水飞蓟宾在制备防治结肠炎相关肠癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及含有机有效成分的医药配置品领域，具体是一种水飞蓟宾在制备防治结肠炎相关肠癌药物中的应用。

背景技术：

水飞蓟素是从奶蓟果实中提取出来的一类黄酮成分, 主要包含水飞蓟宾 ( Silybin，SB) 、异水飞蓟宾(Isosilybin) 、水飞蓟亭(SilyChristin) 和水飞蓟宁( Silydianin) , 其中水飞蓟宾为水飞蓟素的主要成分 (占60%- 70%) 和重要的有效成分, 水飞蓟用来治疗肝胆疾病已有2000多年的历史，水飞蓟素作为其主要的活性成分可以防止化学毒素、食物毒素和药物等对肝脏造成的损伤，促进肝细胞的再生和修复，被称为“天然的保肝药”；作为强抗氧化剂，能够清除人体内的自由基，延缓衰老。近年来，由于水飞蓟宾显示出保肝和抗氧化以外的活性而备受关注，其中水飞蓟宾表现出的抗癌和肿瘤预防作用已经显示出很好的开发潜力。它被广泛应用于医药、保健品、食品和化妆品等产品中。在肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等领域已有研究，但在结肠炎相关肠癌领域尚无人研究。

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一组病因尚不十分清楚的慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn’s disease, CD），结肠炎相关肠癌（colitis-associated cancer, CAC）即 IBD 患者发生的大肠癌。IBD 患者发生 CRC的风险比普通人群高，发病年龄比散发性肠癌患者小，且风险随着年龄的增长而增加。目前尚缺乏疗效十分理想和安全的CAC防治方法。1994 年，Sweden 等第一次提出柳氮磺胺吡啶可能降低 CAC风险，国内外逐渐开始尝试使用一些具有潜在防治作用的药物来降低 IBD 患者的癌变风险，如 5-氨基水杨酸（5-aminosalicylicacid, 5-ASA）制剂、非甾体类抗炎药（Non-Steroid Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs）、糖皮质激素、免疫抑制剂、益生菌、某些饮食成分以及植物中药提取物等。但均存在有效率低、息肉容易复发、副作用严重和药物经济学等问题；手术存在病人生活质量严重低下等问题。因此，迫切需要寻找能直接抑制炎癌转化、疗效明确且副作用少的药物，对CAC的临床防治、提高患者的生存质量和减少并发症具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明就是为了解决现有技术中CAC防治方法的疗效不是十分理想和安全的问题，所提供了一种水飞蓟宾在制备防治结肠炎相关肠癌药物中的应用。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种水飞蓟宾在制备防治结肠炎相关肠癌药物中的用途。

进一步的，所述水飞蓟宾减轻AOM/DSS诱导小鼠结肠炎症及结肠肿瘤的发生。

进一步的，所述水飞蓟宾减少小鼠结肠炎症因子的表达，在结肠癌细胞系中减少炎症因子的表达。

进一步的，所述水飞蓟宾减轻结肠黏膜屏障功能的破坏。

进一步的，所述水飞蓟宾减少小鼠结肠上皮细胞的增殖，抑制结肠癌细胞系的增殖。

进一步的，所述水飞蓟宾通过下调IL-6/STAT3抑制结肠炎相关肠癌的发生发展。

本发明获得了如下有益效果。

本发明通过细胞实验及动物实验发现水飞蓟宾对人结肠癌细胞HCT116和小鼠Apc基因突变的肠上皮细胞IMCE细胞的生长有显著抑制作用；同时水飞蓟宾组小鼠结肠炎症评分降低，肿瘤数目及大小均有减少，且未发现不良反应。其机制包括：抑制细胞增殖、促进凋亡、下调IL-6、IL-1β表达等促炎因子的表达，还可抑制STAT3磷酸化，从而阻断肿瘤启动，发挥抗癌作用。本发明对结肠炎相关肠癌的临床防治、提高患者的生存质量和减少炎症复发具有十分重要的意义，为结肠炎相关肠癌的防治提供了一种安全、有效和经济的新方法。

附图说明

图1是本发明实施例1中实验组和对照组结肠长度对比图；

图2是本发明实施例1中实验组和对照组小鼠肿瘤数目及大小对比图；

图3是本发明不同浓度水飞蓟宾对HCT116细胞生长抑制影响对比图；

图4是本发明不同浓度水飞蓟宾对IMCE细胞生长抑制影响对比图；

图5是本发明实施例3中实验组和对照组结肠组织标本石蜡切片HE染色图；

图6是本发明实施例4中实验组和对照组免疫组化结果对比图；

图7是本发明实施例5中实验组和对照组小鼠结肠上皮细胞炎症因子表达量对比图；

图8是本发明实施例6中实验组和对照组免疫荧光实验结果对比图；

图9是本发明实施例7中实验组和对照组Western blot实验结果对比图。

具体实施方式

以下参照附图及实施例对本发明进行进一步的技术说明。

实施例1

氧化偶氮甲烷 (azoxymethane, AOM)/ 葡聚糖硫酸钠 (dextran sodium sulfate, DSS) 小鼠模型是一种在致癌剂 AOM 和致炎剂 DSS 协同作用基础上，由炎症性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD) 逐步发展为肠癌的炎症相关性癌症的研究模型。

