本发明属于生物制造技术领域，特别涉及蜂胶-纳米银敷料的制备方法及应用。
背景技术：
由于失血是战伤伤员死亡最重要的原因之一，因此多功能性高端快速止血敷料是在战场和日常各种创伤发生情况下进行急救的重要工具。战伤失血通常分为体内出血和体外出血，体内出血大部分是因为脏器破裂，体外出血基本是由于动静脉损伤。如果能及时有效地止血，对挽救伤员生命，稳定伤情，为后续治疗创造条件十分重要。而敷料作为止血材料，是指盖在伤口上、有保护作用的覆盖物，可以协助控制出血，防止感染并吸收分泌物，止血敷料对于及时止血有着重要的意义。
静电纺是一种在高压电场的作用下将聚合物制备成纳米纤维的技术，由于它的多功能性和高效性，静电纺已广泛应用于制备各种功能纳米纤维。电纺纳米纤维膜具有许多显著地特性，如较大的比表面积，纳米尺寸的孔径，灵活的物理/化学改性等。因其特有的性质和功能已被广泛应用于医药领域。由于纳米纤维的大比表面积和多微孔结构的特性，可以诱导纤维细胞粘附到真皮层，并将作用药物迅速传送到真皮皮层，最大限度发挥药效。
蜂胶的有效成分为黄酮类物质，能够扩张外周血管、改善微循环,有较强的祛腐生肌,解热收敛作用，是上好的止血药物，纳米银具有良好的抗菌性能，适用于制作消毒类的医用产品，然而两者均造价昂贵，制作过程损耗大，因此，市场上一直缺少将两者进行高效结合的有利技术。
技术实现要素：
本发明的目的是为解决以上问题，本发明提供一种蜂胶抗菌敷料的制备方法及应用。本发明的技术方案是通过以下实现的。
根据本发明的一个方面提供一种蜂胶-纳米银敷料的制备方法，包括以下步骤：
(1)进行蜂胶提纯，制得蜂胶提纯液；
(2)制备提纯蜂胶的银络合物；
(3)制备提纯蜂胶-纳米银混合剂；
(4)在提纯蜂胶-纳米银混合剂中加入聚偏二氟乙烯、二甲亚砜、聚丙烯酰胺和表面活性剂，形成静电纺丝液；
(5)使用静电纺丝液进行静电纺丝，生成蜂胶-纳米银敷料。
其中，步骤(2)包括：
设置温度50～70℃，转速500～600rpm，将agno3溶液逐滴加入到蜂胶提纯液中，有黄色沉淀析出，反应预定时间后，使用naoh溶液调节ph值至9.5～11，将溶液离心，收集到提纯蜂胶-纳米银混合剂。
其中，步骤(2)包括：
agno3溶液的浓度为12.0～16mmol/l，预定时间为30～40min。
其中，步骤(3)包括：
将提纯蜂胶-纳米银混合剂加入至75％的乙醇溶液中，加入edta，水浴反应至溶液颜色变黄，形成提纯蜂胶-纳米银混合剂。
其中，步骤(1)包括：制得10ml含有0.5mg/ml黄酮的蜂胶提纯液；
步骤(3)包括：加入6.5mg的edta。
其中，步骤(1)包括：使用70％溶液浸泡蜂胶30～40min，超声波提取20～30min，离心抽滤得到蜂胶提纯液。
其中，步骤(5)包括：其中静电纺丝电压为15～18kv，针头与接收板之间的距离为16～20cm，推进泵的推进速度为0.25～0.30mm/h，纺丝环境温度为30～35℃。
其中，步骤(4)包括：提纯蜂胶-纳米银混合剂、聚偏二氟乙烯、二甲亚砜和表面活性剂的比例为(274～290):(52～60):(10～12):(0.8～1)，超声震荡15～30min。
根据本发明的另一方面，提供该种蜂胶-纳米银敷料在止血方面的用途。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明开创性地将蜂胶与纳米银离子高效混合，蜂胶和纳米银离子的有效利用率均具有大幅度提高，降低了产品的造价，市场前景广阔。
2.本发明联合静电纺丝技术，能够使止血成份迅速渗透至出血部位，实现迅速吸收，快速止血。另外，本发明的敷料的药效成分在敷料上分布均匀细腻，敷料自身的实用价值高。
3.本发明的制备方法制得止血敷料，杂质少，成份安全可靠，能降低疤痕的产生的几率。
