支链alpha酮酸作为抗氧化剂的应用的制作方法

本发明属于天然抗氧化剂的功能与应用领域，具体涉及支链氨基酸的代谢中产物支链alpha酮酸作为抗氧化剂的应用，支链alpha酮酸为α-酮-β-甲基戊酸，α-酮异己酸，和α-酮异戊酸中的一种。

背景技术：

人体内存在着很多活性氧自由基。人体内产生的活性氧自由基会使细胞受到氧化损伤，导致人体衰老、心脑血管疾病和肿瘤等多种疾病。正常情况下，机体内存在活性氧和自由基的清除系统，使活性氧和自由基在一个极低的水平上保持平衡。近来的研究证实，氧化应激参与了细胞损伤的多个环节，当体内活性氧自由基产生过多或活性氧自由基消除缓慢时，体内大量积累的活性氧自由基便会开始攻击一些生物大分子、细胞及组织，导致脂质的过氧化，线粒体膜的损伤，线粒体凋亡因子释放到细胞质中，最后导致细胞损伤和凋亡，促进人体衰老和引发各种疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病、神经紊乱等。过氧化氢(H2O2)经常作为外源性刺激制造氧化应激损伤模型，以此来考察氧化应激损伤发生时细胞发生的一系列应激改变。本研究将采用过氧化氢构建细胞损伤模型。

抗氧化剂是一类能够在相对较低浓度时便可有效显著延缓或抑制易氧化物质发生氧化作用的物质。在细胞水平上，抗氧化剂可以清除细胞内多余的自由基，防止自由基直接对细胞造成损害。天然抗氧化剂是指能够延缓或抑制氧化作用的天然物质。及时补充外源性天然抗氧化剂能有效缓解体内的氧化应激状态，起到维护和促进身体健康的作用。

氨基酸是生物大分子蛋白质的基本构成单位，支链氨基酸(branched-chain amino acid,BCAA)是人体必需氨基酸，包括异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸。BCAA主要有3大来源：食物、重新合成和脂肪组织。在人体代谢中，蛋白质和神经递质的合成都需要BCAA。支链alpha酮酸(branched-chain alpha ketoacid,BCKA)是BCAA在支链氨基酸转氨酶(branched-chain amino acid transaminase,BCAT)的作用下alpha位碳原子脱氨基形成的。BCKA是人体产生的一种天然代谢中间产物，分别是由异亮氨酸代谢产生的α-酮-β-甲基戊酸(α-keto-β-methylvalerate，KIM)，亮氨酸代谢产生的α-酮异己酸(α-ketoisocaproate，KIC)，缬氨酸代谢产生的α-酮异戊酸(α-ketoisovalerate，KIV)。随后，BCKA在线粒体支链alpha酮酸脱氢酶(branched-chain alpha ketoacid dehydrogenase,BCKD)复合物的催化下，不可逆的氧化脱羧进入三羧酸循环。截止目前，BCKA在体外清除羟基自由基(HO·)的能力，以及在细胞水平上保护细胞，缓解细胞损伤，延缓细胞衰老的能力还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供支链alpha酮酸作为抗氧化剂的应用，可为保健品、药物、食品添加剂和化妆品行业提供一种经济、有效的抗氧化剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，提供支链alpha酮酸作为抗氧化剂的应用，具体体现在支链alpha酮酸具有清除H2O2分解产生的HO·的能力。

