本发明涉及一种利用重组水泡性口炎病毒(vsv)构建预防猪流行性腹泻病毒疫苗。
背景技术
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病(pensaertetal.，1978)，pedv是一种动物冠状病毒，该病毒可致各年龄段猪感染，但仔猪发病率通常为100％，母猪为15％～90％，其中，该病毒对新生仔猪致死率可达50％以上，2011年以来，pedv在我国的大范围流行给养殖业造成了极大经济损失。pedv所致病程急，传播速度快，因此及时针对疫区和周边地区的猪群尤其是初生仔猪和待产母猪进行紧急预防接种，使之快速产生免疫保护力，对于控制疫情蔓延，降低仔猪死亡率极为关键。虽然pedv疫苗已在国内广泛应用，但是pedv在国内各地猪场的流行仍较普遍。
目前预防pedv所使用的商品化疫苗存在以下缺点：
1、主要为灭活疫苗，需多次接种动物，形成免疫保护力较慢，不适合在疫情出现时应急接种之用；
2、灭活苗的另一个缺点是无法有效激发宿主产生特异性ctl及粘膜免疫应答。利用pedv减毒活疫苗是克服这些困难的方法之一，但由于冠状病毒基因可在自然条件发生重组，因此难以保证其使用的安全性，欧美国家禁止使用减毒活疫苗预防pedv；
3、目前pedv的制备主要通过vero细胞体外培养获得，复制滴度较低(约106-107tcid50/ml)，细胞培养液需加入一定量的胰酶才能维持病毒体外扩增，这在一定程度上限制了该病毒的大规模制备。
鉴于现有疫苗存在的问题，急需研究新型的pedv疫苗。
重组水泡性口炎病毒(vsv)作为疫苗载体具有独特优势，已经得到很好应用。借助基因工程减毒病毒载体表达外源抗原是研制新型疫苗的一种有效方式，其中重组水泡性口炎病毒(vsv)已在人用应急疫苗研制和应用上取得突破，新近的报道表明，利用重组水泡性口炎病毒(vsv)为载体制备的ebola病毒应急疫苗，可在3-5天内激发灵长动物体内有效免疫保护力，免疫动物可经受住致死剂量病毒的攻击，该疫苗即将完成人体实验，投入临床应用。
vsv作为疫苗载体的主要优点包括：
1、许多研究证实，作为疫苗载体，vsv可以成为表达外源抗原蛋白，如hiv、埃博拉病毒(ebola)等的高效平台；
2、vsv复制周期短(约8小时复制一代)，易于培养，扩增病毒所用bhk21细胞可高密度悬浮培养，这为以vsv为平台制备的重组疫苗进行工业化、规模化生产提供了得天独厚的优势；
3、vsv重组疫苗除了可有效激发肌体产生全面的免疫应答，包括细胞免疫应答、体液免疫应答和粘膜免疫应答之外，还具有快速激发免疫应答的优点，如：以vsv为载体制备的ebola病毒应急疫苗，已证实可在接种灵长动物3-5天内激发免疫保护力。
鉴于vsv作为疫苗载体所具备的诸多优点，本申请拟利用其研制针对仔猪和成年猪的pedv应急免疫疫苗。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对目前pedv疫苗研制和应用存在的诸多问题，提供一种利用重组水泡性口炎病毒构建猪流行性腹泻病毒疫苗。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗，所述疫苗包括将pedv保护性抗原基因s或s蛋白上保护性多肽s1克隆到m蛋白发生突变的重组水泡性口炎病毒的基因组，并利用反式遗传技术构建得到的可用于预防pedv的重组病毒。
优选的，所述保护性抗原基因s克隆自2012年上海地区pedv地方毒株pedv/sh/2012。该病毒株是新发pedv的代表性毒株之一。
优选的，pedv/sh/2012s基因序列如seqidn0.1所示。
优选的，所述m蛋白发生突变的重组水泡性口炎病毒包括m蛋白第51位、第221位、第226位氨基酸位点中的一个或三个发生突变的重组水泡性口炎病毒突变体。
优选的，所述m蛋白发生突变的重组水泡性口炎病毒为重组水泡性口炎病毒vsvmt。
优选的，所述重组水泡性口炎病毒vsvmt是基质蛋白m三个不同氨基酸位点发生突变的重组病毒；所述基因蛋白m的第51位甲硫氨酸被敲除，第221位氨基酸-缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位氨基酸-甘氨酸突变为精氨酸。
