8为HMNPs@Pent@Vc在肿瘤中的活性氧图像。其表征方法为：用活性氧探针分子检测不同时间段肿瘤内的活性氧产生情况(A、B、C、D分别表示AFM加载0min，30min，45min和60min时肿瘤部位活性氧探针分子的荧光强度)。结果表明：在高频交变磁场作用下，HMNPs@Pent@Vc能在肿瘤中产生高剂量的活性氧，进而杀伤实体肿瘤。

图9为治疗18天过程中肿瘤体积变化统计。表征方法：制备荷瘤裸鼠模型12只，并分为四各实验组，分别为对照组（PBS+AMF）、Vc处理组（Vc+AMF）、HMNPs颗粒处理组(HMNPs+AMF)以及活性氧自生成处理组（HMNPs@pent@Vc+AMF），每天在高频交变磁场（4kW，300A，200kHz）中治疗30分钟，连续3天，记录18天治疗过程中裸鼠肿瘤体积变化，在治疗的第18天，断颈法处死裸鼠并取出肿瘤，用直尺测量肿瘤大小。结果显示：与对照组（PBS+AMF）、Vc组（Vc+AMF）、HMNPs颗粒组(HMNPs+AMF)相比，活性氧自生成治疗组（HMNPs@pent@Vc+AMF）显示出更显著的抑瘤效果，肿瘤体积实现了明显抑制和缩小。

图10为治疗18天完成后，处死裸鼠后取出的实体肿瘤图。结果显示：与对照组、Vc组、HMNPs颗粒组相比，活性氧自生成治疗组（HMNPs@pent@Vc+AMF）的治疗效果显著，肿瘤体积最小，HMNPs+AMF组次之，Vc+AMF再次，而经PBS+AMF处理的对照组肿瘤体积最大。

上述荷瘤裸鼠的肿瘤可为液体瘤如白血病，以及机体组织器官表面或内部各种实体瘤如:肺部，肝部、胃部、肾部、皮肤、肠道、鼻咽、舌、食道、乳腺、宫颈、甲状腺、胰腺、颅内、胆部、前列腺、阴茎、绒毛膜以及黑色素瘤等实体肿瘤等中的一种或几种。

以上体内外实验结果均表明：活性氧自生成HMNPs@Pent@Vc纳米颗粒能在高频交变磁场的作用下，在肿瘤中产生大量活性氧OH·和O₂^-·物质，并由此杀伤肿瘤细胞，该载体制作工艺简单，性价比高，对实体肿瘤的抑制疗效显著。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。