本发明属于生物医学材料领域，具体地说，涉及一种多功能诊疗剂及其制备方法。
背景技术：
目前，为了实现精确诊断和高效治疗疾病，所设计的诊疗剂往往需要同时具备多模成像和治疗等功能。临床上普遍采用手术、放疗、化疗这些传统的手段治疗癌症，不仅副作用多且疗效差，很难彻底根除恶性肿瘤。近红外光介导的肿瘤光热治疗作为一种优越的局部治疗方法近年来备受瞩目。光热治疗因其具有深入的组织穿透能力及组织安全性，结合光热转换剂可通过非侵入手段，实现对深层次肿瘤组织的有效杀伤。与传统疗法相比，光热治疗具有非侵袭性、高选择性、高治疗效率，对周围健康组织损伤小等优势。目前已报道了多种光热转换剂，包括无机纳米材料，例如金纳米球、银纳米颗粒、二维过度金属硫化物、石墨烯、碳纳米管等，由于其良好的光热转换效率，已经得到了广泛的研究。然而，大多数无机纳米材料光稳定性差、生物相容性不好，难降解和代谢，具有潜在毒性,这些大大限制了光热治疗的发展。
在众多新兴的光热转换剂中，聚多巴胺（pda）作为一种新型光热材料引起了人们的关注。聚多巴胺是天然生物色素－黑色素的主要成分，所以具有优良的生物相容性。以多巴胺为原料制备得到的聚多巴胺纳米粒具有良好的稳定性、生物可降解性，可以负载药物，可作为光热转换制剂用于癌症光热治疗（ptt），在疾病的早期诊断和靶向药物输送上显示出特有的优势。但聚多巴胺作为一种实心纳米粒子，对于疏水性药物的负载，其载药量及包封率并不高。作为pda材料中的一类新材料，介孔聚多巴胺（mesoporouspolydopamine,mpda）具有孔道结构、制备工艺简单、成本低廉、并且具有较高比表面积、高光热转换效率和优良生物相容性等优势而引起关注。2016年guan等首先通过界面非均质组装法设计合成了一种具有径向取向孔道的介孔聚多巴胺纳米粒子，通过控制体系中加入tmb的体积，可使mpda呈现多种形状，如碗装、球状等，以满足不同的应用需求。此外，基于mpda材料优良的光吸收特性，可作为光热转换剂应用于癌症光热治疗，构建多功能癌症诊疗平台。但目前尚无该材料在医学成像和诊疗剂中的应用报道。因此，我们需要更深层次地扩展介孔聚多巴胺的应用。
利用气体信号分子（如co、no等）取代传统的化疗药物的气体治疗，由于具有选择性杀死癌细胞、并保护正常细胞的抗癌特性，被认为是一种新兴的“绿色”的肿瘤治疗手段，具有广阔的应用前景。一氧化碳（co）是正常机体的内源代谢物之一，也是生理环境中不可或缺的一类信号分子。研究发现，低剂量的co对很多疾病如炎症、癌症和心血管疾病等具有显著的治疗作用。而之前已有报道证明co的直接使用能对癌细胞产生细胞促凋亡作用，同时减少化疗药物对正常细胞的毒性。当前研究主要集中在如何将co释放分子（corm）安全递送至所需的作用位点，其co的释放多是自发的或是由紫外/可见光激发的。自发型难以实现co释放的有效控制，co释放量少，体内难以实现预期的疗效。另外，紫外/可见光激发型也存在皮肤的光毒性大，穿透深度有限的缺陷，所以只能用于治疗浅表病变，对深部肿瘤的效果差，限制了co气体治疗肿瘤的发展。
