本发明涉及药物化学技术领域，具体地说，是关于一种五元杂环咪唑或三氮唑类化合物作为突变型idh1抑制剂的用途。
背景技术：
异柠檬酸脱氢酶(idh)是参与细胞能量代谢的三羧酸循环中的关键限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-kg)及co2。idh酶家族有两类不同的亚型，其中一类亚型利用nad(+)作为电子受体，另一类亚型利用nadp(+)作为电子受体。已经报道的idh家族有五种同工酶，其中3种为nad(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶，它们位于线粒体基质中；还有两种为nadp(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶，异柠檬酸脱氢酶1(idh1)位于胞质中，异柠檬酸脱氢酶2(idh2)位于线粒体中。
异柠檬酸脱氢酶的突变发生于很多种类型的癌症，比如脑胶质瘤、胶质母细胞瘤、副神经细胞瘤、急性白血病、前列腺癌、甲状腺癌、结肠癌、软骨肉瘤、胆管上皮癌、外周t细胞白血病、黑色素瘤等[dang,l.；su,s.m.isocitratedehydrogenasemutationand(r)-2-hydroxyglutarate:frombasicdiscoverytotherapeuticsdevelopment.annu.rev.biochem.2017,86:305-331]。其中，多种肿瘤中均发现了idh1的突变。idh1突变(idh1m)会导致其正常功能缺失，并将α-kg转化为致癌代谢物2-羟基戊二酸(2-hg)，使2-hg在突变的肿瘤细胞中累积[dang,l.等,cancer-associatedidh1mutationsproduce2-hydroxyglutarate.nature2009,462:739-744]。研究表明，α-kg与2-hg结构相似，2-hg与α-kg竞争，由此降低了α-kg依赖性酶的活性，导致一些基因组关键区域的核小体和/或dna高度甲基化，这种表观遗传改变被认为干扰了正常的细胞分化，导致未成熟细胞过度增殖，从而引发癌症。2009年，bleeker等对672例不同来源的肿瘤和84个不同的肿瘤细胞系进行了idh1突变的检测，发现这种突变特异性集中发生在脑胶质瘤中[bleeker等,idhlmutationsatresiduep.r132(idh1(r132))occurfrequentlyinhigh-gradegliomasbutnotinothersolidtumers.hummutat.2009,30:7-11]。但后续的文献报道显示，急性髓细胞白血病、前列腺癌、副神经节瘤等也存在idh1的突变[green等,somaticmutationsofidhlandidh2intheleukemictransformationofmyeloproliferativeneoplasms.nengljmed.2010,362:369-370]。bleeker等发现在idh1突变的病例中，r132h占了86.9％。其它类型如r132c、r132g、r132l、r132v、r132s所占比例较小。
在含idh1突变的肿瘤细胞中，突变型idh1抑制剂可特异结合于突变酶蛋白催化结构域，通过变构抑制等方式，有效抑制突变蛋白酶活，使体内致癌代谢物2-hg减少，从而诱导组蛋白和/或dna的去甲基化，达到促进肿瘤细胞分化，抑制肿瘤发展的效果。目前以突变的idh1为靶点的小分子抑制剂还没有上市的药物。在研药物中发展到最前端的是agios公司的ag-120，目前处于临床三期阶段[janeta等,discoveryofag-120(ivosidenib):afirst-in-classmutantidh1inhibitorforthetreatmentofidh1-mutantcancerspopovici-muller,acsmedicinalchemistryletters2018,doi:10.1021/acsmedchemlett.7b00421]。其次就是novartis的idh-305正处于临床二期阶段。而其他几家公司的突变型idh1小分子抑制剂均还处于临床一期阶段，例如bay-1436032、ft-2102和ds-1001。然而在我们国内，这一块领域的发展还是空白，甚至还没有处于临床研究的突变型idh1抑制剂药物分子，因此持续急需新型的、高效低毒的突变型idh1的抑制剂。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物作为突变型idh1抑制剂的用途。本发明的第二个目的是提供一种通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物或水合物或光学异构体、或其互变异构体或其前体药物或其多晶型物作为突变型idh1抑制剂的用途。本发明的第三个目的是提供一种如通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物用作制备治疗与突变型idh1相关的疾病的药物的应用。本发明的第四个目的是提供一种如通式i所述的化合物作为先导物进行结构修饰的应用。本发明的第五个目的是提供一种药物组合物。所述的化合物能有效抑制idh1突变体的活性，降低细胞内2-hg水平，具有重要的研发价值和开发意义。
