本发明涉及双层膜技术领域，尤其涉及一种改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜及其制备方法。
背景技术：
发生骨缺损时，生长速度较快的软组织细胞会比成骨细胞先长入缺损区，影响骨细胞的生长，从而影响骨修复效果。为了解决这一问题，通常使用引导性骨再生膜将软组织细胞与骨缺损区分离，阻止软组织细胞生长过快进入骨缺损区，影响骨细胞生长，而引导性骨再生膜经过体内的体液循环最终降解。
引导性骨再生膜与软组织细胞和骨细胞的生物相容性直接影响着软组织细胞和骨细胞的生长。目前，引导性骨再生膜通常包括纳米纤维膜、羟基磷灰石膜。这些引导性骨再生膜虽然能够将软组织细胞与骨缺损区分离，但是现有技术中的引导性骨再生膜与软组织细胞以及骨细胞的生物相容性并不好，导致现有技术中的引导性骨再生膜不能同时促进骨细胞和软组织细胞的生长。
技术实现要素：
本发明提供了一种改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，本发明提供的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜能够同时促进骨细胞和软组织细胞的生长。
本发明提供了一种改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，包括层叠的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和壳聚糖膜；
所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜包括聚己内酯膜和分散在所述聚己内酯膜中的改性羟基磷灰石；
所述改性羟基磷灰石由羟基磷灰石经硅烷偶联剂改性得到；所述改性羟基磷灰石的粒径为15～20μm。
优选的，所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和壳聚糖膜的厚度比为5～12:1。
优选的，所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的厚度为30～40μm；所述壳聚糖膜的厚度为3～7μm。
优选的，所述硅烷偶联剂为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
优选的，所述改性羟基磷灰石的制备方法包括以下步骤：
将硅烷偶联剂和羟基磷灰石在醇类有机溶剂中混合，将得到的分散液依次进行超声、过滤、洗涤、离心、干燥和研磨处理，得到改性羟基磷灰石。
优选的，所述硅烷偶联剂的体积和羟基磷灰石的质量比为1ml:0.5～2.5g。
优选的，所述干燥的温度为80～100℃，所述干燥的时间为24～28h。
本发明提供了上述技术方案所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的制备方法，包括以下步骤：
(a)将改性羟基磷灰石分散液和聚己内酯溶液混合，采用流延法在基底表面上铺膜，将得到的湿膜干燥，所述改性羟基磷灰石分散在聚己内酯膜中，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜；
(b)采用流延法将壳聚糖溶液在所述步骤(a)得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的表面上铺膜，干燥后去除基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。
优选的，所述步骤(a)中改性羟基磷灰石分散液中改性羟基磷灰石的质量体积浓度为0.005～0.05g/ml；所述步骤(b)中壳聚糖溶液中壳聚糖的质量体积浓度为0.005～0.03g/ml。
优选的，所述步骤(a)中，聚己内酯溶液中的聚己内酯与改性羟基磷灰石分散液中改性羟基磷灰石的质量比为75～85:15～25。
本发明提供了一种改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，包括层叠的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和壳聚糖膜；所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜包括聚己内酯膜和分散在所述聚己内酯膜中的改性羟基磷灰石；所述改性羟基磷灰石由羟基磷灰石经硅烷偶联剂改性得到；所述改性羟基磷灰石的粒径为15～20μm。本发明提供的双层膜，一侧为改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜，另一侧为壳聚糖膜。本发明提供的双层膜作为引导性骨再生膜，应用于骨缺损区时，双层膜中改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜一侧贴附于骨缺损区，能够促进骨细胞的生长；双层膜中壳聚糖膜一侧贴附于软组织区，能够促进软组织细胞的生长；同时，将双层膜应用于骨缺损区，双层膜能够将骨缺损区的骨细胞和软组织细胞分隔开，避免了软组织细胞由于生长过快，进入骨缺损区，影响骨细胞生长的问题。因此，本发明提供的双层膜能够同时促进骨细胞和软组织细胞生长的目的。
