专利名称：一株产具有细胞毒活性化合物黑麦酮酸f的深海来源青霉菌f11的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产具有细胞毒活性化合物黑麦酮酸F的深海来源青霉菌Fll.
背景技术：
深海微生物由于其处于高压、低温(部分区域如热液口为高温)、厌氧、极端PH梯度、高盐浓度、高金属浓度、无光照、寡营养、高卤素等到特殊极端环境中，可产生许多结构新颖、功能独特及毒副作用较低的次生代谢产物，这类次生代谢产物是成为了开发的热点。海洋真菌是海洋微生物的重要组成，真菌通过吸附于有机物质上进行渗透营养生长的异养真核生物，与细菌相比，真菌相对高等，代谢能力更强，生命活动更复杂，并又与海洋中动植物有着非常复杂的生态关系，而较之海洋放线菌，则具有生长速度快，遗传背景更为复杂等特性，其化学结构丰富多样，许多分子结构新颖独特。相对于海洋动植物共附生真菌活性物的丰硕研究成果，国内对海洋沉积物真菌的研究较少，迄今为止从海洋沉积物真菌中分离到的次生代谢产物及发现的新化合物分别只占已报道的海洋真菌次生代谢产物及新化合物的3%和4%。目前，与深海真菌相关的研究尚为不多。Raghukumar C等分离了来源于深海沉积物、贝类中的真菌，发现了 Aspergillus属的耐嗜压真菌。Turley C M等自4500米身深的西北大西洋分离到目前唯一的极端嗜压真菌，属于Bodo属，鞭状。2007年，Bass D等对11 个来自1500-4000米深海水体和沉积物样本进行了真菌的分子生态学研究，发现与表层海水相比，深海真菌的含量及多样性均较低，且以酵母为主。海洋来源真菌次级代谢产物的研究开始于1945年，Giuseppe Brothzu从意大利撒丁岛海水中分离到具有抗菌活性的真菌Acremomum chrysogenum, Newton。GG等利用该真菌分离得到了具有抗菌活性的化合物cephalosporin C。其后直到20世纪90年代，海洋真菌次级代谢产物的研究进入一个活跃时期，到2006年为止，共发现新天然产物500多种。其中一些具有良好的抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。这些真菌大多数来源于海绵 (28% )和海藻(27% )，来自海洋沉积物的较少)，来之深海的更少。
发明内容
本发明目的在于提供一种产具有良好细胞毒活性化合物黑麦酮酸F的深海来源青霉菌(Penicillum sp. )F11。该青霉菌的菌种保藏号为CCTCC NO =M 2010246，保藏日期为2010年9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武汉大学，保藏机构为中国典型培养物保藏中心。我们从西南太平洋深海沉积物中分离得到一株真菌。使用ITS4、ITS5引物扩增得到ITS序列，经BLAST鉴定该株菌为青霉菌(Penicillum sp.)。经活性筛选发现其发酵液的KOAc萃取物对肿瘤细胞具有良好细胞毒作用。通过对其代谢产物分离得到一个具有良好细胞毒活性的化合物黑麦酮酸F。
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Secalonic acid F黑麦酮酸F
图1是青霉菌Fll在PDA平板上的菌落；图2是青霉菌Fll在显微镜下形态。图3为Fll ITS电泳图；图4. Fll菌株HPLC指纹图谱；图5化合物F1120菌株HPLC指纹图谱；图 6F1120 质谱图；图7F1120 碳谱图；图 8F1120 氢谱图；图 9F1120DEPT 图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。实施例1A本发明所涉及菌株的分离鉴定从西南太平洋劳盆地17Mm深海沉积物中用PDA+氯霉素平板分离了 21株真菌， 以来自A549 (肺癌)、SW480 (结肠腺癌)，HL60 (急性早幼粒细胞白血病)肿瘤细胞株为模型，采用CCK8方法检测了这21株深海来源真菌的细胞毒活性，其中1株丝状真菌Fll表现出较好的肿瘤细胞毒性，其乙酸乙酯粗体物在100微克/毫升浓度下，对三种肿瘤细胞株的抑制率均达到99%以上。该菌株经分类学研究和分子生物学研究鉴定为青霉菌(Penicillum sp.)。该菌的微生物学特征为在PDA平板上培养三天后，菌落呈现白色，多为营养菌丝。其营养体为无色或淡色的菌丝体，菌丝各细胞之间有横隔膜.整个菌丝体分为伸入营养基质中吸取营养的基质菌丝和伸向空气中的气生菌丝。5天后可见气生菌丝上产生简单的长而直立的分生孢子梗，顶端以特殊的对称的扫帚状的方式分支，分支为多极的分生孢子梗最后产生许多瓶梗，在瓶梗上着生分生孢子链.分生孢子为球形至卵形，呈绿色，同时菌落呈现墨绿色，显微镜检可见成团菌丝体。(图1，图2)。在PDA液体培养中，按1 50接种，28°C、180RPM摇培3天可见白色菌丝球出现，随着培养时间的延长，菌丝球从黄色最终变成黑色，液体培养基颜色也相应地从黄色变成黑色。7天后培养基完全变成黑色。B青霉菌Fll的基因组DNA提取1)菌株在25°C摇床(120r/min)培养5天；2)取冷冻干燥后的菌丝0. 15g，加适量的液氮研磨充分；3)在研钵中加入 2ml 提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7. 2,50mmol/L EDTA, 3% SDS,1% β-巯基乙醇，充分混合均勻，转移至5mL离心管中，加入2mL苯酚氯仿 异戊醇 05 24 1)抽提，12000171^11，离心101^11;上清液加入2(^1^ RNase (5mg/mL)， 55°C, Ih ;再加入201^蛋白酶1((51^/1^)(酶解时间可延长)，551，111 ；加入2mL苯酚氯仿异戊醇05 24 1)再抽提一次，12000r/min，离心lOmin，上清液加入1/10体积的 NaAc(3mol/L),0. 7 体积异丙醇，_20°C 沉淀 20min, 12000rpm 离心 15min，弃上清，用 70% 冷乙醇洗两次，用干净滤纸吸去离心管壁的液体，室温干燥15min，加入150 μ L.纯水溶解沉淀，-20°C保存备用。取5 μ LDNA与1 μ L溴酚蓝；在0. 8%的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。C菌株鉴定通过引物ITS45，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，禾口 ITS55，-GGAAGTAAAAGT CGTAAC AAG G-3，对 FllDNA 进行扩增，PCR 为 94°C预变性 3min 94°C变性 lmin，53°C复性 45s，72°C延伸4 :35个循环，72°C延伸10min，4°C保温。将扩增片段用T载克隆转化到 DH5a0跑胶验证得到阳性克隆(如图3)。对阳性克隆进行测序，获得青霉菌Fll的ITS序列如下ggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagt60
gagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtttattttaccttgttgcttcggcgggc120
ccgccttaactggccgccggggggcttacgCCCCCgggCCCgCgCCCgCCgaagacaccc180
tcgaactctgtctgaagattgtagtctgagtgaaaatata3.3. 3. 3.3.aactttcaac240
aacggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtga300
attgcaaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgcccccaggtattccgg360
ggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggccccg420
tcctccgatcccgggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccggtcctcgag480
cgtatggggctttgtcacccgctctgtaggCCCggCCggCgcttgccgatcaacccaaat540
ttttatccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcasta600
agcggagga609对青霉菌Fll的ITS序列(GENE Bank ID :EU497948)进行BLAST分析，结果显示该序列和 Penicillium chrysogenum strain ATCC 10106 (GENE Bank ID :HQ026745. 1)相似度最高，达到99%。故可鉴定该株菌属于青霉属(Penicillum sp.).实施例2发酵产物中分离鉴定黑麦酮酸F对真菌Penicillium sp. Fll进行80升规模的发酵，并通过乙酸乙酯等量萃取3 次，萃取液减压蒸干，获得12. 5克浸膏。浸膏取小样通过环己烷与甲醇萃取，取甲醇相进行 HPLC检测(图4)。根据指纹图谱，将浸膏用环己烷与甲醇萃取，取甲醇相用上减压硅胶柱，依次用环己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇洗脱。收集乙酸乙酯相上硅胶柱，用不同比例的环己烷二氯甲烷丙酮洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，共收集40份样品。通脱TLC及HPLC检测，发现20号样品纯度好，为亮黄色粉末，285. 9mg。对20号样品进行HPLC检测，显示20号样品为主代谢峰。通过核磁及质谱对F1120化合物进行鉴定，最终确定该化合物为黑麦酮酸(5 图 9)实施例3本发明所产化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用。CCK-8 测定方法=Cell Counting Kit-8 (CCK-8)利用了 Dojindo 开发的四唑盐_WST -8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-O，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体I-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臌染料。 CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中；不需要预配各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST -8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臌染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臌量与活细胞数量成正比。由于CCK-8溶液相当稳定，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。对数生长期肿瘤细胞0. 25%胰酶消化后，接种至96孔板，接种量10000/孔。37°C、 5% CO2条件下培养过夜后加入受试化合物黑麦酮酸F，取三个浓度梯度，分别为IOOyg/ ml、50y g/ml、25y g/ml，以紫衫醇为阳性对照，DMSO为阴性对照，每个样品浓度做三个复孔。培养48小时后，加入10 μ g CCK-8试剂，培养2小时，测定450nm吸光度，参比波长为 600nm，并计算抑制率。实验结果表明，化合物黑麦酮酸F对肿瘤细胞株A549、HL60、SW480的生长有明显的抑制作用(结果如下表)。
权利要求
1.一种青霉菌Fll(Penicillum sp. Fll)，其特征在于，其保藏号为CCTCC NO =M 2010246。
2.如权利要求1所述的青霉菌FlKPeniciIlumsp. Fll)，其特征在于能够产生一种具有良好细胞毒活性的化合物黑麦酮酸F。
3.—种生产黑麦酮酸F的方法，其特征在于发酵培养权利要求1所述的青霉菌F11， 获得含有该黑麦酮酸F的发酵物，从该发酵物中分离麦黑麦酮酸F。
全文摘要
本发明一株产具有细胞毒活性化合物黑麦酮酸F的深海来源青霉菌F11。该菌从海洋沉积物中分离得到，使用ITS4、ITS5引物扩增得到ITS序列，经BLAST鉴定该株菌为青霉菌(Penicillum sp.)，该菌种的保藏号为CCTCC NOM 2010246。经活性筛选发现其发酵液的EtOAc萃取物对肿瘤细胞具有良好细胞毒作用，通过对其代谢产物分离得到一个具有良好细胞毒活性的化合物黑麦酮酸F。本发明提供的菌株可产具细胞毒活性的化合物黑麦酮酸F，为发酵生产该化合物提供一种新的可能。
文档编号C12N1/14GK102408997SQ20101056699
公开日2012年4月11日 申请日期2010年11月29日 优先权日2010年11月29日
发明者易志伟, 李宁, 汤熙翔 申请人:国家海洋局第三海洋研究所