本发明涉及低铁补血剂、黑木耳黑色素活性成分及其用途。
背景技术：
：缺铁性贫血(irondeficiencyanemia，ida)是人体内铁储备耗竭导致血红蛋白合成减少而引起的贫血。这类贫血的特点是骨髓、肝、脾等组织中缺乏可染色铁，血清铁、转铁蛋白饱和度和铁蛋白降低。导致缺铁性贫血的发病原因较多，一般归纳为：(1)铁需要增加，多发生于婴幼儿和妊娠期妇女；(2)铁摄入不足及吸收不良，造成铁摄入不足的常见原因是食物中铁的含量不足、偏食，食物中蔬菜、谷类、茶叶中的磷酸盐、植酸、单宁酸均会减少铁在胃肠道的吸收；(3)慢性出血，导致慢性失血的原因很多，男性患者一般为胃肠道的急性和慢性出血，女性患者的患病原因多为月经过多。缺铁性贫血最终结果均是由于体内的铁不足以维系机体代谢对铁的需求，影响血细胞内血红素的合成从而导致缺铁性贫血的发生。作为全世界发病率居高不下的营养缺乏类型疾病之一，缺铁性贫血不同程度的影响着全世界约22亿人口，该病在发展中国家的发病率明显高于发达国家，在我国各阶层及年龄段人群中缺铁性贫血发病率约为20％，情况严重地区儿童缺铁性贫血的发病率高达70％。根据调查显示：在6个月～2岁婴幼儿中铁缺乏症的年发病率为75.0％～82.5％、妊娠3个月以上妇女患有铁缺乏症的比例为66.7％、育龄妇女此比例为43.3％，10岁～17岁青少年此比例为13.2％；以上人群中缺铁性贫血(ida)患病率分别是33.8％～45.7％，19.3％，11.4％，9.8％。当缺铁性贫血发生时，机体最开始的改变是多个组织或器官缺铁，表现为铁缺乏症，组织中与铁相关的酶活性和酶活力显著下降，患有缺铁性贫血的人表现出体力、免疫力、肌肉耐力等下降，由于血红蛋白和红细胞数量的减少，血液的运氧能力下降，这可导致组织缺氧，患者出现神疲乏力、精神状态下降、胸闷气短、头晕目眩等症状。世界上大多数人口的饮食中是缺乏铁元素，尤其是在以植物性食物为主的国家。在预防和治疗缺铁性贫血过程中，口服铁剂显然是最为理想的，使用铁补充剂或营养强化剂是目前用于治疗或防治缺铁性贫血的主要方法，由于其简单方便易于临床应用，膳食补铁和口服补铁药物来预防和治疗缺铁性贫血被广泛应用。截至目前，世界卫生组织允许使用的用于治疗缺铁性贫血的补血剂大概有30余种，这些铁补充剂按照铁的存在状态主要分为无机铁和有机铁两大类，按照其在人体中的存形式分为血红素铁和非血红素铁两大类。然而，虽然这些补铁剂经过了长期的应用和发展，但仍存在一些不足和其他副作用。亚铁盐类化合物是补铁效果最好的补铁剂，但可以引起多种副作用。研究发现口服补铁剂可能会使结肠中产生的自由基增加导致粘膜细胞损伤，还可以增加大鼠结肠中的脂质过氧化，从而影响肠上皮细胞完整性；另有研究发现，铁缺乏和铁超载都与免疫应答受损有关，原因在于服用补铁剂后会有大量不能被人体吸收的铁进入肠道所导致。长期服用补铁剂的副作用包括上腹疼痛、恶心、腹泻、便秘，以至于患者不得不停止治疗。为了能够治疗缺铁性贫血，患者在忍受高剂量水平铁剂补充带来痛苦的同时，大量未被吸收的铁会随着食物和胃肠的蠕动到达大肠而被肠道菌群利用，打破肠道菌群的平衡，对肠道健康造成不利的影响。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有补铁剂会引起恶心、腹痛、腹泻、便秘，肠道菌群失调、对胃肠健康造成危害等副作用，在保持至少相等补血效果的同时大量降低药剂中的铁含量，避免铁超载影响人体免疫应答，而提供的低铁补血剂、黑木耳黑色素活性成分f1及其用途。黑木耳黑色素活性成分f1按以下步骤制备获得：一、将黑木耳黑色素以5mg/ml的浓度溶于naoh溶液中，然后上样葡聚糖凝胶sephadexg-200柱；二、用浓度为50mmol/l、ph为7.5的pbs缓冲液进行洗脱，流速为1.2ml/min，收集第34～50min洗脱液，并调节ph值至2，然后静置、再4000r/min离心15min后用蒸馏水洗涤沉淀，之后真空冷冻干燥，即得到黑木耳黑色素活性成分f1；其中，步骤一中naoh溶液的浓度为0.2mol/l。