附图说明
图1中a为改性羟基磷灰石在冰醋酸中的分散状态；b为未经改性羟基磷灰石在冰醋酸中的分散状态；
图2为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜在300倍电镜下的sem图；
图3为对比例1得到的壳聚糖膜在300倍电镜下的sem图；
图4为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜在壳聚糖膜侧观察的300倍电镜下的sem图；
图5为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的断面sem图；
图6为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜以及对比例1得到的壳聚糖膜和的x射线衍射图；
图7为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜以及对比例1得到的壳聚糖膜的红外谱图；
图8为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜以及对比例1得到的壳聚糖膜的dsc图；
图9为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的tg、dtg曲线；
图10为对比例1得到的壳聚糖膜的tg、dtg曲线；
图11为实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的tg、dtg曲线；
图12为在实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜上培养的成骨细胞照片；
图13为在对比例1得到的壳聚糖膜上培养的成骨细胞照片；
图14为在实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜一侧培养的成骨细胞照片；
图15为在实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜上培养的软组织细胞照片；
图16为在对比例1得到的壳聚糖膜上培养的软组织细胞照片；
图17为在实施例1得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的壳聚糖膜一侧培养的软组织细胞照片。
具体实施方式
本发明提供了一种改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，包括层叠的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和壳聚糖膜；
所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜包括聚己内酯膜和分散在所述聚己内酯膜中的改性羟基磷灰石；
所述改性羟基磷灰石由羟基磷灰石经硅烷偶联剂改性得到；所述改性羟基磷灰石的粒径为15～20μm。
在本发明中，所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和壳聚糖膜的厚度比优选为5～12:1，进一步优选为6～11:1，更优选为8～10:1。
在本发明中，所述壳聚糖膜的厚度优选为3～7μm，进一步优选为4～6μm。
在本发明中，所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的厚度优选为30～40μm，进一步优选为32～38μm，更优选为34～36μm。在本发明中，所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜包括聚己内酯膜和分散在所述聚己内酯膜中的改性羟基磷灰石。在本发明中，所述聚己内酯作为成膜剂，改性羟基磷灰石均匀地分散在聚己内酯膜中，所述改性羟基磷灰石和聚己内酯之间是物理混合。
在本发明中，所述改性羟基磷灰石由羟基磷灰石经硅烷偶联剂改性得到；所述改性羟基磷灰石的制备方法优选包括以下步骤：将硅烷偶联剂和羟基磷灰石在醇类有机溶剂中混合，然后将得到的分散液依次进行超声、过滤、洗涤、离心、干燥和研磨处理。
在本发明中，所述硅烷偶联剂的体积和羟基磷灰石的质量比优选为1ml:0.5～2.5g，进一步优选为1ml:1.0～2.0g。在本发明中，所述硅烷偶联剂优选为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
在本发明中，所述醇类有机溶剂的体积和羟基磷灰石的质量比优选为20～30ml:10g，进一步优选为22～28ml:10g，更优选为24～26ml:10g。在本发明中，所述醇类有机溶剂优选包括甲醇和/或乙醇。
