RamosissimoneA在制备治疗类风湿关节炎药物的应用的制作方法

本发明涉及一种化合物Ramosissimone A在制备治疗类风湿关节炎药物的应用。

背景技术：

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节病变为主的慢性全身性的自身免疫性疾病，目前其发病机制尚不明了，临床认为RA的发病主要是由于患者自身免疫功能失调，导致过敏反应，使抗炎细胞变质变性，沉积于关节部位并使关节组织畸形、致残。据调查，世界范围内RA的发病率大约为1-2％，我国RA患者总数已超过400万，且发病率仍呈上升趋势。

目前，对于类风湿关节炎主要采用非甾体抗炎药(双氯灭痛、阿司匹林等)和免疫抑制剂(6-巯基嘌呤等)进行治疗，但这些药物均存在明显的不良反应，如前者损伤胃肠道粘膜导致消化性溃疡，后者作用选择性差，易于诱发感染等。因此，研究开发安全、有效的治疗类风湿关节炎药物是当前的一项紧迫任务。

近年来，国内外学者在植物药治疗RA方面进行了广泛而深入的研究，发现许多天然药物如雷公藤多苷、白芍总苷、毒藤碱等具有较好的RA治疗作用。因此，从植物药中开发出安全高效的RA治疗药物具有广阔的前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种化合物Ramosissimone A在制备治疗类风湿关节炎药物的应用。

Ramosissimone A在制备预防或治疗类风湿关节炎药物中的应用，其中化合物Ramosissimone A的结构式如下：

Ramosissimone A在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖药物中的应用，其中化合物Ramosissimone A的结构式如下：

本发明首次通过药理实验证明ramosissimone A具有显著的抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖和诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡的活性，可用于制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物，因此其具有较高的临床应用价值和开发前景。

本发明公开了一种化合物ramosissimone A在制备抗类风湿性关节炎药物中的用途。Ramosissimone A的结构式如式I所示，它是从多枝柽柳枝条中分离得到的。本发明首次发现ramosissimone A能够明显抑制类风湿关节炎滑膜细胞的增殖，诱导类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡。因此，该化合物可用于制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物，具有较高的临床应用价值和开发前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中不同浓度的ramosissimone A对类风湿关节炎滑膜细胞增殖抑制作用的统计结果图。

图2是本发明实施例2中不同浓度的ramosissimone A对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡促进作用的统计结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种化合物ramosissimone A在抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖以及预防和/或治疗类风湿关节炎中的应用。

本发明所涉及的化合物ramosissimone A结构式如式I所示：

上述化合物是从多枝柽柳(Tamarix ramosissima Ledeb.)中分离得到的(姜成帅.红柳抗类风湿关节炎化学成分研究[D].宁夏医科大学,2016)。多枝柽柳是优良的防风固沙植物和盐碱地造林的优良树种，在我国西北地区分布广泛，资源丰富。

本发明所提供的ramosissimone A的应用包括两方面：1)为其在制备预防和/或治疗类风湿关节炎的产品中的应用；2)为其在制备抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖的产品中的应用。

具体表现在ramosissimone A能够明显抑制类风湿关节炎滑膜细胞的增殖，诱导类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡，可用于制备预防和/或治疗类风湿关节炎的药物。

此外，以ramosissimone A为有效成分制备的下述产品：1)预防和/或治疗类风湿关节炎的产品；2)抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖的产品，也属于本发明的保护范围。

本发明中预防和/或治疗类风湿关节炎的药物以及抑制类风湿关节炎滑膜细胞增殖的药物均可通过注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。以上各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

