本发明属于植物中黄酮类组分的提取及纯化方法。
背景技术：
近年来研究发现，黄酮类化合物具有防癌、抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗心血管疾病、降血脂、抗骨质疏松、镇痛、雌性激素样作用、预防老年痴呆以及调节免疫系统等多方面药理作用。由于很多植物药中黄酮类物质的作用机理尚不明确，因此近年来人们对植物药中黄酮类成分的鉴定以及相关药理作用的研究越来越重视。
黄酮类化合物种类繁多，泛指两个苯环(a与b)通过三个c原子相互连接而成的一系列化合物，基本骨架有c6-c3-c6模式，结构如下，主要包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮等。
黄酮纯化方法较多，目前主要的纯化方法有：萃取法、超滤膜法、结晶法和柱层析法等。溶剂萃取法利用相似相溶的原理，将不同极性的黄酮类化合物分离，广泛地应用于天然产物的研究中，常用的有机试剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯和正丁醇等。超滤膜法是按照相对分子量进行分离的一种方法，可选用合适的超滤膜孔径，通过物理分离方法，有效地除去提取液中的大分子物质。黄酮类化合物在低温下水溶解度低，易饱和，因此可以采用结晶法进行分离，设置不同温度、不同溶剂体系对黄酮类化合物进行分离，但该方法应用较少。最常用的柱层析法为聚酰胺树脂和大孔树脂法。黄酮类化合物富含酚羟基，因此可与聚酰胺树脂中的酰胺基结合。不同化合物与聚酰胺形成的氢键缔合能力不同，因此聚酰胺树脂可用来分离纯化中药提取液中的黄酮类化合物。大孔树脂是一种具有大孔结构、人工合成的有机高分子共聚体，因其多孔结构特点可通过吸附性和筛选性原理相结合分离不同的物质。大孔树脂的型号种类众多，功能差异较大，可根据不同物质的理化性质，选择合适的大孔树脂进行分离。ab-8、d101、nka、nka-9、d152、ads-17等大孔树脂均可对黄酮进行筛选纯化。
现今有许多化合物检测技术，包括紫外检测器、光电二极管阵列检测器、荧光检测、蒸发光散射检测器和质谱(ms)等。与其它检测技术相比，ms不仅能够得到化合物的结构信息而且具有更高的灵敏度。近年来随着软电离质谱技术的发展，应用质谱技术进行中药研究的报道越来越多，特别是它与色谱联用后能够对复杂的混合物进行分析，这点对于中药这一复杂体系十分重要。中药的质谱分析主要是通过对已知化合物进行串联质谱分析，推断类似结构化合物的裂解规律，从而对中药和中药复方中其它未知结构的化合物进行推断。黄酮类化合物在串联质谱中主要发生逆狄尔斯-阿德反应、开环断裂和糖苷键断裂等反应，通过总结这些反应的规律可以对黄酮类化合物的同分异构体进行区分。
技术实现要素：
本发明提供一种甘草黄酮组分的提取及纯化方法，通过设计筛选成熟的工艺步骤和工艺参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的甘草黄酮产品。
本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：
(1).甘草提取液的制备
精密称取甘草粗提物，9～11倍量蒸馏水浸泡25～35min，回流提取0.5～1.5h，离心分离上清液和药渣，将药渣用9～11倍量水回流提取35～45min，离心，合并两次上清液，将上清液浓缩至0.5g生药量/ml，加入95％乙醇，使其醇沉溶液终浓度为60％，4℃条件下静置12h后，4000r/min离心8～12min，将上清液浓缩至干，待用；
(2).甘草提取液的黄酮组分粗分离
将浓缩至干的甘草提取液加入少量甲醇至溶解，在磁力搅拌器下，慢慢加入10倍甲醇体积的乙酸乙酯，静置9～11min，转移上清液，浓缩至干，将溶液稀释至0.2g生药/ml，以备纯化；
(3).甘草粗黄酮的纯化
dm130树脂和聚酰胺树脂的预处理
上样dm130树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附9～11h，随后用6bv蒸馏水和50％的乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，浓缩；
上样聚酰胺树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附样品9～11h，随后用6bv蒸馏水和用50％的乙醇分别洗脱树脂柱，收集洗脱液浓缩冻干，得甘草黄酮组分纯化物。
本发明有益效果是：联合dm130大孔树脂和聚酰胺树脂法可将甘草中的黄酮组分较好地分离纯化，且将皂苷组分的影响降到最低，利于干草中黄酮组分药效学等研究；利用液质联用鉴定纯化后的甘草黄酮主要是甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、异甘草素葡萄糖芹糖苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、刺芒柄花素、甘草瑞酮、甘草酸、甘草香豆素。
附图说明
图1是甘草纯化后黄酮负谱总离子流图。
具体实施方式
实施例1
步骤如下：
(1).甘草提取液的制备