优选的，所述疫苗为同时预防pedv和vsv感染的双价疫苗。
本发明还涉及一种本发明所述的猪流行性腹泻病毒疫苗的构建方法，所述方法包括如下步骤：
s1、利用rt-pcr得到pedvs和s1基因，基因片段用xhoi和nhei双酶切克隆至pvsvmt质粒多克隆位点，得到pvsvmt-s和pvsvmt-s1重组质粒；
s2、用表达t7rna聚合酶的痘病毒vtf7-3感染bhk-21细胞；同时制备包括质粒pbs-n、pbs-p、pbs-l及pvsvmt-s或pvsvmt-s1的质粒转染混合液；
s3、对质粒进行细胞共转染后，滤去痘病毒，将滤液加入到对数生长期的bhk-21细胞中，观察细胞病变；如果细胞出现病变，则收集细胞上清，利用rt-pcr进行病毒鉴定，正确则用vero细胞进行空斑纯化，经vsv重组病毒鉴定后得所述猪流行性腹泻病毒疫苗。
优选的，rt-pcr中扩增pedv/sh/2012病毒株s基因的引物对如序列seqidno.2、seqidno.3所示。
优选的，rt-pcr中扩增pedv/sh/2012病毒株s1基因的引物对如序列seqidno.4、seqidno.5所示。
本发明还涉及一种本发明所述的猪流行性腹泻病毒疫苗在新生仔猪的应急免疫中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明将pedv保护性抗原基因s或s蛋白上保护性多肽s1克隆到vsvmt，构建的疫苗包含各种t和b细胞表位，充分发挥vsv疫苗载体的功能；重要的是这样用vsv表达的pedvs蛋白保留了蛋白的跨膜区和胞内区段功能域，这样，s蛋白将可以嵌入vsv的囊膜中，从而构建出同时预防pedv和vsv感染的双价疫苗。
2、pedv所致病程急，传播速度快，因此及时针对疫区和周边地区的猪群尤其是初生仔猪和待产母猪进行紧急预防接种，使之在3-4天内快速产生免疫保护力，对于控制疫情蔓延，降低仔猪死亡率极为关键，利用vsv为载体研制的疫苗相较传统的pedv灭活疫苗和减毒活疫苗在此方面有独特优势，如vsv表达埃博拉病毒囊膜蛋白研制的疫苗可在灵长动物和人体内极快激发免疫保护力。本发明以vsv为载体表达pedv保护性抗原，可制备快速激发动物肌体免疫保护力的新型疫苗，用于应急免疫接种，这对于控制疫情，尤其对降低pedv感染仔猪所致高死亡率，减少经济损失极为关键。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为表达pedvs蛋白的重组水泡性口炎病毒结构示意图；其中，a为vsv病毒结构图；b为表达pedvs蛋白的重组水泡性口炎病毒(vsvmt-s)结构图；
图2为2012年上海地区流行毒株(pedv/sh/2012)的s蛋白结构示意图；图中，s1：pedvs1多肽；s2：pedvs2多肽；
图3为克隆pedvs或s1基因的重组vsv质粒的构建示意图；图中，n为核衣壳蛋白、p为磷酸化蛋白、m为基质蛋白(matrix)、g为囊膜蛋白、l为病毒rna复制酶、s为pedv纤突蛋白基因、s1为纤突蛋白s1多肽；vsvmt：matrix蛋白三位点突变的vsv病毒；vsvmt-s：表达pedv2012上海地方株保护性抗原s蛋白的重组vsv病毒；vsvmt-s1：表达pedv2012上海地方株s1多肽的vsv病毒；xhoi和nhei分别为限制性内切酶；
图4为表达pedv2012上海地方株保护性抗原s蛋白或s1多肽的的重组vsv病毒的挽救流程图；
图5为vsvmt-s病毒的鉴定示意图；其中，a为pedv康复血清western-blotting检测结果，图中1：pedv全病毒；2：vsvmt-s；3：vsvmt；4：大肠杆菌表达pedvn蛋白；5：未接病毒bhk21细胞上清液对照；b为vsv康复血清western-blotting检测结果，图中1：pedv全病毒；2：vsvmt-s；3：vsvmt；4：大肠杆菌表达pedvn蛋白；
图6为vsvmt-s1病毒的western-blotting鉴定示意图；图中1：大肠杆菌表达pedvn蛋白；2-6泳道：vsvmt-s1感染bhk21细胞0，4，8，12和24h的细胞上清；
图7为vsvmt-s复制特性的确定示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明方案的要点如下：