本发明中黑木耳黑色素的制备方法：黑木耳经烘干后粉碎，过60目筛。准确称取黑木耳粉末样品10g，加入250ml浓度为3mol/l的盐酸，70℃下搅拌浸提1h，混合物经4000r/min离心15min，分离上清和沉淀，收集沉淀用氢氧化钠调节ph值至12，充分溶解搅拌后，再经4000r/min离心15min，取上清，上清液用浓度为3mol/l的盐酸调节ph至2，静置，4000r/min离心15min后得到黑色素粗品，黑色素粗品用浓度为7mol/l的hcl在100℃下水解2h，10000r/min离心20min，沉淀依次用氯仿、乙酸乙酯和乙醇洗涤，之后沉淀再用蒸馏水洗涤3～5次，再一次离心，取沉淀，经冷冻干燥即得黑色固体粉末状的黑木耳黑色素。本发明黑木耳黑色素活性成分f1的红外扫描图谱如图1所示，其结构特点与复杂的生物大分子的结构特点十分相似，黑木耳黑色素活性成分f1具有多种官能团才得以使其红外光谱扫描图中具有多个宽而强的吸收峰。在黑木耳黑色素活性成分f1的红外光谱扫描图谱中，在3200cm-1附近出现的宽峰，是由oh和nh2基团伸缩振动引起的；在2950～2850cm-1处的吸收峰说明有脂肪族c-h的存在；1650～1500cm-1处的强烈吸收，与芳香族c＝c和coo的振动有关；1400～1200cm-1位置的吸收峰显示酚类coh和吲哚以及nh的存在；800～600cm-1范围的相对小的吸收峰代表着芳香环的存在。在黑木耳黑色素活性成分f1的1hnmr光谱中，0.8～1.0ppm范围为脂肪族区，出现的信号认定为烷基片段的ch3基团，例如ch2ch3，ch(ch3)2，可能来自残留的蛋白质；在2.0ppm附近的信号是属于亚甲基或酯基(-ococh3)，表明羧酸结构的存在；在4ppm周围的峰被认定为结合于吲哚或吡咯环的甲基(n-ch3)和结合到环上的第一个位置的-och3；6.5和7.3ppm的信号是吲哚或吡咯环的芳香族氢原子；8.5ppm附近的信号是吲哚或吡咯环上的羧基质子。其中，位置在5ppm出现的强信号是溶剂中naoh中h的峰。黑木耳黑色素的1hnmr光谱中，2.0ppm附近的信号强于黑木耳黑色素活性成分f1，说明黑木耳黑色素的羧酸结构比例更高；4ppm周围的峰面积小于黑木耳黑色素活性成分f1，代表吲哚或吡咯环的比例较小。表明黑木耳黑色素含有更多的蛋白质，而黑木耳黑色素活性成分f1含有更多的用来构成骨架的吲哚或吡咯环。将黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素喷涂au后用环境扫描电子显微镜直接成像，观察黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的微观结构。黑木耳黑色素是由表面不规则的球形单体组成，并且呈层层堆叠结构，通过软件测量黑木耳黑色素单体平均粒径约为1μm(如图4所示)。大量黑木耳黑色素单体聚合如图5所示，呈较大体积的不规则块状形态，表面的气孔表示黑木耳黑色素的结合并不紧密。本发明黑木耳黑色素活性成分f1有更明显的片层结构，且表面比黑木耳黑色素光滑，单体间结合的更加紧密(如图6所示)。黑木耳黑色素活性成分f1大量聚合如图7所示，形成较大体积的不规则块状形态，但表面比黑木耳黑色素更光滑致密，说明单纯黑木耳黑色素活性成分f1比黑木耳黑色素结合的更加紧密，单体与单体之间的连接更加坚固。本发明黑木耳黑色素活性成分f1在光照条件下和室温条件下具有比黑木耳黑色素更为优异的稳定性。本发明黑木耳黑色素活性成分f1可以明显提高ida小鼠模型的血红蛋白和血红细胞数，改善造血因子，增加铁吸收，有效改善缺铁性贫血。由于黑木耳黑色素活性成分f1中并不含大量的铁元素，因此不会在结肠中产生自由基损伤粘膜细胞，不会增加结肠中的脂质过氧化，影响肠上皮细胞的完整性。