精密称取甘草粗提物，9倍量蒸馏水浸泡25min，回流提取0.5h，离心分离上清液和药渣，将药渣用9倍量水回流提取35min，离心，合并两次上清液，将上清液浓缩至0.5g生药量/ml，加入95％乙醇，使其醇沉溶液终浓度为60％，4℃条件下静置12h后，4000r/min离心8min，将上清液浓缩至干，待用；
(2).甘草提取液的黄酮组分粗分离
将浓缩至干的甘草提取液加入少量甲醇至溶解，在磁力搅拌器下，慢慢加入10倍甲醇体积的乙酸乙酯，静置9min，转移上清液，浓缩至干，将溶液稀释至0.2g生药/ml，以备纯化；
(3).甘草粗黄酮的纯化
dm130树脂和聚酰胺树脂的预处理
上样dm130树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附9h，随后用6bv蒸馏水和50％的乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，浓缩；
上样聚酰胺树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附样品9h，随后用6bv蒸馏水和用50％的乙醇分别洗脱树脂柱，收集洗脱液浓缩冻干，得甘草黄酮组分纯化物。
实施例2
步骤如下：
(1).甘草提取液的制备
精密称取甘草粗提物，10倍量蒸馏水浸泡30min，回流提取1h，离心分离上清液和药渣，将药渣用10倍量水回流提取40min，离心，合并两次上清液，将上清液浓缩至0.5g生药量/ml，加入95％乙醇，使其醇沉溶液终浓度为60％，4℃条件下静置12h后，4000r/min离心10min，将上清液浓缩至干，待用；
(2).甘草提取液的黄酮组分粗分离
将浓缩至干的甘草提取液加入少量甲醇至溶解，在磁力搅拌器下，慢慢加入10倍甲醇体积的乙酸乙酯，静置10min，转移上清液，浓缩至干，将溶液稀释至0.2g生药/ml，以备纯化；
(3).甘草粗黄酮的纯化
dm130树脂和聚酰胺树脂的预处理
上样dm130树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附10h，随后用6bv蒸馏水和50％的乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，浓缩；
上样聚酰胺树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附样品10h，随后用6bv蒸馏水和用50％的乙醇分别洗脱树脂柱，收集洗脱液浓缩冻干，得甘草黄酮组分纯化物。
实施例3
步骤如下：
(1).甘草提取液的制备
精密称取甘草粗提物，11倍量蒸馏水浸泡35min，回流提取1.5h，离心分离上清液和药渣，将药渣用11倍量水回流提取45min，离心，合并两次上清液，将上清液浓缩至0.5g生药量/ml，加入95％乙醇，使其醇沉溶液终浓度为60％，4℃条件下静置12h后，4000r/min离心12min，将上清液浓缩至干，待用；
(2).甘草提取液的黄酮组分粗分离
将浓缩至干的甘草提取液加入少量甲醇至溶解，在磁力搅拌器下，慢慢加入10倍甲醇体积的乙酸乙酯，静置11min，转移上清液，浓缩至干，将溶液稀释至0.2g生药/ml，以备纯化；
(3).甘草粗黄酮的纯化
dm130树脂和聚酰胺树脂的预处理
上样dm130树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附11h，随后用6bv蒸馏水和50％的乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，浓缩；
上样聚酰胺树脂：以1bv/ml的速度上样，吸附样品11h，随后用6bv蒸馏水和用50％的乙醇分别洗脱树脂柱，收集洗脱液浓缩冻干，得甘草黄酮组分纯化物。
高效液相-质谱技术对纯化的黄酮组分进行成分鉴定：
液相条件：waters2695高效液相色谱仪(waters2996dad检测器，美国waters公司)色谱条件：kromasilc18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相a为0.5％醋酸，流动相b为甲醇，流动相c为乙腈；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测波长为254nm；进样体积10μl，梯度洗脱程序设定如表1所示。
表1“甘草”黄酮组分高效液相色谱洗脱程序
质谱条件：finniganltqxl离子肼质谱仪，esi电喷雾离子源：美国thermo公司。负离子电离方式，质谱扫描范围：120-1000m/z，喷雾电压5kv，金属毛细管温度250℃，鞘气(n2)流速50bar，辅助气(n2)为5bar，反吹气(n2)1bar。鉴定出10个主要的黄酮化合物。
下面结合药理实验说明本发明方法所得产品的生物活性：
本发明方法所得甘草黄酮产品镇痛作用研究实验
(1)醋酸扭体实验：连续灌胃给药8天，于第8天给药30min后，每只鼠腹腔注射0.6％醋酸0.1ml/10g体重，记录注射后20min内小鼠扭体次数，计算药物对扭体次数抑制率，结果见表2。
表2甘草黄酮对小鼠扭体次数的影响(