1.本发明所使用的疫苗载体(vsvmt)是由发明申请人首次构建成功，经过反复实验表明，它实现了弱化，是一个有很好应用前景的病毒载体。
利用基因工程技术，我们构建了一株新型重组水泡性口炎病毒(vsvmt)，该病毒基质蛋白(matrix，m)存在三个不同氨基酸位点突变，包括基质蛋白第51位甲硫氨酸被敲除，第221位缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位甘氨酸突变为精氨酸。猪体内、外生物学特性实验表明，该病毒致病性显著降低，并且能有效激发肌体产生保护性免疫应答反应，具有良好的应用前景。此外，通过在vsv基因组的g和l蛋白之间插入了一个多克隆位点(xhoi和nhei)，如图1所示，可用来克隆和表达外源性的蛋白基因尤其是大片段的基因。已有的研究结果表明，借助可表达外源性抗原的减毒vsv作为载体研制的疫苗可以全面、快速地激发动物免疫应答，尤其是细胞毒性t细胞反应(ctl)和粘膜免疫，这对于那些难以体外繁殖、高致病性的病毒而言，更有独特的意义。
2.将pedv保护性抗原基因s和s蛋白上保护性多肽s1克隆到vsvmt，利用该载体构建安全和有效的预防pedv新型疫苗。
纤突蛋白(s)是pedv的重要结构蛋白，负责病毒识别宿主细胞受体，可诱导中和保护性抗体；s1多肽是s蛋白的一个亚基，包含了s蛋白的保护性抗原表位。因此，在此次的申请中，我们将这两个抗原分别克隆到vsv基因组，新策略将使得构建的疫苗包含各种t和b细胞表位，充分发挥vsv疫苗载体的功能；重要的是这样用vsv表达的pedvs蛋白保留了蛋白的跨膜区和胞内区段功能域，这样，s蛋白将可以嵌入vsv的囊膜中，从而构建出同时预防pedv和vsv感染的双价疫苗，属于本领域技术人员预料不到的技术效果，如图1。由图1b可知，这个重组病毒的囊膜上将同时嵌入pedvs蛋白和vsv的g蛋白。
3.构建疫苗所用的保护性抗原基因s克隆自2012年上海地区pedv地方毒株(pedv/sh/2012)，该毒株具有较好的代表性
本发明的课题组前期从2012年上海地区流行毒株pedwsh/2012克隆了其纤突蛋白基因s(genbankaccessionnumberjx110659)，通过比对近年来各地流行毒株的相关序列，进行了系统进化分析，结果表明，pedv/sh/2012s蛋白氨基酸序列与国内2012年以来以及北美2013年所报道的pedv毒株序列高度同源(如图2所示)，而与目前广泛使用的疫苗毒株cv777则亲缘关系较远。经申请人对该s基因序列的测定表明，其编码的s蛋白包含1386个氨基酸(aminoacid，aa)，而s1多肽为789个氨基酸，见图2，pedv/sh/2012s基因全长序列(从起始密码子到终止密码子)，共4161个碱基，具体如seqidno.1所示。
4.应用于新生仔猪和成年猪的应急免疫是本发明的另一个创新点。
pedv主要致死2周龄内的哺乳期仔猪，国内使用的商品化pedv疫苗多为灭活疫苗，用于成年猪免疫预防接种，目前对新生仔猪还没有合适的pedv疫苗，此外，由于灭活疫苗需要多次反复接种方能产生有效的免疫应答，这通常需要数周乃至数月的时间，不利于在疫情暴发时对仔猪和怀孕母猪的紧急免疫接种，而以vsv为载体表达pedv保护性抗原，可制备快速激发动物肌体免疫保护力的新型疫苗，用于应急免疫接种，有利于控制疫情，降低仔猪死亡率。
此外，vsv易于培养，尤其扩增该病毒所用bhk21细胞可高密度悬浮培养，这为以vsv为平台制备的重组疫苗进行工业化、规模化生产提供了得天独厚的优势。
实施例
本实施例涉及一种利用重组水泡性口炎病毒构建猪流行性腹泻病毒疫苗；具体包括如下步骤：
1.1将pedv上海地区2012年流行病毒株的保护性抗原s1或s蛋白克隆至vsv病毒基因组
vsvmt基质蛋白的第51位甲硫氨酸被敲除，第221位氨基酸-缬氨酸突变为苯丙氨酸，第226位氨基酸-甘氨酸突变为精氨酸。
根据pedv/sh/2012s基因设计扩增s基因和s1基因的引物，如表1所示；再利用rt-pcr得到pedvs和s1基因，基因片段用xhoi和nhei双酶切克隆至pvsvmt质粒多克隆位点，得到pvsvmt-s和pvsvmt-s1重组质粒(重组vsv质粒的构建示意图如图3所示)。