动物饲养方法如下：

AOM溶于生理盐水：于实验第一周，根据每只小鼠的体重10mg/kg腹膜内注射；

DSS溶于饮用水至浓度2％：10g DSS+500ml过滤过的高压灭菌水；

SB溶解于0.5％羟甲基纤维素（CMC）：750mg/kg灌胃。

C57 6w Female小鼠（购自于北京动物研究中心）

2％DSS×5天，共给3个循环

SB每周5天×10周

每周记录体重及饮食，饮水情况

取出所有肠管，用生理盐水冲洗后，滤纸吸干，测量结肠长度称取重量，观察并记录结肠肿瘤的形成情况。

实验结果显示：AOM/DSS组小鼠结肠长度较正常对照组及水飞蓟宾干预组（AOM/DSS/SB）明显缩短，水飞蓟宾干预组肿瘤数有所减少，具有统计学意义（P<0.05）,水飞蓟宾干预组炎症评分及肿瘤评分也明显降低，且具有统计学意义(*p < 0.05, ***p < 0.001, AOM/DSS vs AOM/DSS/SB) 。（参见图1、2）

实施例2

MTT增殖实验：

将生长状态良好的细胞(HCT116细胞系、IMCE细胞系)[HCT116细胞系购自中国科学院细胞库（上海）, 鼠结肠肿瘤前细胞系（Immorto-Min colonic epithelial cell line,IMCE）从美国Vanderbilt 大学引入]，接种于96孔板（5×10³个/孔）24h， 给予不同浓度水飞蓟宾 （50-800μ/M）刺激继续培养72小时，每孔加10 µL 5 mg/mL MTT [3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide] 4 h，吸弃培养液，每孔加 150μl DMSO溶液，振荡10min,使结晶充分溶解，于酶标仪570nm波长测定OD值。实验结果显示：水飞蓟宾能够很好抑制IMCE细胞及HCT116细胞。（参见图3、4）

实施例3

石蜡切片的制备及组织学损伤的评价

各组结肠组织标本经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及烤片后制作成石蜡切片。将切片脱蜡及水化后，依次进行苏木紫染色、盐酸酒精分色、淡氨水反蓝和伊红染色，再经过脱水、透明及封片后即可在显微镜下观察并进行组织学评分（炎症及肿瘤评分），结果显示：水飞蓟宾干预组炎症评分及肿瘤评分明显降低，且具有统计学意义(*p < 0.05, ***p < 0.001, AOM/DSS vs AOM/DSS/SB)。（参见图5）

实施例4

免疫组化染色

采用 SABC 法，其实验步骤包括：（1）脱蜡；（2）封闭；（3）抗原修复；（4）血清封闭；（5）滴加一抗；（6）滴加二抗；（7）滴加 SABC；（8）显色；（9）复染；（10）盐酸酒精分化；（11）脱水与透明；（12）封片：中性树胶封片，置于通风柜中晾干后显微镜拍照，并计数阳性细胞后续统计分析。主要抗体及来源：Ki-67，IL-6，STAT3，p-STAT3（Abcam, Cambridge, MA, USA)。免疫组化结果显示：水飞蓟宾干预组（AOM/DSS/SB）结肠组织IL-6及p-STAT3的阳性细胞数明显少于AOM/DSS组，而STAT3的表达差异不大，并抑制了核增殖蛋白Ki-67的表达。（参见图6）

实施例5

Realtime PCR

各组取相同部位的结肠组织标本提取RNA，使用TIANScript RT Kit试剂盒(TIANGEN, Inc.，中国北京)进行逆转录合成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测IL-6，IL-1β mRNA表达水平。主要仪器：DNA Thermal Cycle 480扩增仪（美国Perkin Elmer Cetus公司）、Realtime PCR仪（美国ABI公司）。实验结果显示：在结肠癌旁组织中IL-6 mRNA，IL-1β mRNA的表达量明显受到水飞蓟宾的抑制。说明水飞蓟宾可以减少结肠癌细胞及小鼠结肠粘膜炎症因子的表达。（参见图7）

实施例6

免疫荧光实验

步骤：（1）脱蜡与水化；（2）3% H2O2室温孵育10 min，蒸馏水浸洗2 min ×3次；（3）抗原修复；（4）封闭：5%BSA封闭20 min；（5）一抗（ZO-1） 4℃孵育过夜；（6）吸去一抗，复温 30min后用PBS缓冲液洗涤 5 min ×3次；（7）切片与相应的荧光二抗 37℃孵育 1 小时；（8）吸去二抗，并用 PBS 缓冲液洗涤 5 min ×3次；（9）用含抗荧光淬灭液的封片液封片，室温放置 5 min 待片子稍干燥后在荧光显微镜下观察。实验结果显示：AOM/DSS/SB组阳性细胞较AOM/DSS组增加，且具有统计学意义（P＜0.001），证明水飞蓟宾可以减轻肠道机械屏障功能的破坏。（参见图8，图中箭头指向阳性细胞）

实施例7

Western blot

各组取相同部位的结肠组织标本提取蛋白，测定浓度后依次进行变性、电泳、湿法转膜，用脱脂牛奶封闭，随后滴加一抗4℃过夜，二抗室温孵育1小时，通过化学发光、显影及定影获得蛋白条带，利用Image J软件对蛋白条带的灰度进行分析。实验结果显示：水飞蓟宾可以明显抑制STAT3磷酸化，从而推断水飞蓟宾可能通过阻断IL-6/STAT3通路发挥抑制炎症向癌的转化。（参见图9）