在本发明中，所述混合优选包括：将硅烷偶联剂溶于醇类有机溶剂中，得到硅烷偶联剂的醇溶液；将羟基磷灰石溶于醇类有机溶剂中，得到羟基磷灰石的醇溶液；然后将所述硅烷偶联剂的醇溶液和羟基磷灰石的醇溶液混合。在本发明中，所述硅烷偶联剂的醇溶液的体积浓度优选为14％～16％，进一步优选为15％；所述羟基磷灰石的醇溶液的质量体积浓度优选为15～18g/ml，进一步优选为16～17％。在本发明中，所述硅烷偶联剂的醇溶液和羟基磷灰石的醇溶液的体积比优选为1:1～2。本发明采用上述混合方式有利于提高硅烷偶联剂和羟基磷灰石的分散效果，使硅烷偶联剂和羟基磷灰石能更充分地接触，从而提高改性羟基磷灰石的改性效果。
在本发明中，所述超声的功率优选为300w；所述超声的时间优选为40～80min，进一步优选为50～70min，更优选为50～60min。
在本发明中，超声完成后优选对超声得到的悬浊液进行过滤处理。本发明对所述过滤的方式没有特别限定，采用本领域技术人员所熟知的过滤方式即可。
在本发明中，所述过滤得到滤液和固体，对所述固体进行洗涤，得到改性羟基磷灰石。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为乙醇。本发明对洗涤的方式没有特别限定，采用本领域技术人员所述熟知的即可。
在本发明中，所述洗涤得到固体和洗涤剂的混合物，本发明优选对所述得到的固体和洗涤剂的混合物进行离心处理，得到改性羟基磷灰石。
本发明优选对离心得到的固体进行干燥处理，得到改性羟基磷灰石。在本发明中，所述干燥的温度优选为80～100℃，进一步优选为85～95℃，更优选为88～93℃；所述干燥的时间优选为24～28h，进一步优选为25～27h，更优选为25.5～26.5h。
在本发明中，所述干燥优选为分段干燥，先低温干燥再高温干燥；所述低温干燥的温度优选为80～89℃，进一步优选为82～88℃，更优选为84～86℃；所述低温干燥的时间优选为2～3h；所述高温干燥为真空干燥，所述高温干燥的温度优选为90～100℃，进一步优选为92～98℃，更优选为94～96℃；所述高温干燥的时间优选为21～26h。
本发明所述硅烷偶联剂和羟基磷灰石在混合过程中，发生表面改性，实现了硅烷偶联剂对羟基磷灰石的表面改性，使改性羟基磷灰石具有较好的分散性，将改善改性羟基磷灰石在高聚物基体(聚己内酯)中的分散度和结合性。本发明实施例的结果证明，本发明提供的改性羟基磷灰石的分散性优于未经改性的羟基磷灰石的分散性。例如图1中a代表本发明制备得到的改性羟基磷灰石在冰醋酸中的分散状态，b代表未经改性的羟基磷灰石在冰醋酸中的分散状态。由图1中的a和b进行对比可知，本发明提供的改性羟基磷灰石能够均匀地分散在冰醋酸中，而未经改性的羟基磷灰石在冰醋酸中沉降下来。
在本发明中，所述干燥后优选将得到的固体研磨，得到改性羟基磷灰石。本发明优选将干燥固体研磨成粉末状。本发明所述研磨处理后，优选对改性羟基磷灰石过200目筛，取筛下物为目标产物。
在本发明中，所述羟基磷灰石可以购买市售商品，也可以自行制备。本发明对羟基磷灰石的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品或者自行制备而成。当采用自行制备的方式获取羟基磷灰石时，所述羟基磷灰石的制备方法优选包括以下步骤：
①将磷酸氢二铵溶液滴加到硝酸钙溶液中，得到混合溶液；所述磷酸氢二铵溶液的ph值为10～12；所述硝酸钙溶液的ph值为10～12；
②将所述步骤①得到的混合溶液依次进行加热、沉化、离心、洗涤和干燥处理，得到羟基磷灰石。
在本发明中，所述磷酸氢二铵溶液的体积和硝酸钙溶液的体积比优选为1:1。在本发明中，所述磷酸氢二铵溶液的浓度优选为0.003～0.009mol/ml，进一步优选为0.006mol/ml；所述硝酸钙溶液的浓度优选为0.05～0.3mol/ml，进一步优选为0.1mol/ml。
在本发明中，所述步骤①中滴加的速度优选为1.0～1.2ml·min-1。
在本发明中，所述步骤①中磷酸氢二铵溶液的ph值调节剂优选为氨水，本发明对所述氨水的用量和浓度没有特别限定，只要能够将磷酸氢二铵溶液的ph值调节到10～12即可。
在本发明中，所述步骤①中硝酸钙溶液的ph值调节剂优选为氨水，本发明对氨水的浓度没有特别限定，只要能够将硝酸钙溶液的ph值调节到10～12即可。
得到混合溶液后，本发明优选依次对所述混合溶液进行加热、沉化、离心、洗涤和干燥处理，得到羟基磷灰石。
在本发明中，所述步骤②中加热的温度优选为80～90℃，进一步优选为85～86℃，加热的时间优选为10～15h，进一步优选为12～13h。
在本发明中，所述步骤②中沉化的温度优选为20～30℃，进一步优选为25～26℃，沉化的时间优选为10～15h，进一步优选为12～13h。
本发明对所述离心没有具体限制，采用本领域技术人员所述熟知的离心操作即可。
在本发明中，所述洗涤用的洗涤剂优选包括水。本发明对洗涤没有具体限制，采用本领域技术人员所熟知的洗涤操作即可。
在本发明中，所述干燥的温度优选为70～90℃，进一步优选为75～85℃，更优选为80～85℃；所述干燥的时间优选为20～25h，进一步优选为22～24h；所述干燥优选为真空干燥。
本发明还提供了上述技术方案所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的制备方法，包括：
(a)将所述改性羟基磷灰石的分散液和聚己内酯溶液混合，采用流延法在基底表面上铺膜，然后干燥，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜；