Ramosissimone A对类风湿关节炎滑膜细胞增殖的抑制作用。

细胞：人类风湿关节炎滑膜细胞(RA-FLS)；

药物：ramosissimone A；

方法：1.RA-FLS的复苏

从液氮灌中迅速取出RA-FLS冻存管，放进温度为37℃的恒温水浴锅，不间断的摇晃，加快细胞解冻。待解冻完全后，在超净台内将冻存管内的RA-FLS悬浮液用移液器移至10mL无菌离心管中，离心5min，转速1000r/min。倒掉上清液，加入5mL完全培养液，用移液器持续吹打至均匀的细胞悬液，将RA-FLS接种于25mL细胞培养瓶中，放入细胞培养箱中培养，培养箱条件设置为温度37℃，CO2浓度5％。24h后在显微镜下观察RA-FLS的生长情况，当发现细胞贴壁、呈三角形及不规则梭形时，表明细胞生长情况良好。

2.RA-FLS的传代

在显微镜下观察，当RA-FLS贴壁生长到占整个细胞培养瓶底部的80％左右时，即可进行细胞传代。倒掉培养瓶中的原培养液，用PBS冲洗2次，目的是将原培养液洗净，避免影响细胞消化；加入0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，并于显微镜下观察RA-FLS消化情况，待镜下看见大部分细胞变圆时加入适量的胎牛血清(FBS)终止消化，随后加入一定量的完全培养液于培养瓶中，用无菌吸管反复吹打培养瓶内壁，呈均匀的细胞悬液；用细胞计数板对细胞进行计数，计数完毕后，将RA-FLS接种于2个新的培养瓶内，并加入适量的完全培养液，放入细胞培养箱中培养，培养箱条件设置为温度37℃，CO2浓度5％，即一传二的方式传代培养。

3.MTT法测定细胞抑制率

取适量的ramosissimone A用DMEM分别配成0.01、0.1、1、5、10μM的培养液。取处于对数生长期的RA-FLS，倒掉培养瓶中的原培养液，用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶消化液进行消化，并于显微镜下观察RA-FLS消化情况，待镜下看见细胞大部分变圆时加入适量的FBS终止消化，随后加入一定量的培养液于培养瓶中，用无菌吸管不停地吹打培养瓶内壁，呈均匀的细胞悬液，用细胞计数板进行计数，用培养液调节细胞浓度为1×10⁵个/mL，将RA-FLS接种于96孔无菌细胞培养板中，每孔100μL，放入细胞培养箱中培养，培养箱条件设置为温度37℃，CO2浓度5％。孵育24h后，将96孔板分为6组(即空白对照组、0.01、0.1、1、5、10μM药物组，每组6个复孔)，吸掉孔中的原培养液，分别加入等量的DMEM和不同浓度的含药培养基，放入细胞培养箱中干预。干预24h及48h后，每个孔中加入20μLMTS，37℃孵育1.5h，用酶联免疫检测仪测定各孔在540nm波长处的吸光度，计算各组细胞的抑制率。

计算公式如下：

细胞抑制率/％＝(1-空白对照组OD值/各浓度药物组OD值)×100％

结果：浓度为0.1～10μM的ramosissimone A能够明显抑制RA-FLS的增殖，且抑制作用随药物浓度的增大而增强。

实施例2：

Ramosissimone A对类风湿关节炎滑膜细胞凋亡的促进作用。

细胞：人类风湿关节炎滑膜细胞(RA-FLS)；

药物：ramosissimone A；

方法：1.RA-FLS的复苏

与实施例1相同。

2.RA-FLS的传代

与实施例1相同。

3.TUNEL法测定细胞凋亡

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30％的染色体DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。

取适量的ramosissimone A用DMEM分别配成0.1和1μM的培养液，RA-FLS细胞在空白及含药培养液中孵育48h，室温下使用4％多聚甲醛固定30min。用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3遍，加入细胞膜通透液(0.1％柠檬酸钠，0.1％Triton X-100)作用2min。37℃下使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)和生物素-11-脱氧尿苷三磷酸(biotin-11-dUTP)进行标记反应1h。使用荧光显微镜观察细胞形态并计算凋亡指数。

计算公式如下：

凋亡指数/％＝(1000个细胞中凋亡细胞数/1000)×100％。

本发明的RamosissimoneA在制备治疗类风湿关节炎药物的应用中Ramosissimone A的剂量为0.2～1.0mg/kg/day，用法为口服。