在诊疗剂设计和构建中，可视化诊断部分尤为关键。研究人员需要通过合适的成像技术来了解肿瘤的位置、大小及治疗剂的体内分布与其在肿瘤部位的富集情况。核磁共振成像（mri）是一种比较理想的能够为肿瘤治疗提供诊断辅助和实时监测的成像模式，具有较高的空间分辨率，没有组织穿透深度的限制，已成为当代临床诊断中最有力的诊断手段之一。目前临床上常用的钆（gd）造影剂，注射后，钆会在大脑和其他组织中有一定存留，可能引起潜在的风险。近些年，研究者们将磁共振造影剂的研究重点转移到了过渡态金属锰上，它是一种顺磁性金属，有5个未成对电子，具有较强的弛豫增强效果。此前，有文献利用聚多巴胺优异的金属离子鳌合能力，在已合成的聚多巴胺纳米颗粒表面吸附锰离子，进行mri成像引导下的光热治疗，取得了良好的效果。然而，由于锰离子是通过鳌合作用吸附在纳米颗粒表面，有脱落的风险，此外锰离子本身也具有较大毒性，不利于临床的应用。
综上所述，为了提高气体治疗和光热治疗的精准性，需要在治疗前确认肿瘤在体内的大小和位置，并且对治疗的过程进行实时的监测。目前国内外报道的纳米诊疗剂通常涉及多种化学试剂和药品参与，制备工艺复杂、成本高、效率低、重复性不好，难以实现临床应用。本发明中将mn2(co)10（简写mnco）高效负载在mpda的孔道中，构建一种肿瘤微环境（h+和h2o2）响应的纳米诊疗剂，磁共振成像（mri）和光声成像（pai）引导下实现co高效输运和光热治疗协同治疗，有望大幅度提高癌症的诊断和治疗效果，减轻全身化疗的毒副作用。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有诊疗制剂的不足，提供一种高效多功能纳米诊疗剂,可用于mri/pai双模式成像引导的肿瘤光热治疗和co气体治疗。具体地本发明构建的mnco@mpda诊疗剂具有如下功能和应用：第一、利用mnco与肿瘤内源刺激h2o2发生类芬顿（fenton）反应，原位产生治疗性co气体杀死癌细胞；第二、mnco在肿瘤酸性环境和h2o2共同作用下生成mn2+（高效的mri对比剂），可用于肿瘤部位的磁共振成像，在mri成像的同时还解决了锰离子在体内循环中毒性大这一难题，从而实现治疗过程的监控和评估；第三、利用mpda吸收脉冲光能量，将光能转化为热能，进而产生超声信号，实现更深层的活体内组织光声成像；第四、利用mpda将吸收的近红外光产生热效应进行光热治疗，进一步提高了治疗效果与安全性。
为了实现上述目的，本发明提供上述多功能纳米诊疗剂的制备方法：
一种介孔聚多巴胺负载羰基锰的多功能纳米诊疗剂，由水溶性的介孔聚多巴胺（mpda）载体包裹疏水性的羰基锰（mnco）药物而成，所述的mnco与mpda的质量比为1~8：1。
上述介孔聚多巴胺负载羰基锰的多功能纳米诊疗剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将mpda溶于2-3ml有机溶剂中，mpda虽为水溶性材料，也可溶于部分有机溶剂中。
（2）向上述体系中加入羰基锰，混合均匀后将该体系静置于真空干燥箱，挥发掉一部分有机溶剂，离心去除剩余有机溶剂；
（3）将步骤（3）中所得沉淀用水溶液或者有机溶剂洗2-4遍，可重悬于溶液中，获得负载羰基锰的纳米诊疗剂粒子。
在上述制备方法（1）中，所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲醇、乙醇中的一种或多种混合。
在上述制备方法（2）中，真空干燥条件为室温，去除有机溶剂目的为浓缩药物浓度，利于药物进入mpda孔洞，提高载药量。剩余有机溶剂体积为原溶剂体积的1/5-1/4为宜，利于产物收集的同时，保证载药反应充分进行。
在上述制备方法（2）中，所述离心的参数为8000-13000rpm，6-10min。
在上述制备方法（3）中，所述的水溶液可以是水、pbs溶液（ph5.0-7.4）、培养基等，所述的有机溶剂种类和（1）中有机溶剂相同。