(b)采用流延法将壳聚糖溶液在所述(a)得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的表面上铺膜，干燥后去除基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。
本发明将改性羟基磷灰石分散液和聚己内酯溶液混合，采用流延法在基底的单侧面上铺膜，然后干燥，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
在本发明中，所述改性羟基磷灰石分散液中的分散剂优选为冰醋酸。在本发明中，所述改性羟基磷灰石分散液中改性羟基磷灰石的质量体积浓度优选为0.005～0.05g/ml。在本发明中，所述分散剂使改性羟基磷灰石能够均匀地分散。在本发明中，所述聚己内酯溶液中的溶剂优选为冰醋酸，所述聚己内酯溶液的质量浓度优选为5～15％，更优选为10％。
在本发明中，所述聚己内酯溶液中的聚己内酯与改性羟基磷灰石分散液中改性羟基磷灰石的质量比优选为75～85:15～25，进一步优选为78～83:18～23，更优选为79～80:19～20。在本发明中，经硅烷偶联剂改性后，改性羟基磷灰石能够均匀地分散在聚己内酯膜基体中，从而得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
本发明对所述混合的方式没有特别限定，采用本领域技术人员所熟知的混合方式即可。
在本发明中，所述基底优选为聚乙烯薄膜、玻璃板或聚丙烯薄膜。本发明对流延法没有特别限制，采用本领域技术人员所熟知的流延法即可。在本发明中，所述干燥的温度优选为20～30℃，进一步优选为25～26℃，所述干燥的时间优选为20～25h，进一步优选为22～24h。
得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜后，本发明采用流延法将壳聚糖溶液在所述得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的表面上铺膜，干燥后去除基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。
在本发明中，所述壳聚糖溶液中壳聚糖的质量体积浓度优选为0.005～0.03g/ml，所述壳聚糖溶液的溶剂优选为冰醋酸水溶液，所述冰醋酸水溶液的体积浓度优选为1％～5％(v/v)，进一步优选为2％～3％(v/v)。在本发明中，所述溶剂起到溶解壳聚糖的作用；本发明通过将壳聚糖溶液的浓度控制在上述围内，使壳聚糖溶液能够均匀地铺展在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜表面，在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的表面上得到均匀的壳聚糖膜。图3为壳聚糖膜在300倍电镜下的sem图。
采用流延法将壳聚糖溶液在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的表面上铺膜后，本发明优选对铺有壳聚糖湿膜的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜进行干燥处理。本发明对流延法没有特别限制，采用本领域技术人员所熟知的流延法即可。在本发明中，所述干燥的温度优选为20～30℃，进一步优选为25～26℃，所述干燥的时间优选为20～25h，进一步优选为22～24h。。
将所述壳聚糖湿膜干燥后，本发明去除基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。本发明对去除基底的方法没有特别限定，采用本领域技术人员所熟知的去除基底的方法即可。
本发明优选将所述干燥后的双层膜置于氢氧化钠溶液中浸泡，再用去离子水洗涤至中性后干燥备用。在本发明中，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度优选为0.1moi/l，所述浸泡的时间优选为1h。
本发明中，所述改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜可作为引导性骨再生膜，用于同步促进骨细胞和软组织细胞生长。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
取0.05mol/ml硝酸钙溶液50ml，0.3mol/ml磷酸氢二铵溶液50ml。两者分别用氨水调节ph为11，将磷酸氢二铵溶液以1.0ml·min-1的速度滴加到硝酸钙溶液中，边滴加边搅拌，反应后溶液在85℃下搅拌12h。在25℃下，沉化12h。离心后反复水洗三次，80℃真空干燥24h，得到羟基磷灰石。
将4ml硅烷偶联剂分散于26ml乙醇中；将10g羟基磷灰石分散于60ml乙醇中；分别超声处理10min后，将上述两种溶液混合，然后再超声40min。超声完成后进行过滤处理，得到混合物。将混合物用乙醇洗涤，离心分离，先在80℃干燥2h，然后在100℃真空干燥24h，研磨，得样品，过200目筛，得到改性羟基磷灰石备用。