而且不会损害人体免疫应答系统，不会引起恶心、腹痛、腹泻、便秘等不良症状。本发明黑木耳黑色素活性成分f1能够改善缺铁性贫血人群肠道菌群结构、增加丰度。低铁补血剂主要由木耳黑色素活性成分f1组成。其中，低铁补血剂中还包括黑木耳黑色素。黑木耳黑色素活性成分f1作为低铁补血剂的应用。黑木耳黑色素作为低铁补血剂的应用。黑木耳黑色素活性成分f1作为缺铁性贫血患者肠道菌群调节剂的应用。黑木耳黑色素作为缺铁性贫血患者肠道菌群调节剂的应用。黑木耳黑色素活性成分f1可以有效提高缺铁性贫血小鼠红细胞数量及血红蛋白的浓度，灌胃口服黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的缺铁性贫血小鼠红细胞的数量和血红蛋白浓度均显著高于ida组，并恢复到正常水平。黑木耳黑色素活性成分f1对缺铁性贫血的恢复作用并不受饮食成分的干扰。附图说明图1是本发明黑木耳黑色素活性成分f1的红外扫描图谱。图2是本发明黑木耳黑色素活性成分f1的1hnmr扫描图谱。图3是黑木耳黑色素的1hnmr扫描图谱。图4是黑木耳黑色素的扫描电镜图。图5是大量单体聚合黑木耳黑色素的扫描电镜图。图6是黑木耳黑色素活性成分f1的扫描电镜图。图7是大量单体聚合黑木耳黑色素活性成分f1的扫描电镜图。图8是实验2中根据各组小鼠粪便总dna，得到的小鼠肠道菌群细菌群落组成分析图谱。图9是实验3中黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素自然光照射条件下保存率检测结果图。图10是实验3中黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素室温条件下保存率检测结果图。具体实施方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式黑木耳黑色素活性成分f1按以下步骤制备获得：一、将黑木耳黑色素以5mg/ml的浓度溶于naoh溶液中，然后上样葡聚糖凝胶sephadexg-200柱；二、用浓度为50mmol/l、ph为7.5的pbs缓冲液进行洗脱，流速为1.2ml/min，收集第34～50min洗脱液，并调节ph值至2，然后静置、再4000r/min离心15min后用蒸馏水洗涤沉淀，之后真空冷冻干燥，即得到黑木耳黑色素活性成分f1；其中，步骤一中naoh溶液的浓度为0.2mol/l。黑木耳黑色素及黑木耳黑色素活性成分f1的元素含量如表1所示，黑木耳黑色素的n、c、h、s四种元素的含量均高于黑木耳黑色素活性成分f1。其中，黑木耳黑色素的n含量为10.38％高于黑木耳黑色素活性成分f1的n含量，说明黑木耳黑色素可能含有更多的蛋白质，这与傅里叶红外扫描图的结果相互印证。表1注：表中o％＝100％-n％-c％-h％-s％本实施方式所使用的黑木耳为东宁黑木耳产业基地提供，菌种编号：hdxz-1。铁调素(hepcidin)作为铁代谢调节中最关键的调节分子(如胰岛素调节血糖一样)，调节人体对铁的代谢吸收能力，铁调素的活性与人体铁吸收能力呈负相关性。分析认为黑木耳黑色素活性成分f1可作用于铁调素，提高铁的吸收和利用。低温有利于黑木耳黑色素活性成分f1的保存，长时间加热会降低黑木耳黑色素活性成分f1保存率；ph值会显著的影响黑木耳黑色素活性成分f1的溶解性，碱性条件更有利于黑木耳黑色素活性成分f1的溶解；k+、ca2+和mg2+会显著降低黑木耳黑色素活性成分f1的吸光值，cu2+和fe3+会使黑木耳黑色素活性成分f1的吸光值升高；黑木耳黑色素活性成分f1容易被氧化剂氧化，但还原剂对其稳定性没有显著影响；苯甲酸钠、山梨酸钾、谷氨酸钠和丁基化羟基茴香醚这四种食品添加剂对黑木耳黑色素活性成分f1稳定性影响不大。