在上述的制备方法中，所述的介孔聚多巴胺（mpda）载体的直径在50~400nm之间，介孔尺寸为1~50nm。
上述介孔聚多巴胺负载羰基锰的合成工艺简单易行、效率高且重复性好，可以进行大规模生产。
本发明还提供上述多功能纳米诊疗剂用于磁共振成像造影剂、光声成像造影剂和/或治疗肿瘤气体药物、治疗肿瘤光热消融制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）mnco为亲脂性很强的物质，无法直接注射。载体介孔聚多巴胺（mpda）具有较高的比表面积和纳米孔道结构，包裹亲水性或者疏水性药物具有载药量高的优点。mpda由于它自身具有很强的吸附能力和丰富的纳米孔道，还能产生π-π*电子跃迁，并与分子形成氢键，可以大幅度提高mnco的负载效率，从而使co气体释放量提高，进而杀死癌细胞。
（2）锰离子通过响应肿瘤微环境的过氧化氢选择性产生于肿瘤部位，在mri成像的同时还解决了锰离子在体内循环毒性大这一难题。
（3）载体介孔聚多巴胺（mpda）还具有很好的光热转换效率及光稳定性，使其可作为一种光热治疗剂用于肿瘤的治疗。
（4）该诊疗剂实现了磁共振成像和光声成像引导下的co气体和光热协同治疗，有望提高肿瘤治疗效果且生物相容性良好，具有临床应用潜力。
附图说明
图1为实施例1合成的mnco@mpda及其应用的示意图；
图2为实施例1的(a),(b)mpda氮气吸附/脱附曲线;(c)为mnco@mpda的透射电镜图;(d)为动态光散射粒径分布图；
图3为纳米诊疗剂mnco@mpda水溶液在(a)不同浓度和(b)不同激光功率下的光热升温图；
图4为纳米诊疗剂mnco@mpda在不同时间点co释放量变化的紫外可见吸光图；
图5为不同浓度mnco@mpda水分散液体外(a)mri图及(b)弛豫率计算图。
图6为游离mnco和四种细胞孵育(a)24h，(b)48h后细胞活性，以及mnco@mpda和四种细胞孵育(c)24h，(d)48h后细胞活性。
图7为mnco@mpdapbs分散液以尾静脉注射方式注入荷瘤小鼠后，(a)为hct116肿瘤区域不同时间点的t1-mri图。(b)和(c)为肿瘤区域的磁共振信号强度变化；
图8为mnco@mpdapbs分散液以尾静脉注射方式注入荷瘤小鼠后，(a)为hct116肿瘤区域不同时间点的光声成像图。(b)为肿瘤区域的光声信号强度变化；
图9为纳米诊疗剂mnco@mpda，mpda及对照组pbs经静脉注射入荷瘤鼠9h后，(a)为小鼠肿瘤部位的热成像图;(b)为肿瘤区域的温度变化图；
图10为纳米诊疗剂mnco@mpda，mpda，游离mnco及对照组pbs经尾静脉注射入荷瘤鼠后的治疗情况，(a)为不同分组小鼠在治疗前后不同时间的肿瘤体积变化图；(b)为不同分组小鼠在治疗前后不同时间的小鼠体重变化图;(c)为不同分组小鼠在治疗后第6，10及14天的图片（激光功率为1w/cm2）。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1纳米诊疗剂mnco@mpda的合成
具体步骤如下：
（1）载体介孔聚多巴胺mpda的合成参照现有技术制备得到，粒径为210nm。
（2）mnco@mpda的合成：称取1.5mgmnco溶于1ml甲醇，300μgmpda溶于1ml甲醇，将两者混合均匀，静置于真空干燥箱中，至溶剂体积挥发为500-600μl时取出离心13000rpm，10min，所得沉淀即为mnco@mpda，可重悬于水或者pbs（ph为7.4）溶液中。