以冰醋酸为溶剂，配制浓度为0.05g/ml的改性羟基磷灰石分散液，然后按照改性羟基磷灰石和聚己内酯质量比为1:5的比例，将改性羟基磷灰石分散液与质量体积百分浓度为5％的聚己内酯冰醋酸溶液混合，采用流延法在基底上铺膜，湿膜厚度0.3mm，然后室温干燥22h，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
以1％(v/v)冰醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为0.01g/ml的壳聚糖溶液，采用流延法将壳聚糖溶液在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜表面上铺膜，湿膜厚度0.3mm，室温干燥22h后除去基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。
实施例2
取0.1mol/ml硝酸钙溶液50ml，0.3mol/ml磷酸氢二铵溶液50ml。两者分别用氨水调节ph为11，将磷酸氢二铵溶液以1.2ml·min-1的速度滴加到硝酸钙溶液中，边滴加边搅拌，反应后溶液在85℃下搅拌12h。在25℃，沉化12h。离心后反复水洗三次，80℃真空干燥，干燥24h，得到羟基磷灰石。
将4ml硅烷偶联剂分散于25ml乙醇中；将10g羟基磷灰石分散于55ml乙醇中；分别超声处理10min后，将上述两种溶液混合，然后再超声40min。超声完成后进行过滤处理，得到混合物。将混合物用乙醇洗涤，离心分离，先在80℃干燥2h，然后在100℃真空干燥24h，研磨，得样品，过200目筛，得到改性羟基磷灰石备用。
以冰醋酸为溶剂，配制浓度为0.01g/ml的改性羟基磷灰石分散液，然后按照改性羟基磷灰石和聚己内酯质量比为1:4的比例，将改性羟基磷灰石分散液与质量体积百分浓度位10％的聚己内酯冰醋酸溶液混合，采用流延法在基底上铺膜，湿膜厚度0.3mm，然后室温干燥24h，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
以2％(v/v)冰醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为0.005g/ml的壳聚糖溶液，采用流延法将壳聚糖溶液在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜表面上铺膜，湿膜厚度0.3mm，室温干燥24h后除去基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。
实施例3
取0.3mol/ml硝酸钙溶液50ml，0.3mol/ml磷酸氢二铵溶液50ml。两者分别用氨水调节ph为11，将磷酸氢二铵溶液以1.2ml·min-1的速度滴加到硝酸钙溶液中，边滴加边搅拌，反应后溶液在85℃下搅拌12h。在25℃下，沉化12h。离心后反复水洗三次，80℃真空干燥，干燥24h，得到羟基磷灰石。
将10ml硅烷偶联剂分散于50ml乙醇中；将10g羟基磷灰石分散于60ml乙醇中；分别超声处理10min后，将上述两种溶液混合，然后再超声40min。超声完成后进行过滤处理，得到混合物。将混合物用乙醇洗涤，离心分离，先在80℃干燥2h，然后在100℃真空干燥24h，研磨，得样品，过200目筛，得到改性羟基磷灰石备用。
以冰醋酸为溶剂，配制浓度为0.05g/ml的改性羟基磷灰石分散液，然后按照改性羟基磷灰石和聚己内酯质量比为25:85的比例，将改性羟基磷灰石分散液与质量体积百分浓度为15％的聚己内酯冰醋酸溶液混合，采用流延法在基底上铺膜，湿膜厚度0.3mm，然后室温干燥25h，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
以3％(v/v)冰醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为0.03g/ml的壳聚糖溶液，采用流延法将壳聚糖溶液在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜表面上铺膜，湿膜厚度0.3mm，室温干燥25h后除去基底，得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜。
对比例1
将壳聚糖与1％(v/v)的冰醋酸水溶液混合，配制质量浓度为0.5％的壳聚糖溶液，在温度为40℃下搅拌，直至溶液澄清，在玻璃板上流延成膜，室温下干燥12h，得到壳聚糖膜。
