鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物材料与组织工程
技术领域：
，特别涉及一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用。
背景技术：
胶原蛋白具有良好的生物活性，能够有效促进细胞生长，因此在生物医学领域有着广泛的应用，如用于制备组织工程支架等。胶原蛋白通常取自动物体，如表皮及蹄筋等，但是，由于使用陆生动物源胶原蛋白容易造成跨物种病毒感染，有可能导致患者感染口蹄疫、疯牛病等疾病，对人类社会造成危害，因此，欧美、日本等相继出台法规，限制哺乳动物皮骨中的提取物用于食品医药等对人体直接影响的产品中。而鱼鳞来源于海洋生物，较难对人体造成跨物种病毒感染，且鱼鳞含有大量胶原蛋白、来源广、价格低廉，鱼鳞胶原蛋白具有良好的细胞贴附性与生物相容性，可通过促进角质细胞、成纤维细胞增殖，促进pdgf、tgfβmrna表达及蛋白合成，提高m2型巨噬细胞含量，促进免疫低下小鼠伤口愈合，用于制备胶原蛋白骨组织工程支架，能够有效促进细胞增殖、降低生产成本。我国淡海水渔液资源十分丰富，鱼鳞作为水产加工废弃物，一直尚未得到充分利用，利用鱼鳞制备生物材料具有广阔的开发前景。全国每年骨缺损患者较多，骨损伤己成为影响人们健康和生活的严重社会问题。目前采用的治疗材料大多数还是传统的惰性生物材料或可降解生物材料制备的组织工程支架，存在着生物活性不足或降解性能不理想、治疗效果差等问题，只能用于修复简单临床病症，难以满足日益增长的临床治疗需求。研究与开发具有合理支架结构与生物活性的骨修复功能性生物材料，具有重要意义，也成为目前研究与开发的热点。cn1814781a公开了一种利用内肽酶和端肽酶从鱼鳞中提取无苦胶原肽的方法，包括采用鱼鳞作为主要原料，并利用内肽酶和端肽酶从鱼鳞中提取无苦鱼鳞胶原肽：经将鱼鳞粉碎过80～200目标准筛，按鱼鳞重量加入6～20倍的水搅拌均匀，将得到的混悬液控制温度为35℃～70℃，ph在6～10，按鱼鳞重量的0.5％～5％加入内肽酶酶解3～12小时，并灭酶；将酶解液降温至35～70℃时，按鱼鳞重量的0.1％～3％加入端肽酶酶解6～16小时，并灭酶；然后经过浓缩、干燥、粉碎得到无苦鱼鳞胶原肽粉末。cn104490732a公开了一种抗衰老鱼鳞胶原多肽面膜及其制备方法，含有以下成分：鱼鳞胶原多肽粉1～20重量份、红景天提取物0.5～3重量份、海藻提取物1～2重量份、甘油3～6重量份、橄榄油1～4重量份、珍珠粉1～3重量份、滑石粉10～30重量份、成膜剂10～30重量份、吐温80为1～2重量份、防腐剂0.10～1.2重量份，所得面膜具有滋养皮肤、美容养颜的作用。cn102327646a公开了一种鱼鳞衍生的组织修复结构，包含提供一个生物相容性佳以及生物可分解性的经适当步骤处理过鱼鳞以及其特殊的微孔道结构，且所述的特殊的微孔道结构有利于细胞的贴附与增生。cn104419741a公开了一种以鱼鳞为原料生产纳米级胶原肽精华的制备方法，包含如下步骤：鱼鳞经过超声波辅助酸处理技术脱灰；然后经过除杂、超声波技术结合酶提取技术提取胶原肽；进一步采用膜分离技术纯化胶原肽提取液；然后经过喷雾干燥技术干燥胶原肽溶液；再经过纳米粉碎机超细微粒化技术纳米化胶原肽，获得纳米级胶原肽产品。cn103588873a公开了一种鱼鳞胶原活性肽的制备方法，以鱼鳞明胶和糖类为原料，利用亚临界水设备处理鱼鳞明胶和糖的混合溶液，制备鱼鳞胶原活性肽溶液，再经过滤、浓缩、喷雾干燥得到鱼鳞胶原活性肽粉末。cn103570827a公开了一种促进提取鱼鳞胶原蛋白的方法，具体包括酸法、盐法、酶法和热水抽提法，该发明进一步用超声波作用，提高胶原蛋白的得率，缩短了提取时间。cn103992386a公开了一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法，该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为gly-pro-thr-gly-phe-pro-gly。cn103980360a公开了一种鱼鳞胶原蛋白的快速制备方法，按如下步骤进行：将鱼鳞去除杂质，清洗干净，晾干备用；将处理干净的鱼鳞放入耐高温玻璃瓶中，并按比例向瓶内加入乙酸溶液，包扎瓶口后放入压力容器中加压提取一段时间，然后进行过滤处理，滤液经浓缩、干燥后即得鱼鳞胶原蛋白。