基于以上目的，本发明的第一个方面，提供一种通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物作为突变型idh1抑制剂的用途，
其中，
x选自n或ch；
y选自s或ch2；
m为0或1；
n为0或1；
p为0或1；
q为0、1或2；
r1独立选自氢、卤素、苯基、苯巯基、对氰基苯基或取代的哌嗪环，当r1为取代的哌嗪环时，所述r1为：
r2选自羟基、苯基或单卤素取代的苯基；
r3独立选自氢、卤素、正戊氧基或三氮唑基；
r4选自氢、醛基或酯基；当r4为酯基，所述r4为
(1)当a环存在时，
a环选自苯环、噻吩、苯并噻吩、嘧啶环、三氮唑环、哌啶环、哌嗪环、环丙烷环或脂肪环；当a环为脂肪环时，r1选自双键，r1与a环形成
l选自ch2、
且l与r2形成取代环状结构
(2)当a环不存在时，
l选自甲基或
且l与r2形成取代的双键或成环，
根据本发明，突变型idh1抑制剂可用于制备治疗突变型idh1相关的疾病的药物；和/或，用于体外非治疗性地抑制idh1突变；和/或，用于体外非治疗性地抑制肿瘤细胞增殖；和/或，用于预防和治疗与突变型idh1相关的疾病。
本发明的第二个方面，提供一种通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物或水合物或光学异构体、或其互变异构体或其前体药物或其多晶型物作为突变型idh1抑制剂的用途。
本发明的第三个方面，提供一种通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物用作制备治疗与突变型idh1相关的疾病的药物的应用。
根据本发明，所述突变型idh1相关的疾病包括恶性肿瘤，所述恶性肿瘤包括脑胶质瘤、胶质母细胞瘤、胆管上皮癌、白血病、纤维肉瘤、直肠癌。
根据本发明，所述突变型idh1为r132h、r132c、r132l、r132v、r132s、r132g中的一种或多种。
进一步的，所述药物可以为注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、膏剂、悬浮剂、吸入剂等，以便于给药。即结合现代常用的药物制剂手段，可将所述的化合物制成注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、膏剂、悬浮剂、吸入剂等，从而采用比较方便的给药形式。
应理解，上述各种剂型的药物均可按照药学领域众所周知的常规方法制备。
本发明的第四个方面，提供一种如通式i所述的化合物作为先导物进行结构修饰的应用，以获得活性更好的化合物，并用于制备治疗突变型idh1相关的疾病的药物。
本发明的第五个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的权利要求1或2的通式i所示的五元杂环咪唑或三氮唑类化合物、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物或水合物或其光学异构体、或其互变异构体或其前体药物或其多晶型物、以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步的，所述药物组合物可以制成注射剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、栓剂、膏剂、悬浮剂、吸入剂等，以便于给药。
应理解，上述各种剂型的药物均可按照药学领域众所周知的常规方法制备。
本发明的有效量指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量；本发明的药学上可接受的载体为用于治疗给药的载体，它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。
在本发明的实施方案中，优选表1中列举的通式i所示的化合物。
表1通式i的示例性化合物
本发明的有益效果是：通式i所述的化合物能有效抑制idh1突变体的活性，降低细胞内2-hg水平，从而为突变型idh1相关的疾病治疗提供一种新的手段和途径，具有重要的研发价值和开发意义。
附图说明
图1为部分化合物对u87mgidh1r132h细胞中2-hg水平抑制活性图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。除非另外说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择，或按照制造厂商提供或所建议的条件。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同，此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明的方法中。
本实施例的化合物的合成
(1)本实施例的对照化合物为ag-120，cas：1448347-49-6，商业购得，结构式如下：
(2)本发明的部分化合物可从商用和/或公开的化合物库获得，例如本发明部分化合物购自上海毕得医药科技有限公司或北京伊诺凯科技有限公司或上海超岚化工科技中心或上海阿拉丁生化科技股份有限公司或梯希爱(上海)化成工业发展有限公司或韶远化学科技(上海)有限公司或上海昀冠机电设备有限公司。