实施例2纳米诊疗剂mnco@mpda的合成
具体步骤如下：
（1）载体介孔聚多巴胺mpda的合成参照现有技术制备得到，粒径为210nm。
（2）mnco@mpda的合成：称取1.5mgmnco溶于1ml甲醇，1.5mgmpda溶于1ml甲醇，将两者混合，静置于真空干燥箱中，至溶剂体积挥发为500-600μl时取出离心13000rpm，10min，所得沉淀即为mnco@mpda，可重悬于水或者pbs（ph为7.4）溶液中。
实施例3纳米诊疗剂mnco@mpda的表征
具体步骤如下：
（1）mpda氮气吸附/脱附曲线测定：取烘干的100mgmpda样品，仪器测定氮气吸附/脱附曲线，如图2(a)，(b)所示，利用bjh法计算出实施例1制备的mpda纳米粒子的比表面积为21.8603m²/g，孔径大小约为10nm。
（2）透射电镜（tem）观察mnco@mpda形貌：取10μlmnco@mpda分散液，滴加在表面碳涂层铜网上，室温条件下自然风干。200kv电压条件下，透射电子显微镜观察纳米颗粒的形貌和粒径。如图2(c)所示，实施例1制备的纳米粒mnco@mpda的透射电镜结果，可以看出纳米粒子呈球形且粒径均一，有规则分布的孔道结构。
（3）马尔文纳米粒度仪测量mnco@mpda粒径：取1mlmnco@mpda分散液加入样品池中，测量其粒径为250.6±5.5nm，并得到如图2(d)的动态光散射粒径分布图。由图中可见，制得的mnco@mpda粒径分布范围较窄，表明粒径比较均一。
实施例4纳米诊疗剂体外光热性质研究具体步骤如下：
（1）配制不同mpda浓度的mnco@mpda分散液，将溶液移至样品池中，采用功率为2w/cm2的808nm激光器对溶液进行照射10分钟，同时用电子温度计记录材料进行激光照射时的温度变化情况。绘制成温度-时间曲线，分析溶液温度变化与溶液浓度的关系。
（2）配制mpda浓度为100μg/ml的mnco@mpda分散液，将溶液移至样品池中，分别采用不同功率的808nm激光器对分散液进行照射10分钟，用电子温度计记录激光照射时分散液的温度变化情况。绘制成温度-时间曲线，分析溶液温度变化与激光功率的关系。如图3(a)，(b)所示，在808nm激光照射下，mnco@mpda分散液温度升高呈浓度和激光功率依赖性。
实施例5纳米诊疗剂一氧化碳释放表征
具体步骤如下：将mnco@mpda重悬于pbs（ph为7.4）中，浓度为300μg/ml。取200μl该分散液加入到配置好的血红蛋白pbs溶液中，后加入一定量过氧化氢溶液，使得分散液总体积为4ml（血红蛋白浓度为4μmol，过氧化氢浓度为100μmol）。将该分散液置于紫外-可见分光光度计样品池中，每隔5min测定吸光度值，测定范围350-600nm。绘制吸光图谱如图4所示，随着时间的延长，产生的一氧化碳气体与血红蛋白结合，导致430nm处血红蛋白吸光度值逐渐减弱，而碳氧血红蛋白（一氧化碳气体与血红蛋白结合产物）在410nm处的吸光度值逐渐增强，表明一氧化碳的生成。
实施例6纳米诊疗剂磁共振成像性能表征