4.本发明的敷料抗菌性能强大，能避免二次感染。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然说明书中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1蜂胶-纳米银敷料x1的制备方法
包括以下步骤：
使用50％乙醇溶液浸泡10mg蜂胶30min，超声波提取30min，离心抽滤得到10ml浓度为0.13mg/ml的蜂胶提纯液。设置温度50℃，转速600rpm，将浓度为12mmol/l的1lagno3溶液伴随磁力搅拌逐滴加入到蜂胶提纯液中，有黄色沉淀析出，40min反应完全后，使用naoh溶液调节ph值至9.5，将溶液离心，收集到提纯蜂胶-纳米银混合剂。将提纯蜂胶-纳米银混合剂加入至75％的乙醇溶液中，加入11mg的edta，水浴反应至溶液颜色变黄，形成提纯蜂胶-纳米银混合剂。在提纯蜂胶-纳米银混合剂中加入比例为274：57：10：0.9的聚偏二氟乙烯、二甲亚砜、聚丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠，高温加热至80度左右，并超声震荡15min，形成静电纺丝液。静电纺丝制得蜂胶-纳米银敷料x1，其中静电纺丝电压为15kv，针头与接收板之间的距离为16cm，推进泵的推进速度为0.30mm/h，纺丝环境温度为35℃。
经检测，蜂胶-纳米银敷料x1中的含银量为7.6mmol，约813.2mg，银的转化率为63％，类黄酮物质的含量为1.3mg，类黄酮物质的提取率为13％。
实施例2蜂胶-纳米银敷料x2的制备方法
包括以下步骤：
使用50％乙醇溶液浸泡6mg蜂胶40min，超声波提取25min，离心抽滤得到10ml黄酮浓度为0.09mg/ml的蜂胶提纯液。设置温度70℃，转速550rpm，将浓度为16mmol/l的agno30.5l溶液伴随磁力搅拌逐滴加入到蜂胶提纯液中，有黄色沉淀析出，35min反应完全后，使用naoh溶液调节ph值至10.5，将溶液离心，收集到提纯蜂胶-纳米银混合剂。将提纯蜂胶-纳米银混合剂加入至75％的乙醇溶液中，加入6.5mg的edta，水浴反应至溶液颜色变黄，形成提纯蜂胶-纳米银混合剂。在提纯蜂胶-纳米银混合剂中加入比例为290：52：11：1的聚偏二氟乙烯、二甲亚砜、聚丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠，高温加热至80度左右，并超声震荡25min，形成静电纺丝液。静电纺丝制得蜂胶-纳米银敷料x2，其中静电纺丝电压为18kv，针头与接收板之间的距离为17cm，推进泵的推进速度为0.25mm/h，纺丝环境温度为30℃。
经检测，蜂胶-纳米银敷料x2中的含银量为4.9mmol，约524.3mg，银的转化率为61％，类黄酮物质的含量为0.9mg，类黄酮的提取率为15％。
实施例3蜂胶-纳米银敷料x3的制备方法
包括以下步骤：
使用50％乙醇溶液浸泡20mg蜂胶35min，超声波提取20min，离心抽滤得到15ml黄酮浓度为0.2mg/ml的蜂胶提纯液。设置温度70℃，转速500rpm，将浓度为15mmol/l的agno31.5l溶液伴随磁力搅拌逐滴加入到蜂胶提纯液中，有黄色沉淀析出，30min完全反应后，使用naoh溶液调节ph值至11，将溶液离心，收集到提纯蜂胶-纳米银混合剂。将提纯蜂胶-纳米银混合剂加入至75％的乙醇溶液中，加入19.5mg的edta，水浴反应至溶液颜色变黄，形成提纯蜂胶-纳米银混合剂。在提纯蜂胶-纳米银混合剂中加入比例为280：52：12：0.8的聚偏二氟乙烯、二甲亚砜、聚丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠，高温加热至80度左右，并超声震荡30min，形成静电纺丝液。静电纺丝制得蜂胶-纳米银敷料x3，其中静电纺丝电压为17kv，针头与接收板之间的距离为20cm，推进泵的推进速度为0.30mm/h，纺丝环境温度为32℃。