优选的，本发明提供支链alpha酮酸作为抗氧化剂在制备用于抗氧化的保健品和药物的应用。

优选的，本发明提供支链alpha酮酸作为抗氧化剂在制备食品添加剂中的应用。

优选的，本发明提供支链alpha酮酸作为抗氧化剂在制备化妆品中的应用。

优选的，上述支链alpha酮酸为α-酮-β-甲基戊酸，α-酮异己酸，和α-酮异戊酸中的任意一种。

优选的，上述支链alpha酮酸为α-酮-β-甲基戊酸，α-酮异己酸，和α-酮异戊酸按照摩尔浓度比1：1：1形成的组合物。

本发明使用DCF(dihydrodichlorofluorescein)反应和MTT检测方法，分别在体外研究BCKA清除HO·的能力，以及在体内保护H2O2诱导的小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)细胞的能力。所述BCKA为α-酮-β-甲基戊酸，α-酮异己酸，和α-酮异戊酸按照摩尔浓度比1：1：1形成的组合物。首先，通过DCF反应检测BCKA的抗氧化能力，结果表明随着BCKA浓度的增加，BCKA清除H2O2分解产生的HO·能力逐渐增强，能有效减少HO·积累。然而，随着反应时间的延长，BCKA的抗氧化性逐渐下降。进一步以野生型C57BL/6小鼠的MEF为实验对象，通过比较MEF细胞中添加BCKA和PBS(对照)，分别加入H2O2和钙离子载体Ca²⁺lonophore。结果表明，外加BCKA对MEF细胞有很强的抗H2O2能力，其细胞生存率明显高于PBS处理组。因此，BCKA可以显著抑制H2O2诱导的MEF细胞中的氧化应激，增加细胞活力，保护细胞免受H2O2诱导的氧化损伤。随后，通过DCF反应，分别检测了三种BCKA：KIM、KIC和KIV清除HO·的能力，结果表明随着浓度的增加，清除HO·的能力逐渐增强，且KIC具有最高的细胞保护能力。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明发现支链alpha酮酸的新功能，即支链alpha酮酸具有抗H2O2氧化及清除HO·的作用。

2.本发明提出支链alpha酮酸在抗衰老中的作用，在制备用于抗氧化的保健品、药物、食品添加剂和化妆品等方面应用。

附图说明

图1是BCKA可以减少H2O2产生的HO·积累的结果图。

图2是MTT测定BCKA对H2O2和Ca²⁺lonophore处理MEF细胞活力的影响结果图。

图3是KIM、KIV和KIC分别可以减少H2O2产生的HO·的积累的结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明所使用的试剂来源：

1、异亮氨酸代谢产生的α-酮-β-甲基戊酸(KIM)，Sigmaaldrich，产品编号K7125。

2、亮氨酸代谢产生的α-酮异己酸(KIC)，Sigmaaldrich，产品编号W387101。

3、缬氨酸代谢产生的α-酮异戊酸(KIV)，Sigmaaldrich，产品编号198994。

4、实施例1-3所述的BCKA是α-酮-β-甲基戊酸，α-酮异己酸，和α-酮异戊酸按照摩尔浓度比1：1：1形成的组合物。

【实施例1】BCKA对抗H2O2氧化剂的DCF荧光测定

DCF荧光测定是利用特异荧光探针DCF监测HO·含量。H2O2在水溶液中很不稳定，分解产生的HO·可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。样品可以通过激光共聚焦显微镜(FV1000,Olympus)直接观察，激发波长488nm，发射波长505nm。通过共聚焦显微镜拍照观察各组荧光强度值，检测各组中H2O2水溶液中的HO·含量，以明确BCKA是否可以减少H2O2体外产生的HO·积聚，并明确BCKA抗氧化的重要作用。

在96孔板中，分别加入50μl的5mM氧化剂H2O2，和50μl不同浓度的BCKA。BCKA浓度分别取0mM，1.5mM，3mM，5mM，7.5mM，15mM。反应1h后，然后加入200μl体积DCFH(10mmol/L)。取20min，30min，50min和100mM时间点，激光共聚焦显微镜拍照观察。每组实验有三个重复，且实验重复三次，并采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。

结果如图1所示，在没有BCKA处理的情况下，可以观察到H2O2组具有高水平的DCF荧光，这表明反应中具有高水平的HO·累积。然而，用不同浓度(从1.5到15mM)的BCKA处理之后，观察到随着BCKA浓度的增加，DCF荧光量逐渐降低，表明BCKA消除HO·能力逐渐增强。结果提示BCKA能有效减少H2O2分解产生的HO·积累。

【实施例2】BCKA对MEF细胞生存率的影响

一.MEF细胞处理

本实验采用H2O2刺激和钙离子载体Ca²⁺lonophore处理的MEF细胞作为模型考察BCKA对细胞保护的作用机制。本实验共分为三组，分别为未处理组(control)，H2O2处理组(H2O2)，和钙离子载体Ca²⁺lonophore处理组(Ca²⁺lonophore)。其中，每组又分别设立了PBS处理组(PBS)和5mM BCKA处理组(BCKA)。每组3个平行。细胞的许多功能都依赖于细胞内外极高的钙离子浓度差存在，Ca²⁺lonophore作为钙离子载体，可以使钙离子穿过细胞膜，降低细胞内外离子浓度差，进而损伤细胞，甚至引起细胞死亡。