cn100381528c公开了一种未变性鱼鳞胶原的制备方法，其特点是将鱼鳞用5～15％的nacl溶液浸泡24～48小时，搅拌，过滤；用0.05～0.2m的naoh溶液浸泡24～48小时，搅拌，过滤；用15～50l的h202，naoh调节ph为8～12，浸泡24～36小时，蒸馏水浸洗，过滤；将鱼鳞用绞肉机绞碎，自然晾干；取绞碎鱼鳞100重量份，用0.1～2m的edta溶液1000～2000重量份浸泡24～48小时，微波炉输出功率200～400w，工作频率2450mhz，辐射10～20分钟，搅拌，过滤；加入蛋白酶1～5份，用酸调节ph为2～4，在温度为4～6℃浸泡1～3天，用离心机分离，除去滤渣，清液用0.5～5m的nacl溶液盐析，沉淀经离心分离，用0.05～2m的乙酸溶解；如此反复盐析操作3～5次，再经膜透析处理3次，获得浓度为0.5～1％的未变性鱼鳞胶原溶液。cn101307348b公开了一种从淡水鱼鱼鳞中制备未变性胶原蛋白的方法，具体步骤为：1)将洗净的鱼鳞加入蒸馏水，用电动搅拌器间歇搅拌3～5分钟，蒸馏水洗至表面无色素和脂肪等附着；自然风干或低温干燥后粉碎至40～50目；2)将1)的材料按1∶10～1∶20加入为8～10％柠檬酸、苹果酸溶液，冰水浴微波处理2min，10～20℃脱钙8～24h，过滤，滤液置10℃以下静置5～10h，得柠檬酸钙沉淀；3)向经步骤2)处理后所得的脱钙鱼鳞中按1∶5至1∶20比例加入1％的苹果酸或柠檬酸溶液(含蛋白酶)于0～20℃搅提取2～4次，每次12～48h，离心，取上清，加nacl至终浓度为0.7～0.90mol/l，盐析过夜，离心，沉淀用0.50mol/l乙酸溶解，重复盐析和溶解操作1次，将沉淀透析，冷冻干燥得本发明的产品。cn102965030b公开了一种高凝胶强度鱼鳞明胶的制备方法，它以鱼鳞废弃物中制备的鱼鳞明胶为对象，通过硫酸铵盐析法，制备出高凝胶强度的鱼鳞明胶产品。cn100485043c公开了一种鱼鳞胶原蛋白及其制造方法，包含下列步骤：(a)将鱼鳞原料洗净后加热处理；(b)将加热处理后的鱼鳞原料以机械破碎处理；(c)经步骤(b)细碎后的鱼鳞原料添加蛋白质水解酶，并于温水下进行酶处理；(d)将经步骤(c)酶处理后的水解液离心；(e)取出经步骤(d)离心过后的上层液；及(f)将步骤(e)所得的上层液干燥成粉末。cn103271217b公开了一种罗非鱼鱼皮及鱼鳞提取鱼胶原蛋白粉的生产方法。其特征在于：是一种纯鱼胶原蛋白粉末，是以新鲜罗非鱼鱼皮和鱼鳞为原料，采用酸泡、冻干、生物酶解、过滤和喷雾干燥等工艺提取而成，完整保留了有效成分的生物活性。cn103352066a本发明公开了一种鱼鳞、鱼皮胶原活性肽的生产工艺，包括如下步骤：(1)预处理鱼鳞、鱼皮；(2)酸提法和热提法相结合提取胶原多肽，提取产率超过95％；(3)纯化胶原多肽提取液；(4)浓缩胶原多肽溶液；(5)酶法制备胶原活性肽溶液；(6)该溶液干燥得到总氮含量大于14％、相对分子质量小于10kd的胶原活性肽粉成品。从以上的发明来看，首先提取鱼鳞胶原蛋白的步骤比较多、比较繁杂、生产成本较高；其二，获得的鱼鳞胶原蛋白很少用于生物材料，特别是用于组织工程骨修复材料。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法。本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架。本发明的又一目的在于提供所述鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：(1)将粉碎后的鱼鳞放入到氯化钠溶液中，于10～20℃条件下浸泡2～5小时，然后将浸泡后的鱼鳞取出并用水清洗干净，得到处理后的鱼鳞a；(2)将步骤(1)中处理后的鱼鳞a放入到乙二胺四乙酸溶液中，于10～20℃条件下浸泡3～6小时，然后将浸泡后的鱼鳞取出并用水清洗干净，得到处理后的鱼鳞b；(3)将步骤(2)中处理后的鱼鳞b浸泡于柠檬酸溶液中，并加入蛋白酶进行提取，得到混合溶液c；(4)将步骤(3)中得到的混合溶液c的ph值调整为11～12，然后放置6～8小时，再用透析袋进行透析，得到鱼鳞胶原蛋白溶液；(5)向步骤(4)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液中加入海藻酸钠溶液，混合均匀后进行冷冻干燥，得到鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架。步骤(1)中所述的鱼鳞优选为草鱼鱼鳞和鳙鱼鱼鳞中的至少一种。步骤(1)中所述的粉碎为采用粉碎机进行粉碎。步骤(1)中所述的粉碎的鱼鳞的粒径大小为20～50微米。