(3)本发明的其它化合物可由普通技术人员使用化学合成领域中众所周知的方法例如取代反应合成。例如，可根据下列通用方案制备本发明的化合物。
实施例1化合物30的合成
向2'4'-二氟-2-[1-(1h-1,2,4-三唑基)]苯乙酮(7.30g，32.70mmol)的甲苯(60ml)溶液中加入三甲基碘化亚砜(8.64g，39.30mmol)，然后加入20％氢氧化钠溶液(1.6eq,8ml)。然后将反应混合物在60℃加热4小时。反应结束后，用乙酸乙酯(40ml)萃取。将有机层用饱和食盐水(2x20ml)洗涤，用na2so4干燥并过滤。滤液减压浓缩，最后通过柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/2)，得到淡褐色固体1-((2-(2，4-二氟苯基)环氧乙烷-2-基)-甲基)-1h-1，2，4-三氮唑(3.80g,收率49％)。
1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ7.99(s,1h),7.74(s,1h),7.08(d,j＝7.0hz,1h),6.72(dt,j＝17.2,9.2hz,2h),4.74(d,j＝14.9hz,1h),4.42(d,j＝14.9hz,1h),2.85(d,j＝4.8hz,1h),2.78(d,j＝4.8hz,1h)。
实施例2化合物31的合成
冰浴下，向化合物30(474mg，2mmol)、乙醇(5ml)的混合液中加入甲磺酸(211mg,2.2mmol)搅拌一小时，再加入et3n(1ml)和环丙胺(143mg，2.5mmol)搅拌并回流6小时。通过tlc监测反应，减压蒸发混合物。将水(10ml)加入到残余物中，然后用乙酸乙酯(2x4ml)萃取。然后将有机层合并，并用饱和nacl溶液(3x3ml)洗涤，用无水na2so4干燥并蒸发，通过柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝1/2)，得到白色固体1-(环丙氨基)-2-(2，4-二氟苯基)-3-(1h-1，2，4-三氮唑-1-基)-2-丙醇(73mg，产率12％)。
1hnmr(500mhz,chloroform-d)δ8.06(s,1h),7.75(s,1h),7.46(t,j＝12.3hz,1h),6.76(t,j＝10.2hz,2h),4.83(s,1h),4.53(q,j＝14.2hz,2h),3.28(d,j＝12.4hz,1h),2.90(d,j＝12.4hz,1h),2.05(s,1h),1.56(s,1h),0.39-0.26(m,2h),0.17(ddd,j＝17.4,8.2,4.4hz,2h)。
实施例3化合物32的合成
参照实施例2的合成方法，以哌啶代替环丙胺为起始原料得到白色固体2-(2，4-二氟苯基)-1-(哌啶-1-基)-3-(1h-1，2，4-三氮唑-1-基)-2-丙醇，收率46％。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.30(s,1h),7.73(s,1h),7.40(q,j＝8.7hz,1h),7.13(t,j＝10.7hz,1h),6.94(d,j＝9.1hz,1h),5.66(s,1h),4.54(s,2h),2.79(d,j＝13.9hz,1h),2.63(d,j＝14.0hz,1h),2.31(s,4h),1.30(d,j＝43.4hz,6h)。
实施例4化合物33的合成
参照实施例2的合成方法，以哌嗪代替环丙胺为起始原料得到白色固体2-(2，4-二氟苯基)-1-(哌嗪-1-基)-3-(1h-1，2，4-三氮唑-1-基)-2-丙醇，收率4％。
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ8.61(s,1h),8.31(s,1h),7.76(s,1h),7.39(q,j＝8.9hz,1h),7.18(t,j＝10.3hz,1h),6.98(t,j＝8.3hz,1h),5.84(s,1h),4.63-4.53(m,2h),2.92(s,4h),2.89(s,1h),2.73(d,j＝13.8hz,1h),2.68-2.54(m,4h)。
实施例5化合物对idh1/r132h抑制活性的测定
本实施例通过测定辅助因子nadph的消减来测定化合物对idh1/r132h的抑制活性。将化合物与idh1/r132h和nadph进行孵育，然后通过添加α-kg启动反应，线性条件下反应一定时间后添加硫辛酰胺脱氢酶和相应的底物刃天青进行检测。硫辛酰胺脱氢酶通过消减可供使用的辅助因子nadph而终止idh1/r132h反应，它将nadph氧化成nadp，并且将刃天青还原成高荧光的试卤灵，通过检测试卤灵的生成来量化特定反应时间之后剩余的辅助因子nadph的量。