取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1×10⁵个/ml接种到6孔板，每孔300μl，于37℃、5％CO2的培养箱内预培养24h。更换细胞培养液，分别加入500μl的PBS，5mM氧化剂H2O2，或者5mM钙离子载体Ca²⁺lonophore，37℃孵育2h后加入PBS或者5mM BCKA。于37℃孵育12h后检测。

二.MEF细胞活性检测

MTT检测是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，然后检测在720nm波长处光吸收值，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，可间接反映活细胞数量。

为了评估BCKA是否可以抑制体内H2O2诱导的细胞活力下降，我们用50μL PBS和50μM BCKA分别处理100μM H2O2诱导的和100μM Ca²⁺lonophore处理的MEF细胞。即，将待检测的6孔板中的细胞，用PBS洗涤一次，并向每个孔中加入20μL在PBS溶液中的MTT(5mg/mL)，和50mM的DMSO，然后将平板进一步温育4h。最后，通过酶标仪读取在720nm波长处的吸光度(OD)，并计算细胞存活率[存活率＝实验组OD值×100％/对照组OD值]。所有细胞测定均重复进行。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。多组间比较，采用方差齐性检验和单因素方差分析(One Way ANOVA)。两组间计量资料差异比较采用t检验，检验水准α＝0.05。以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.001为极显著差异。结果表示为相比对照的百分比(未处理组的PBS组作为对照)，并且每个值表示三次独立实验的平均值±SD。注释：*表示P＜0.01，***表示与未处理组相比P＜0.001，#表示与PBS组相比P＜0.01，##表示与PBS组相比P＜0.05，###表示与PBS组相比P＜0.001。

结果如图2所示，与未处理组相比，用100μM H2O2处理细胞后，MEF细胞的活力显著降低(n＝4，P＜0.001)，表明H2O2对MEF细胞造成氧化损伤，使得细胞的存活率下降。此外，通过比较PBS和BCKA对H2O2诱导的细胞凋亡的影响，我们发现BCKA能显著提高MEF细胞活性，并有效保护MEF细胞免于H2O2诱导的细胞凋亡(n＝4，P＜0.001)。

Ca²⁺lonophore作为钙离子载体，可以使钙离子穿过细胞膜。与未处理组相比，Ca²⁺lonophore减少了细胞内外的离子差，并诱导细胞死亡。进一步比较BCKA与Ca²⁺lonophore对MEF细胞活力的影响，发现H2O2+BCKA组与H2O2+Ca²⁺lonophore组有显着性差异(n＝4，P＜0.001)。数据表明BCKA有效保护MEF细胞免受H2O2诱导的细胞死亡。然而，BCKA不能通过改变离子浓度差保护细胞损伤。这一结果表明，BCKA可以通过降低ROS活性来保护细胞，而不是调节Ca²⁺通道。

综上所述，本部分通过细胞活力检测发现，在细胞水平上BCKA对H2O2诱导产生的的氧化应激具有显著的抑制作用，说明BCKA具有较强的抑制氧化应激损伤，从而保护细胞的作用。

【实施例3】各组分BCKA对抗H2O2氧化剂的DCF荧光测定

为了进一步确定KIM、KIV和KIC各自的还原能力，通过共聚焦显微镜观察由DCF反应产生的DCF荧光。在96孔板中，PBS组加入50μl作为对照，所有处理组加入50μl的5mM氧化剂H2O2，然后分别加入50μl的5mM的KIM、KIV、KIC和BCKA。反应1h后，加入1mL体积DCFH(10mmol/L)。取20min，30min，50min和100mM时间点，激光共聚焦显微镜拍照观察。每组实验有三个重复，且实验重复三次。照片代表来自三次重复实验的典型和平均结果。

结果如图3所示，比较了KIM、KIV和KIC的还原能力。将5mM的KIM、KIV、KIC和BCKA分别与1.5mM H2O2以不同的反应时间(10-150min)温育。结果表明，与单一H2O2处理组相比，KIM、KIV和KIC都具有很强的还原能力以消除由H2O2产生的高水平HO·积累。然而，随着反应时间的延长，DCF的荧光强度逐渐增加，KIM、KIV和KIC的反应能力降低，不能继续减少HO·积累。比较三种BCKA，由亮氨酸代谢产生的KIC较KIM和KIV具有更强的还原能力。这部分研究表明，KIM、KIV和KIC是具有强还原能力的天然抗氧化剂。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。