具体步骤如下：将mnco@mpda水分散液进行梯度稀释，在核磁共振成像仪下进行扫描，检测其mri成像效果。如图5(a)，(b)所示，随着mn2+浓度升高，mnco@mpda的mri造影信号不断增强，亮度逐渐提高，以mn2+离子物质的量浓度为横坐标，以纵向弛豫率r1（1/t1）为纵坐标进行线性拟合，得到mnco@mpda的纵向弛豫率为33.55mm-1s-1，是商用钆喷酸葡胺的纵向弛豫率（5.35mm-1s-1）的6.27倍。与商用造影剂相比，mnco@mpda诊疗剂可使mri造影信号显著增强。
实施例7纳米诊疗剂细胞毒性评价
具体步骤如下：将四种不同的细胞（人脐静脉内皮细胞huvec，人肝癌细胞hepg2，人结肠癌细胞hct116，小鼠结肠癌细胞ct-26）以4000个/孔的数量分别接种在4块96孔细胞培养板中。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度梯度的游离mnco和mnco@mpdapbs分散液，与细胞共孵育24小时和48小时，mtt实验检测纳米诊疗剂对细胞活性的影响。实验结果表明游离mnco的细胞毒性很低，几乎无杀伤细胞的作用（图6(a)，(b)）。四种细胞中hct116（人结肠癌细胞）细胞活性明显降低（图6(c)，(d)），表明mnco@mpda能有效杀伤hct116这种肿瘤细胞，原因是hct116细胞中h2o2水平相较其它细胞高一些，有利于co气体的产生，进而产生细胞毒性，具有治疗结肠癌的潜力。
实施例8纳米诊疗剂小鼠体内磁共振成像
具体步骤如下：采用尾静脉注射法，将125μlmnco@mpda(6mg/ml)尾静脉注入荷瘤鼠,分别在注射前、注射后不同时间点对小鼠进行磁共振成像，比较不同时间点mri信号变化情况。如图7(a)，(b)，(c)所示，将mnco@mpda注入荷瘤鼠后，肿瘤部位磁共振信号逐渐增强，并在9小时左右达到峰值，表明纳米粒子这时在肿瘤部位富集量最多，可于9小时进行光热治疗。
实施例9纳米诊疗剂小鼠体内光声成像具体步骤如下：通过尾静脉向小鼠体内注射125μlmnco@mpda(6mg/ml)，分别在注射前后不同时间点对小鼠进行光声成像扫描。结果如图8(a)，(b)所示，注射样品后，小鼠肿瘤部位光声信号逐渐增强，9h后，肿瘤部位光声信号达到最强；24h后，肿瘤显影强度降低，但仍维持在较高强度水平。表明mnco@mpda具有较高的稳定性及较长的体内循环时间，能通过epr效应有效富集在肿瘤部位，利于肿瘤部位及其边界的识别，为其后的光热治疗提供最佳治疗时间和病灶信息。
实施例10纳米诊疗剂在小鼠肿瘤部位的热成像实验
具体实验步骤如下：将pbs,mpda和mnco@mpda经尾静脉注入荷瘤鼠，在注射9小时后，以不同的激光功率（1w/cm2和0.5w/cm2）照射肿瘤部位5分钟，采用红外温度监测仪动态记录肿瘤部位温度变化。如图9(a)，(b)所示，在注射9小时后进行激光照射，肿瘤部位温度可升高至60℃，表明诊疗剂在肿瘤部位富集，具有很好的光热转换效果。
实施例11纳米诊疗剂mnco@mpda的肿瘤治疗情况及疗效监测
具体步骤如下：将125μl(6mg/ml)mnco@mpda经尾静脉注入荷瘤鼠，在注射9小时后进行光热治疗。分组为未处理组、仅气体，仅激光治疗组和气体、激光协同治疗组。需进行激光治疗的组以不同的激光功率（1w/cm2和0.5w/cm2）照射肿瘤部位5分钟，其后每隔一天称量一次小鼠体重，并用游标卡尺测量肿瘤体积和对小鼠进行拍照。动态监测不同分组小鼠在治疗前后不同时间点的肿瘤体积和小鼠体重。如图10(a)，(b)，(c)所示，与对照组相比，气体治疗组小鼠肿瘤体积有缩小，但而接受激光辐照组的荷瘤鼠肿瘤明显缩小。各组小鼠体重变化无明显差异。