黑木耳黑色素活性成分f1以吡咯环和吲哚环为骨架，骨架上连接着脂肪碳链和羰基，这些结构大量聚合后形成不规则的单体，单体以层叠的形式聚合，组成表面较光滑的不规则黑木耳黑色素活性成分f1。在207nm处有强吸收峰，通过对黑木耳黑色素活性成分f1中s元素的含量计算可知，黑木耳黑色素活性成分f1中真黑色素与棕黑色素的含量比为10.36:1。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中葡聚糖凝胶sephadexg-200均先用浓度为50mmol/l、ph为7.5的pbs缓冲液冲洗稳定后再上样。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点步骤二中葡聚糖凝胶sephadexg-200直径为1.6cm、长度为64cm。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。具体实施方式四：本实施方式低铁补血剂主要由木耳黑色素活性成分f1组成。本实施方式低铁补血剂中还可以包括黑木耳黑色素；黑木耳黑色素与黑木耳黑色素活性成分f1的质量比为1～100:1。具体实施方式五：本实施方式黑木耳黑色素活性成分f1作为低铁补血剂的应用。具体实施方式六：本实施方式黑木耳黑色素作为低铁补血剂的应用。具体实施方式七：本实施方式黑木耳黑色素活性成分f1作为缺铁性贫血患者肠道菌群调节剂的应用。具体实施方式八：本实施方式黑木耳黑色素作为缺铁性贫血患者肠道菌群调节剂的应用。实验1：1.1缺铁性贫血小鼠模型造模方法参照《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中的方法，试验采用体重14.0±1.7g昆明种24日龄雄性小鼠，小鼠在实验室适应3～5天后，随机选取130只小鼠开始喂饲低铁饲料，饮用去离子水，采用非铁制笼盖和塑料笼体，严格避免铁的污染。两周后随机选10只小鼠从尾部采血，采用血细胞自动分析仪测定小鼠的血红蛋白含量，若饲低铁饲料试验小鼠平均血红蛋白(hb)≤100g/l为造模成功。1.2小鼠饲养和分组小鼠饲养于黑龙江大学生命科学学院动物培养室。实验室设施条件及动物日常管理工作依照《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》实施，环境温度为20±2℃，环境相对湿度为45％～65％，自动控制12h昼夜更替。造模成功后，随机分成4组，每组30只，分别为缺铁性贫血组(ida)，缺铁性贫血+黑木耳黑色素组(ida+m)，缺铁性贫血+黑木耳黑色素活性成分f1组(ida+f1)，缺铁性贫血+硫酸亚铁组(ida+fe2+)；另外取30只29日龄正常健康雄性小鼠作为正常对照组(control)。control组和ida组灌胃蒸馏水，ida+m组灌胃黑色素、给药剂量为200mg/kg·d，ida+f1组灌胃黑色素f1、给药剂量为179.51mg/kg·d，ida+fe2+组灌胃硫酸亚铁组、给药剂量为5mg/kg·d，连续灌胃。正常组始终饲喂正常饲料，各缺铁性贫血组始终饲喂低铁饲料。自试验开始，所有组小鼠每7d测量一次体重，并做好记录。停止灌胃当天，取小鼠眼球血，用于外周血常规分析、血清促红细胞生成素(epo)、干细胞因子(scf)、血清特异转录因子gata-1、血清铁(si)含量的测定。实验观察：造模过程中小鼠开始出现掉毛，皮毛稀疏，脚爪和尾部皮肤苍白，活动减少，萎蔫，畏寒怕冷等现象，随着试验的延长，以上现象越发明显，并且生长缓慢，皮毛失去光泽。血常规指标可见，造模结束后小鼠血红蛋白(hb)含量、红细胞数(rbc)、红细胞压积(hct)、血小板数(plt)与control组相比分别下降了47.5％、36.89％、37.58％、64.46％，具有统计学上的极显著差异(p<0.01)，平均红细胞体积(mcv)与control组相比下降了16.15％，有显著性差异(p<0.05)。