(2)热板实验：调节智能热板仪的温度控制器至(55±0.5)℃。取雌性健康小鼠，将小鼠放在热板上，以小鼠自放在热板上至出现舔后足所需时间(s)作为该小鼠的痛阈。取舔后足时间在5s到30s之间小鼠进行后续实验。将合格的小鼠重复测2次正常痛阈值，取平均值作为该小鼠给药前的痛阈值。每天给药1次，连续给药7d，末次给药禁食不禁水12h，于最后1次给药前30min、60min、90min在热板仪中再次测定小鼠痛阈(凡痛阈提高值为负数时，按0计)并计算痛阈提高值及提高率，结果列于表3。
表3甘草黄酮对小鼠痛阈提高率的影响
醋酸扭体实验和热板实验结果表明本发明方法所得黄酮镇痛活性显著。
本发明方法所得甘草黄酮产品抗炎作用研究实验
(1)角叉菜胶实验：造模前给药组灌胃给药7天，于第7天灌胃给前测量初始足体积，给药后30min在右后足垫皮下注射生理盐水或0.5％角叉菜胶20μl，在注射后30min、60min、90min、120min、180min、240min分别测量各鼠的足体积，观察不同时间点药物与模型组相比对小鼠足肿胀的影响，结果列于表4。
表4甘草黄酮对小鼠足肿胀度的影响
注：与空白组比较，###p<0.001，##p<0.01，#p<0.05；与模型组相比，**p<0.01，*p<0.05。
(2)佐剂性关节炎模型：大鼠左后足足趾处皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml，免疫14天后，连续给药3周。足肿胀率、大鼠血清中tnf-α和il-1β含量的影响见表5。
表5甘草黄酮对佐剂性关节炎大鼠足肿胀度、血清中tnf-α和il-1β含量的影响
注：与空白组比较，###p<0.001，##p<0.01，#p<0.05；与模型组相比，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。
角叉菜胶实验和佐剂性关节炎模型实验结果表明本发明方法所得甘草黄酮体内抗炎活性显著。
1、硝酸铝显色法测定甘草黄酮的含量
精密称取5.0013mg芦丁标准品于5ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度。配制成1mg/ml芦丁储备液。分别精密吸取1mg/ml芦丁标准品溶液150μl、300μl、450μl、600μl、750μl、900μl放入1-6号容量瓶中，各加入0.2ml的5％亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min，分别加入0.2ml10％硝酸铝溶液，摇匀，静置6min，分别加入1ml4％氢氧化钠溶液，用甲醇定容至5ml，摇匀，静置15min，以相应试剂做空白，紫外分光光度法于510nm下测吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁质量为横坐标，绘制标准曲线y＝0.9637x+0.0912(r2＝0.9996)，线性范围是150μg-900μg。精密称取1.0300mg甘草黄酮冻干粉，采用紫外分光光度法测定，甘草黄酮纯度为52.03％。
2、香草醛-冰醋酸显色法测定总皂苷含量
精密称取5.0210mg芦丁标准品于5ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度。配制成1mg/ml甘草酸储备液，按照香草醛-冰醋酸比色法测定：分别精密吸取100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl甘草酸标准品溶液，氮气吹干后，分别加入200μl5％香草醛—冰醋酸溶液和800μl高氯酸溶液，60℃下水浴15min，冰水冷却后，立即加入5ml冰醋酸后摇匀，以相应试剂做空白，550nm下采用紫外分光光度计测定吸光度值，以样品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。甘草酸标准品的回归方程为：y＝8.352x+0.041。精密称取1.0120mg，采用紫外分光光度法测定，甘草皂苷纯度为23.13％。联合dm130大孔树脂和聚酰胺树脂纯化法可将甘草中的黄酮组分较好地分离纯化，且将皂苷组分的影响降到最低。
3、高效液相-质谱技术对纯化的黄酮组分进行成分鉴定：
液相条件：waters2695高效液相色谱仪(waters2996dad检测器，美国waters公司)色谱条件：kromasilc18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相a为0.5％醋酸，流动相b为甲醇，流动相c为乙腈；流速0.8ml/min；柱温30℃；检测波长为254nm；进样体积10μl。
质谱条件：finniganltqxl离子肼质谱仪，esi电喷雾离子源：美国thermo公司。负离子电离方式，质谱扫描范围：120-1000m/z，喷雾电压5kv，金属毛细管温度250℃，鞘气(n2)流速50bar，辅助气(n2)为5bar，反吹气(n2)1bar。鉴定出10个主要的黄酮化合物(表6所示)：
表6甘草黄酮所鉴定出的化合物
包括：甘草素葡萄糖芹糖苷、甘草苷、异甘草素葡萄糖芹糖苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、刺芒柄花素、甘草瑞酮、甘草酸、甘草香豆素。