对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜进行300倍电镜扫描，结果如图2～图5所示。其中，图2为改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的sem图，用pcl-ha表示，由图2测试结果可知，改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜中改性羟基磷灰石分散均匀，改性羟基磷灰石的粒径约为17μm；图3为壳聚糖膜，用cs表示，由图3测试结果可知，壳聚糖膜的表面平滑质密；图4为改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜在壳聚糖膜侧观察的300倍的电镜照片，图4中可以看到一部分改性羟基磷灰石隐约可见，这是部分改性羟基磷灰石嵌入在聚己内酯膜内；一部分改性羟基磷灰石较清晰，这是部分改性羟基磷灰石裸露在聚己内酯膜表面，改性羟基磷灰石表面都略显模糊，这是由于覆盖了一层壳聚糖的缘故；图5为改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的断面图，从图5中可以明显的看到不同膜成分出现的不同层结构。照片的下部分为壳聚糖膜，平整光滑，质地均匀；照片上部分为改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜，改性羟基磷灰石与聚己内酯交织在一起，改性羟基磷灰石粒径尺寸约为20μm，与改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的表面形貌尺寸基本相同。
对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜进行x射线衍射测试，结果如图6所示。
由图6测试结果可知，改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜在2θ为21.83°、24.55°处出现结晶峰，且峰形尖锐，表明具有良好的结晶行为；而壳聚糖膜基本为弥散峰，表明其结晶性很弱；改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜峰形与改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的峰形基本相同，但峰强度减弱，表明改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜与壳聚糖膜复合后，结晶度降低，的确得到了改性羟基磷灰石和壳聚糖的双层膜。
对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜进行红外光谱测试，结果如图7所示。
由图7测试结果可知，3416cm-1和1636cm-1为o-h的特征峰，在2942cm-1、2864cm-1、961cm-1附近的吸收峰为c-h的伸缩振动峰，在1180cm-1和1241cm-1附近的吸收峰为c-o-c的伸缩振动，谱图在波长1034cm-1、602cm-1、564cm-1、465cm-1为po3-4的特征吸收峰，证明产物中含有羟基磷灰石。
对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜进行dsc测试，结果如图8所示。
由图8测试结果可知，壳聚糖的熔融吸热峰在120.37℃，改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜熔融吸热峰在62.65℃，改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜有2个熔融吸热峰，分别出现在63.09℃和122.16℃，说明双层膜中改性羟基磷灰石和壳聚糖两物质并没有发生化学反应，而是以物理共混方式复合在一起，材料在60℃以下热性能稳定。可以在人体温度条件下正常应用。
对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜进行tg、dtg测试，图9为改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜的tg、dtg曲线；图10为壳聚糖膜的tg、dtg曲线；图11为改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的tg、dtg曲线。
由图9～图11测试结果可知，三种膜材料的热降解曲线基本为反s形，样品的热失重行为是相似的。比较它们的开始降解温度、降解速率最大时的温度、降解结束温度可知，改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的热降解温度均高于改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和壳聚糖膜。当质量损失分别为10％和50％时，壳聚糖膜的对应温度为93.53℃和328.09℃；改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜对应温度为284.51℃和386.69℃；改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的对应温度为232.20℃和390.44℃。可见，改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的热稳定性最好。