ida组小鼠平均血红蛋白含量(hb)≤100g/l，红细胞数(rbc)≤7.7×1012/l，红细胞压积(hct)≤36％，平均红细胞体积(mcv)≤48μm3，血小板数(plt)≤157×106/l。表明饲喂低铁饲料的小鼠出现了明显的贫血现象，说明造模成功。表2造模结束时小鼠外周血象hb(g/l)rbc(1012/l)hct(％)mcv(μm3)plt(106/l)正常对照组166.67±15.2810.93±0.7451.67±4.7351.13±2.06192.67±29.56模型组87.50±12.58**6.90±0.63**32.25±3.59**42.88±2.90*68.50±24.84**参考值100～1907.7～12.536～5048～51157～260正常组始终饲喂正常饲料，各缺铁性贫血组始终饲喂低铁饲料。实验前2周小鼠均灌胃蒸馏水，小鼠处于快速生长期，各缺铁性贫血组与正常饲料组体重稳步增长，各组间没有差异(p<0.05)。从第3周开始给予相应的灌胃(ida+m组灌胃黑色素、给药剂量为200mg/kg·d，ida+f1组灌胃黑色素f1、给药剂量为179.51mg/kg·d，ida+fe2+组灌胃硫酸亚铁、给药剂量为5mg/kg·d)各组小鼠的体重都随着时间的延长而稳步增加，但是增加的速度各不相同，control组体重增长最快，ida+m组次之，ida+f1组小鼠增长速度略低于ida+m组，ida+fe2+组体重增长速度低于ida+f1组，ida组的体重低于其余各组，为各组最低。各组小鼠血液常规如表3所示。给予药物灌胃干预3周后，ida+f1组小鼠红细胞数、血红蛋白量、红细胞压积、平均红细胞体积、平均血红蛋白量、平均血红蛋白浓度、血小板相对于ida组平均升高了43.56％、94.34％、60％、6.31％、14.33％、5.42％、21.81％(p<0.05)，同时与control组无显著差异(p>0.05)，已达到正常水平；黑木耳黑色素活性成分f1可以有效改善小鼠缺铁性贫血。黑木耳黑色素活性成分f1可以有效提高缺铁性贫血小鼠红细胞数量及血红蛋白的浓度，灌胃黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的缺铁性贫血小鼠红细胞的数量和血红蛋白浓度均显著高于ida组，并恢复到control组水平。而ida组小鼠血红蛋白，红细胞数仍然保持较低的水平，处于贫血状态，说明试验期间持续的饲喂低铁饲料，保证了小鼠不会因饮食恢复正常而使得贫血的得到恢，从侧面验证了黑木耳黑色素活性成分f1对缺铁性贫血的作用非因饮食改变而使得贫血得到恢复。小鼠血液常规检测数据反映出黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素具有提高红细胞压积、红细胞体积、平均血红蛋白量和平均血红蛋白浓度的作用。表3controlidaida+fe2+ida+mida+f1wbc(109/l)6.42±0.90a1.82±0.50c3.28±1.06b6.45±1.20a6.80±0.86arbc(1012/l)10.10±0.82b7.15±0.74c10.88±0.92ab11.38±1.37a10.22±1.31bhb(g/l)155.00±15.17bc85.00±15.17d156.67±8.16bc171.67±7.53ab171.67±11.69abhct(％)51.67±6.22a38.83±4.75b51.17±4.36a54.50±8.02a52.00±6.72amcv(fl)51.08±2.69a47.58±2.81b47.05±2.52b52.63±1.55a50.30±3.10amch(pg)15.37±0.54ab13.88±1.33c14.43±0.58bc15.90±0.47a15.15±1.67abmchc(g/l)300.67±8.82cd291.33±12.31d307.17±18.03c340.67±9.56a314.50±14.27bplt(109/l)818.33±262.94ab653.33±269.79b1058.33±132.27a885.00±227.93ab806.17±109.43b试验期间持续饲喂低铁饲料，排除了小鼠贫血症状恢复受饮食成分干扰的因素。