具体操作方式为：在96孔板中，反应总体积是50μl，5nmidh1/r132h、梯度稀释的抑制剂、12μmnadph和1mmα-kg的混合液在包含tris-hcl50mm(ph7.5)、100mmnacl,20mmmgcl2、bsa0.05％的反应缓冲液中，在25℃反应30分钟。后加入25μl上述反应缓冲液配置的终止混合液(硫辛酰胺脱氢酶36μg/ml，刃天青30μm)，使刃天青转化为试卤灵来测量剩余的nadph。25℃孵育10分钟后通过tecaninfinitefflex在ex544/em590下进行荧光值测定。每个化合物分别在10个浓度下测定酶的活性，反应中设置多个不加酶的背景孔和不含化合物的全酶活性孔。体系中dmso浓度≤2％。ic50的值使用xlfit5软件(idbssoftware)通过公式：y＝100/(1+10^((logic50-x)*hillslope))获得。本实施例的多孔板购自thermofisherscientific公司，nadph、α-kg、硫辛酰胺脱氢酶和刃天青购自生工生物工程有限公司，idh1/r132h通过大肠杆菌过表达后纯化得到。
根据本实施例所述的生物学方法对本发明所选的化合物进行分析，其结果如表2所示。其中，表2的“a”指对idh1/r132h的ic50≤10μm的抑制活性；“b”指对idh1/r132h的10μm<ic50≤50μm的抑制活性；“c”指对idh1/r132h的ic50>50μm的抑制活性。
表2优选化合物的idh1/r132h抑制活性
结果显示，化合物1-33具有一定的idh1/r132h抑制活性，其中，活性水平为a和b的化合物的抑制作用都较为明显。
实施例6化合物对野生型idh1(idh1/wt)选择性的测定
将化合物与idh1/wt和nadp进行孵育，然后通过添加异柠檬酸启动反应，线性条件下反应一段时间后加入硫辛酰胺脱氢酶和刃天青检测荧光物质的量。本实验将nadp还原成nadph，后者在硫辛酰胺脱氢酶的作用下将刃天青还原成高荧光的试卤灵，通过检测试卤灵的生成来量化特定反应时间之后生成的辅助因子nadph的量，从而来计算化合物对idh1/wt的抑制作用。
具体操作方式为：在96孔板中，反应总体积是50μl，15ng/mlidh1/wt、梯度稀释的抑制剂、50μmnadp和70μmdl-异柠檬酸的混合液在包含tris-hcl20mm(ph7.5)、150mmnacl、10mmmgcl2、2mmβ-巯基乙醇的反应缓冲液中，在25℃反应30分钟。后加入25μl上述反应缓冲液配置的混合液(硫辛酰胺脱氢酶36μg/ml，刃天青30μm)，使刃天青转化为试卤灵来测量生成的nadph。25℃孵育10分钟后通过tecaninfinitefflex在ex544/em590下进行荧光值测定。每个化合物分别在10个浓度下测定酶的活性，反应中设置多个不加酶的背景孔和不含化合物的全酶活性孔。体系中dmso浓度≤2％。ic50的值使用xlfit5软件(idbssoftware)通过公式：y＝100/(1+10^((logic50-x)*hillslope))获得。方法中多孔板购自thermofisherscientific公司，nadph、α-kg、硫辛酰胺脱氢酶和刃天青购自生工生物工程有限公司，idh1/wt通过大肠杆菌过表达后纯化得到。部分化合物的测试结果见表3。
表3部分化合物对idh1/wt的抑制活性
结果显示，本发明的化合物对野生型的idh1(idh1/wt)几乎没有活性，具有很好的选择性。
实施例7细胞水平对突变型idh1活性的抑制检测
2-羟基戊二酸脱氢酶(2hgdh)在2-hg存在的情况下，能够将nad+还原成nadh。后者可以通过心肌黄酶及其底物resazurin(刃天青)进行定量测定。
过表达idh1r132h突变的胶质瘤细胞u87mg，培养在1％丙酮酸钠的高糖mem，10％fbs中，置于co2培养箱(37℃，5％co2,95％空气)培养。
细胞通过胰酶消化并以1×104的密度接种于96孔板中，培养基为200μl，37℃培养箱培养过夜。第二天加入待测化合物，dmso终浓度均为0.1％，在培养24小时后，吸取100μl培养基，使用10kd
细胞外2-hg测定体系：
(1)50μl反应体系：反应缓冲液(50mmtrisph7.5，100mmnacl，20mmmgcl2，0.05％bsa)，其中nad+终浓度为40μm，2hgdh终浓度为20nm，待测样品加入5μl培养液；反应液混匀离心，避光25℃反应1小时；
(2)25μl显色体系：显色缓冲液(50mmtrisph7.5，100mmnacl，20mmmgcl2，0.05％bsa)，其中心肌黄酶的终浓度为36μg/ml，刃天青钠的终浓度为3μm；将上述25μl显色液加入(1)中的50μl反应体系中，混匀并离心，立即在ex544/em590下进行荧光值测定。
2-hg标准曲线制备：将2-hg储液使用反应缓冲液稀释至20μm，之后进行2倍梯度稀释，共计6个点。之后将上述2-hg按照细胞外2-hg测定体系测定，计算并绘制标准曲线。
细胞外2-hg含量计算：
细胞外2-hg测定体系中获得的荧光值使用2-hg标准曲线计算培养基中2-hg的含量，以dmso作为阴性对照，计算化合物对idh1r132h突变产生2-hg活性的抑制。
图1为本发明的部分化合物对u87mgidh1r132h细胞中2-hg水平抑制活性。其中，化合物处理浓度为20μm，时间为24h，dmso是阴性对照，ag-120是agios公司的idh1m抑制剂。
结果显示:所测试的化合物能在20μm的浓度下部分抑制u87mgidh1r132h细胞产生2-hg，显示了化合物在细胞水平对突变型idh1的活性抑制作用。