步骤(1)中所述的氯化钠溶液的浓度优选为0.05～0.5mol/l。步骤(1)中所述的氯化钠溶液与鱼鳞的质量比优选为10～20：1。步骤(1)和(2)中所述的水优选为蒸馏水。步骤(2)中所述的乙二胺四乙酸溶液的浓度优选为0.1～0.5mol/l。步骤(2)中所述的乙二胺四乙酸溶液与鱼鳞a的质量比优选为30～50：1。步骤(3)中所述的柠檬酸溶液的浓度优选为质量百分比3％。步骤(3)中所述的柠檬酸溶液与鱼鳞b的质量比优选为10～20：1。步骤(3)中所述的蛋白酶优选为胃蛋白酶。步骤(3)中所述的蛋白酶的添加量为按蛋白酶占鱼鳞b质量的7％计算。步骤(3)中所述的加入蛋白酶进行提取的时间为6小时以上；优选为6～8小时。步骤(4)中所述的透析袋优选为截留分子量为3000的透析袋。步骤(4)中所述的透析袋中的透析液优选为ph值为11～12的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。步骤(4)中所述的透析的时间优选为12～20小时。所述的鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，还包括将步骤(4)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液配制成浓度为20～30μg/ml的鱼鳞胶原蛋白溶液的步骤。步骤(5)中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液的浓度优选为20～30μg/ml。步骤(5)中所述的海藻酸钠溶液的浓度优选为质量百分比4％。步骤(5)中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:1～4。一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架，通过上述任一项所述的方法制备得到。所述的鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架中鱼鳞胶原蛋白的分子量为3000～10000。所述的鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架在生物医学领域中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明对鱼鳞进行加工和提取，获得鱼鳞胶原蛋白溶液，是一种具有生物活性的天然材料，具有良好的成骨性能，促进细胞生长，与海藻酸钠复合后可应用于骨组织工程支架的制备，可制备出具有良好力学性能和成骨性能的骨组织工程支架。(2)本发明从鱼鳞中提取胶原蛋白，改变了胶原蛋白来源不足的现状，提供一种非陆生、非哺乳类动物的胶原蛋白提取方法，避免陆生动物源胶原蛋白引起跨物种病毒感染的危害，并将其应用于骨组织工程支架的制备当中，为作为水产加工废弃物的鱼鳞提供一种充分利用的方法。(3)本发明制备的骨组织工程支架具有良好的细胞贴附性与生物相容性，能够有效促进角质细胞、成纤维细胞增殖，促进pdgf、tgfβmrna表达及蛋白合成，有效促进矿化，并且具有良好的生物可降解性能，同时制作步骤简单，生产成本低。附图说明图1为本发明获得的鱼鳞胶原蛋白溶液的实物图。图2为本发明的鱼鳞胶原蛋白溶液的紫外光谱图。图3为本发明的骨组织工程支架的实物图；其中，图a为图实施例2中的骨组织工程支架的实物图；b为实施例3中骨组织工程支架的实物图图；c为实施例1中骨组织工程支架的实物图。图4为本发明的骨组织工程支架的红外光谱图。图5为本发明的骨组织工程支架的表面扫描电镜图。图6为本发明的骨组织工程支架体外矿化15天后的扫描电镜图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的各原料以及试剂，除特别指出的以外，均可由市售获得。