实验时间3周，ida+fe2+组小鼠平均红细胞体积相对于control组出现了显著下降，血清干细胞因子下降3.86％，血清促红细胞生成素的浓度显著下降11.05％，血清特异转绿因子gata-1的浓度则显著的降低20.26％，这都显示硫酸亚铁在治疗缺铁性贫血时，除了引起肠胃不适症状外，很可能会对机体造血功能造成损害，存在较大的潜在危险；而ida+m组和ida+f1组小鼠均未出现上述症状。实验时间3周，虽然ida+fe2+组小鼠白细胞数比ida组有比较大的回升，但是仍然明显低于control组、ida+m组和ida+f1，实验是时间延长至2个月，ida+fe2+组小鼠白细胞数仍维持在(3.46±1.21)×109/l没有改善；而且ida+fe2+组小鼠还出现腹泻、便秘，情绪烦躁等情况，而ida+m组和ida+f1组小鼠均未出现类似症状。各组小鼠的造血功能因子数据如表4所示。表4controlidaida+fe2+ida+mida+f1scf751.90±50.92bc827.31±64.84b610.48±98.13d904.01±53.30a889.91±52.19aepa136.57±13.64c137.62±11.62c154.65±11.38b182.28±17.70a181.70±14.66agata-111.35±2.12ab10.72±1.02c10.66±1.62c13.00±0.42a13.08±1.53asi1.24±0.06b0.75±0.04d1.20±0.14c1.44±0.06a1.41±0.14a干细胞因子scf是重要的造血细胞因子，血清scf低下可作为引起造血功能障碍的原因，并且scf对于造血干细胞和早期祖细胞粘附骨髓造血微环境起着关键作用。与ida组相比，ida+m组和ida+f1组血清干细胞因子的浓度分别显著升高了12.89％和10.21％(p<0.05)，而ida+fe2+组血清干细胞因子的浓度并没有显著差异(p>0.05)。并且相比于control组，ida+m组和ida+f1组血清干细胞因子浓度显著升高了19.20％和16.37％(p<0.05)，而ida组的血清干细胞因子浓度略有升高，但并不显著(p>0.05)。由此可见，当机体发生缺铁性贫血时，机体自身的应激反应会使得机体的血清干细胞因子浓度升高，但这一升高并不显著，在缺铁性贫血发生时灌胃黑木耳黑色素和黑木耳黑色素活性成分f1可以显著提高血清干细胞因子浓度，这表明黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素有较好的促进血清干细胞因子产生的功能。促红细胞生成素(epo)是一种主要有肾脏产生的糖蛋白激素，是参与红系造血的主要调控因子，具有促进红系祖细胞增殖、分化，维持红细胞、血红蛋白稳定的作用。与ida组相比，ida+m组和ida+f1组小鼠血清促红细胞生成素浓度显著提高28.48％和26.25％(p<0.05)，然而，ida+fe2+组小鼠血清促红细胞生成素的浓度与ida组没有显著差异(p>0.05)；当缺铁性贫血发生时，小鼠血清促红细胞生成素浓度并没有降低，但control组没有显著差异(p>0.05)。由此可见，当缺铁性贫血发生时，给予黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素会提高血清促红细胞生成素的浓度。血清铁(si)是指在血液中与转铁蛋白结合了的铁，是和转铁蛋白结合形成的复合物，血清铁用于鉴别缺铁性以及非缺铁性的贫血。