经检测，蜂胶-纳米银敷料x3中的含银量为15.5mmol，约1658.5mg，银的转化率为69％，类黄酮物质的含量为0.3mg，类黄酮的提取率为15％。
对比例1蜂胶纳米纤维膜1的制备方法
包括以下步骤：
将10mg蜂胶置于0℃以下的环境下冷藏1小时以上，使其变硬；将变硬的蜂胶进行粉碎至粉末状；将蜂胶粉末溶解于30-95％浓度的酒精溶液，蜂胶粉末与酒精溶液重量比为1:1；进行超声波分散2分钟，后进行溶解4小时以上，溶解过程中伴随搅拌或者加热；进行过滤，去杂后的乙醇蜂胶溶液中加入比例为274：57：10：0.9的聚偏二氟乙烯、二甲亚砜、聚丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠，高温加热至80度左右，并超声震荡15min，形成静电纺丝液。采用静电纺丝技术进行喷射纺丝制得蜂胶纳米纤维膜1，其中静电纺丝电压为15kv，针头与接收板之间的距离为16cm，推进泵的推进速度为0.30mm/h，纺丝环境温度为35℃。
经检测，蜂胶纳米纤维膜1含有类黄酮物质0.42mg，类黄酮物质的提取率为4.2％。
对比例2含银伤口敷料1的制备方法
包括以下步骤：
蒸馏水用naoh调节ph至12；设置温度50℃，转速600rpm，逐滴加入1.5mmol的agno3至溶液颜色变黄；加热搅拌3h后至agno3完全转化，避光保存备用，制得纳米银溶液。在该纳米银溶液中加入比例为274：57：10：0.9的聚偏二氟乙烯、二甲亚砜、聚丙烯酰胺和十二烷基磺酸钠，高温加热至80度左右，并超声震荡15min，形成静电纺丝液。静电纺丝制得含银伤口敷料1，其中静电纺丝电压为15kv，针头与接收板之间的距离为16cm，推进泵的推进速度为0.30mm/h，纺丝环境温度为35℃。
经检测，含银伤口敷料1的含银量为0.34mmol，约36.38mg，银的转化率为23％。
实验例1血液吸收实验
①.实验步骤：称取20ml血液置于烧杯中，分别裁切出1cm*1cm尺寸的蜂胶-纳米银敷料x1～x3和蜂胶纳米纤维膜1投入烧杯中，其中蜂胶-纳米银敷料x1～x3和蜂胶纳米纤维膜1的厚度均为0.3毫米，记录吸附全部血液所需时间，如不能完成吸附，记录最大吸附时间。
②.实验结果：
蜂胶-纳米银敷料x1～x3和蜂胶纳米纤维膜均顺利完成吸附，其中蜂胶-纳米银敷料x1所需时间为12s，蜂胶-纳米银敷料x2所需时间为16s，蜂胶-纳米银敷料x3所需时间为10s，而蜂胶纳米纤维膜1所需时间为32s。
实验例2止血实验
①.实验步骤：选取40只体重为6.0～6.3kg的比利时长耳兔，随机分为4组，每组10只，进行止血测试实验。按40mg/kg剂量静脉缓慢注射戊巴比妥钠溶液麻醉后，将其中央耳动脉区域备皮、消毒，沿耳动脉方向切开皮肤，钝性分离出耳动脉、静脉和神经，再用手术刀横向切断动脉，待血液涌出后立即用1层尺寸为1*1cm的待测试材料并使用推拉力计施加3n的压力，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，计算每组所用平均时间。其中每组使用一种实施例1～3中的蜂胶-纳米银敷料或对比例1的蜂胶纳米纤维膜1作为待测试材料。
②.实验结果：
胶-纳米银敷料x1～x3的平均止血时间分别为90s，97s和89s，而对比例的蜂胶纳米纤维膜1的平均止血时间为129s。
综上，本方法蜂胶中的类黄酮的提取比例高达15％左右，银的转化比例高于60％以上，降低了生产成本。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。