表1.扩增pedv/sh/2012病毒株s基因和s1基因的引物
1.2表达pedv2012上海地方株保护性抗原s蛋白或s1多肽的的重组vsv病毒的挽救
按schnell等所述方法进行vsv病毒挽救，流程见图4。用表达t7rna聚合酶的痘病毒vtf7-3感染bhk-21细胞，接种量为moi＝5，孵育1h，同时制备质粒转染混合液，其中包括质粒pbs-n、pbs-p、pbs-l及pvsvmt-s或pvsvmt-s1，按invitrogen公司的lipofectamine2000所提供的转染方法对质粒进行细胞共转染。48h后吸取上清，用0.22μm的滤膜滤去痘病毒，将滤液加入到对数生长期的bhk-21细胞中，观察细胞病变，如果细胞出现病变，则收集细胞上清，利用rt-pcr进行病毒鉴定，正确则用vero细胞进行空斑纯化。
1.3vsv重组病毒鉴定
1.3.1vsvmt-s和vsvmt-s1病毒的western-blotting鉴定
将经空斑纯化后的vsv病毒接种bhk-21细胞24小时后，收集细胞上清并在10000rpm的转速下离心10min，收集上清，再将上清用hitachi超速离心机30000rpm超速离心1.5h，收集沉淀，用pbs重悬病毒，并用蛋白上样缓冲液处理，然后进行10％sds-page凝胶电泳，再将蛋白转移至pvdf膜，用5％的脱脂奶粉封闭两个小时，封闭完成后，用pbst洗涤三次，每次10min，然后在4℃下分别用pedv感染猪康复血清和pedv感染猪康复血清作为一抗孵育过夜，其中pedv感染猪康复血清按1∶500工作浓度稀释；而vsv感染小鼠康复血清用1∶1000工作浓度稀释。一抗孵育pvdf膜用pbst洗涤三次，每次10min，再用hrp标记兔抗猪igg做为二抗进行孵育2h，稀释度为1∶20000。pbst洗涤三次后，用ecl试剂盒进行显色，压片，检测目的蛋白。如下图5所示。结果显示pedv感染猪康复血清可检测到vsvmt-s表达的pedvs蛋白，如图5a箭头所示，而vsvmt病毒则未表达s蛋白，用vsv感染小鼠康复血清则可检测到vsv的各结构蛋白g，n/p和m蛋白，如图5b所示。同样，在vsvmt也可检测到vsv的各结构蛋白，这证明了vsvmt-s病毒构建正确，即本发明利用反式遗传技术所获得的重组vsv是pedvs蛋白嵌入vsv囊膜的新型病毒，此前均无报道。
1.3.2vsvmr-s1病毒的western-blotting鉴定
将经空斑纯化后的vsv病毒接种bhk-21细胞24小时后，收集细胞上清，如1.3.1部分的内容所述方法进行western-blotting鉴定，一抗为抗6×his标签的单克隆抗体，工作浓度为1∶1000；二抗为hrp标记兔抗鼠igg，工作浓度为1∶20000。图6为vsvmt-s1病毒的western-blotting鉴定；由图6可知，vsvmt-s1病毒感染宿主细胞可以有效表达pedvs1多肽，将这样的病毒注射动物后，将可有效诱导pedv中和保护性抗体。
1.4vsvmr-s复制特性的确定
以vsv-gfp为对照，在bhk21细胞中测定vsvmt-s的复制特性，采用的方法是一步生长曲线检测，即：将bhk21细胞铺于24孔板中，细胞密度为2×105个/孔，细胞生长过夜后，分别接种vsvmt-s和vsv-gfp，接种量为moi＝5，孵育1h后用pbs洗涤三次，并加入含10％胎牛血清的dmem培养基，分别在感染4、8、12、24和48h收集细胞上清，利用vero细胞进行的空斑实验定量病毒含量，从而明确病毒复制特性，如图7所示。具体为将bhk21细胞铺于24孔板中，密度为2×105个/孔，细胞生长过夜后，分别接种vsvmt-s和vsv-gfp，接种量为moi＝5，分别在感染4、8、12、24和48h收集细胞上清，利用vero细胞进行的空斑实验定量病毒含量。由图7可知，vsvmt-s病毒在宿主细胞内的扩增繁殖曲线显现出一个逐步上升的过程，在接种细胞后8小时左右到达其峰值，然后逐步下降，值得注意的是，表达pedvs蛋白基因的vsvmt-s病毒的最大复制滴度可＞106pfu/ml，这样的快速增值速度对于今后的生产是有较大裨益的。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。