而转铁蛋白对铁的结合和转运能力受到调节因子铁调素的调控，并与其呈负相关关系。ida+f1组与control组和ida+m组血清铁浓度无显著差异(p>0.05)，均维持在正常水平；与ida组小鼠相比，ida+m组和ida+f1组小鼠的血清铁浓度有显著提高(p<0.05)，分别提高了87.53％和84.68％；而ida+fe2+组小鼠的血清铁浓度并没有得到恢复，与ida组无显著差异(p>0.05)。由此可见，对于ida组小鼠而言，补充黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素可以使得血清铁浓度得到恢复。综上，黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素可以改善贫血状况，由于现有补铁、补血药剂都是在其中加入大量铁源，通过大量的铁元素补充来改善人体缺铁、贫血的症状。一旦停药，缺铁性贫血很容易复发，而持续仓时间服用对人体造血机能反而造成不良影响。本发明不是利用增加铁源单纯性的补铁，黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素能够激活和提高体内的血清干细胞因子浓度，所以用药后会持续、长时间产生补铁、补血效果，具有作用时间长、缺铁性贫血不易复发，长时间服用安全有效的优点。实验2：2.1缺铁性贫血小鼠模型造模方法参照《保健食品检验与评价技术规范实施手册》中的方法，试验采用体重14.0±1.7g昆明种24日龄雄性小鼠，小鼠在实验室适应3～5天后，随机选取70只小鼠开始喂饲低铁饲料，饮用去离子水，采用非铁制笼盖和塑料笼体，严格避免铁的污染。两周后随机选10只小鼠从尾部采血，采用血细胞自动分析仪测定小鼠的血红蛋白含量，若饲低铁饲料试验小鼠平均血红蛋白(hb)≤100g/l为造模成功。2.2小鼠饲养和分组小鼠饲养于黑龙江大学生命科学学院动物培养室。实验室设施条件及动物日常管理工作依照《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》实施，环境温度为20±2℃，环境相对湿度为45％～65％，自动控制12h昼夜更替。造模成功后，随机分成3组，每组20只，分别为缺铁性贫血组(ida)，缺铁性贫血+黑木耳黑色素活性成分f1组(ida+f1)，缺铁性贫血+硫酸亚铁组(ida+s)；另外取20只29日龄正常健康雄性小鼠作为正常对照组(control)。实验4周，正常组始终饲喂正常饲料，各缺铁性贫血组始终饲喂低铁饲料。control组和ida组小鼠灌胃蒸馏水，ida+f1组灌胃黑色素f1、给药剂量为179.51mg/kg·d，ida+s组灌胃硫酸亚铁组、给药剂量为5mg/kg·d。2.3提取各组小鼠粪便总dna实验观察：根据各组小鼠粪便总dna，分析获得各组小鼠肠道菌群细菌群落组成分如图8所示。s24-7_norank种属细菌在正常组、正常+硫酸亚铁组、正常+黑木耳黑色素组和缺铁性贫血+黑木耳黑色素组小鼠肠道内是丰度最高的菌群，丰度值分别是23.48％、46.73％、24.85％和24.77％；但是，在缺铁性贫血组和缺铁性贫血+硫酸亚铁组小鼠肠道内，丰度最高的细菌是allobaculum种属细菌，丰度值分别为30.74％和29.65％。丰度第二的菌群在正常组为alistipes，丰度为10.73％；在正常+硫酸亚铁组和正常+黑木耳黑色素组分别为ruminococcaceae_uncultured和ruminococcaceae_unclassified，丰度分别为7.81％和11.36％；在缺铁性贫血组和缺铁性贫血+硫酸亚铁组为s24-7_norank，丰度分别为20.90％和17.21％；在缺铁性贫血+黑木耳黑色素组为bacteroides，丰度为15.99％；丰度第三的菌群在正常+硫酸亚铁组和缺铁性贫血+硫酸亚铁组为alistipes，丰度分别为6.90％和14.27％；在正常对照组为prevotellaceae_uncultured，丰度为9.51％，在正常+木耳黑色素组为blautia，丰度为9.09％；在缺铁性贫血组为bacteroides，丰度为9.60％；在缺铁性贫血组为allobaculum，丰度为9.53％。