分别对实施例2～4得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜进行tg、dtg测试，结果显示，得到的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜均具有较好的热稳定性。
实施例4
对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜(pcl-ha膜)和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜(pcl-ha-cs复合膜)，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜(cs膜)进行骨细胞和软组织细胞的增殖与粘附测试。
软组织细胞的增殖与粘附实验：
取pcl-ha膜、cs膜、pcl-ha-cs复合膜各18片，剪成直径7mm圆片，膜两侧用紫外线消毒40min，然后用pbs缓冲液清洗3次，每次10min，吸干，放入96孔板中，其中pcl-ha-cs复合膜的cs面在上面，每孔分别加入培养基高糖dmem100μl浸泡2h，吸出培养基，取呈对数生长期的l929细胞用2.5g/l胰酶消化后，计数，每孔加入100μl含有3×103个l929细胞的培养液，4h后每孔再加入100μl的dmem培养液，在标准条件下培养，分别在培养1、3、5d各时间点，每组随机抽取6孔，吸除培养液，用pbs清洗3次，每孔加入5mg/ml的mtt20μl，放回孵箱继续孵育4h后终止培养，吸除上清液，每孔加入150μldmso，放回培养箱再孵育5min后取出。分别得到生长在pcl-ha膜、cs膜、pcl-ha-cs复合膜上的软组织细胞。
成骨细胞的增殖与粘附实验：
按照软组织细胞的增殖测试方法进行实验，区别在于将l929细胞替换为mc3t3-e1骨细胞，其中pcl-ha-cs复合膜的pcl-ha面在上面。分别得到生长在pcl-ha膜、cs膜、pcl-ha-cs复合膜上的成骨细胞。
骨细胞的增殖与粘附实验结果如图12～14所示，其中图12是在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜上培养的成骨细胞，图13是在壳聚糖膜上培养的成骨细胞，图14是在改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜表面培养的成骨细胞。
由图12～14可知，壳聚糖膜中可见成骨细胞数目相对较少，而改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜及双层膜的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜一侧的成骨细胞数目大体相同，表明本发明提供的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜与成骨细胞具有较好的增殖与粘附。
软组织细胞的增殖与粘附实验结果如图15～17所示，其中图15是在改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜上培养的软组织细胞，图16是在壳聚糖膜上培养的软组织细胞，图17是在改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的壳聚糖膜表面培养的软组织细胞。
由图15～17可知：改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜中软组织细胞数目相对较少，而壳聚糖膜及双层膜的壳聚糖膜一侧的软组织细胞数目大体相同，表明本发明提供的改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜与软组织细胞具有较好的增殖与粘附。
由以上实施例可知，本发明提供是改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜能够同时促进成骨细胞和软组织细胞的生长。
实施例5
本发明还对实施例1制备得到改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜，以及对比例1制备得到的壳聚糖膜的拉伸强度和断裂伸长率进行测试。测试结果如表1所示。
表1拉伸强度和断裂伸长率测试结果
由测试结果可知，本发明提供的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的断裂伸长率高于壳聚糖膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
由以上实施例可知，本发明提供的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜能够同时促进成骨细胞和软组织细胞的生长。而且，本发明提供的改性羟基磷灰石复合聚己内酯-壳聚糖双层膜的断裂伸长率高于壳聚糖膜和改性羟基磷灰石复合聚己内酯膜。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。