黑木耳黑色素活性成分f1可以扭转缺铁性贫血小鼠肠道内丰度出现的下降，s24-7_norank,alistipes,ruminococcaceae_uncultured,blautia,ruminococcaceae(瘤胃菌科)_unclassified,prevotellaceae_uncultured(普雷沃菌属)等6个主要种属细菌的丰度。黑木耳黑色素活性成分f1可以降低缺铁性贫血小鼠肠道内丰度升高的支原体科allobaculum和紫单胞菌科parabacteroides丰度。说明发生缺铁性贫血时，小鼠肠道内占主要地位菌群的丰度发生显著改变，黑木耳黑色素活性成分f1可以对主要菌群的丰度变化起到调节作用，使其得到恢复；而硫酸亚铁则无法达到上述效果。黑木耳黑色素活性成分f1相对于硫酸亚铁，不会对正常小鼠肠道菌群的种属分类水平的丰度产生显著差异性影响，而会对缺铁性贫血小鼠肠道菌群的丰度产生显著差异性影响。小鼠肠道菌群整体差异性分析发现黑木耳黑色素活性成分f1可以缩小缺铁性贫血小鼠肠道菌群与正小鼠的差异，而硫酸亚铁无此作用。小鼠肠道菌群微生物多样性指数分析发现，在缺铁性贫血发生时，小鼠肠道菌群的丰度、均匀度及多样性指数都会降低，给予缺铁性贫血小鼠和正常组小鼠黑木耳黑色素活性成分f1，其肠道菌群的丰度、均匀度和多样性均会增加；给与缺铁性贫血小鼠硫酸亚铁，肠道菌群的丰度、均匀度和多样性指数仅有略微上升。小鼠肠道代谢物分析：发生缺铁性贫血时，小鼠肠道内丙酸、丁酸、乳酸含量显著降低，并低于正常对照组，乙酸的含量无显著变化。黑木耳黑色素活性成分f1可以显著提高缺铁性贫血小鼠肠道内丙酸、丁酸、乳酸的含量，硫酸亚铁除可以显著提高小鼠肠道内乳酸的含量，但反而会使得小鼠肠道内丙酸、丁酸含量显著低于缺铁性贫血组。实验证明黑木耳黑色素活性成分f1提高缺铁性贫血小鼠肠道菌群丰度、均匀度和多样性指数，缩小缺铁性贫血小鼠与正常小鼠肠道菌群的差异，具有一定的调节肠道菌群的作用。黑木耳黑色素活性成分f1可以显著提高缺铁性贫血小鼠肠道内丙酸、丁酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、氨基酸等代谢物的浓度，并能从总体上缩小贫血小鼠与正常小鼠肠道代谢物的差异，使其肠道代谢物的异常变化得到恢复，并逐渐趋于正常。实验3：黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的性能对比试验：3.1光照自然光照射4w(保存率测定结果如图9所示)，黑木耳黑色素活性成分f1及黑木耳黑色素的保存率均呈现下降趋势，且与初始值相比差异显著(p<0.05)。说明光照对黑木耳黑色素的破坏作用随时间延长而增加，可能是由于光照使黑木耳黑色素各组分的结构发生了不同程度的变化，从而使得其保存率有不同程度的下降。所以黑木耳黑色素对光照敏感，需避光保存。对比发现黑木耳黑色素活性成分f1较黑木耳黑色素在光照条件下的稳定性更好，二者在第3w和第4w的保存率呈现显著性差异(p>0.05)。黑木耳黑色素活性成分f1对光照射的稳定性优于黑木耳黑色素。3.2室温将黑木耳黑色素活性成分f1及黑木耳黑色素置于温度为25℃环境中，黑木耳黑色素活性成分f1的保存率随着时间的延长没有显著差异(p>0.05)，而黑木耳黑色素在各时间段间保存率下降显著(p<0.05)，测定结果如图10所示。说明黑木耳黑色素活性成分f1在室温条件下具有比黑木耳黑色素更为优异的室温耐保存性。当前第1页12