实施例1一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架，包括以下步骤：(1)称一定量的鳙鱼鱼鳞(来源于广州某菜市场)，清洗干净后，放入粉碎机粉碎，其粒径大小为20～50微米；(2)将步骤(1)中粉碎的鱼鳞浸泡于20倍质量的0.05m氯化钠溶液中2小时，温度为20℃；然后将鱼鳞取出，用蒸馏水洗涤干净；(3)将步骤(2)中处理过的鱼鳞浸泡于30倍质量的0.1m乙二胺四乙酸溶液6小时，温度为20℃；然后将鱼鳞取出，用蒸馏水洗涤干净；(4)将步骤(3)中处理过的鱼鳞浸泡于10倍质量的3wt％柠檬酸溶液并加入质量为鱼鳞7wt％的胃蛋白酶进行提取8小时，温度为室温；(5)将步骤(4)中得到的溶液ph值调节到12，在室温条件下，放置6小时；再用3000分子量透析袋透析20小时(透析液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，ph值为11～12)，得到鱼鳞胶原蛋白溶液；(6)将步骤(5)中透析后得到的鱼鳞胶原蛋白溶液配制(加入磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，ph值为11～12)为浓度20μg/ml的溶液；(7)将步骤(6)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液和4wt％海藻酸钠按体积比1:1的比例混合均匀，倒进模具后进行冷冻干燥(-80℃，24h)，得到骨组织工程支架，实物如图3所示，红外光谱如图4所示。实施例2一种海藻酸钠/鱼鳞胶原蛋白复合多孔骨组织工程支架，包括以下步骤：(1)称一定量的草鱼鱼鳞(来源于广州某菜市场)，清洗干净后，放入粉碎机粉碎，其粒径大小为20～50微米；(2)将步骤(1)中粉碎的鱼鳞浸泡于10倍以上质量的0.5m氯化钠溶液中5小时，温度为10℃；然后将鱼鳞取出，用蒸馏水洗涤干净；(3)将步骤(2)中处理过的鱼鳞浸泡于50倍以上质量的0.5m乙二胺四乙酸溶液3小时，温度为10℃；然后将鱼鳞取出，用蒸馏水洗涤干净；(4)将步骤(3)中处理过的鱼鳞浸泡于20倍质量的3wt％柠檬酸溶液并加入质量为鱼鳞7wt％以上的胃蛋白酶进行提取6小时以上，温度为室温。(5)将步骤(4)中得到的溶液ph值调节到11，在室温条件下，放置7小时；再用3000分子量透析袋透析12小时(透析液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，ph值为11～12)，得到鱼鳞胶原蛋白溶液；(6)将步骤(5)中透析后得到的鱼鳞胶原蛋白溶液配制(加入磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，ph值为11～12)为浓度30μg/ml的溶液；(7)将步骤(6)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液和4wt％海藻酸钠按体积比1:4的比例混合均匀，倒进模具后进行冷冻干燥(-80℃，24h)，得到骨组织工程支架，实物如图3所示，红外光谱如图4所示。实施例3一种海藻酸钠/鱼鳞胶原蛋白复合多孔骨组织工程支架，包括以下步骤：(1)称一定量的草鱼鱼鳞(来源于广州某菜市场)，清洗干净后，放入粉碎机粉碎，其粒径大小为20～50微米；(2)将步骤(1)中粉碎的鱼鳞浸泡于15倍以上质量的0.1m氯化钠溶液中3小时，温度为15℃；然后将鱼鳞取出，用蒸馏水洗涤干净；(3)将步骤(2)中处理过的鱼鳞浸泡于40倍以上质量的0.3m乙二胺四乙酸溶液5小时，温度为15℃；然后将鱼鳞取出，用蒸馏水洗涤干净；(4)将步骤(3)中处理过的鱼鳞浸泡于15倍质量的3wt％柠檬酸溶液并加入质量为鱼鳞7wt％以上的胃蛋白酶进行提取6小时以上，温度为室温。(5)将步骤(4)中得到的溶液ph值调节到11，在室温条件下，放置8小时；再用3000分子量透析袋透析12小时(透析液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，ph值为11～12)，得到鱼鳞胶原蛋白溶液，实物如图1所示，紫外光谱如图2所示；(6)将步骤(5)中透析后得到的鱼鳞胶原蛋白溶液配制(加入透析液为磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液，ph值为11～12)为浓度25μg/ml的溶液；(7)将步骤(6)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液和4wt％海藻酸钠按体积比1:2的比例混合均匀，倒进模具后进行冷冻干燥(-80℃，24h)，得到骨组织工程支架，实物如图3所示，红外光谱如图4所示，微观结构如图5所示，体外矿化效果如图6所示。效果实施例将实施例1～3制得的海藻酸钠/鱼鳞胶原蛋白复合多孔骨组织工程支架进行如下试验：(1)测试骨组织工程支架的外降解第15天的降解率，具体步骤如下：采用的磷酸盐缓冲溶液为体外降解用溶液，缓冲溶液ph＝7.4，样品分成数批分别浸于缓冲溶液中，置于恒温振荡器中，恒温37℃、转速120rpm，并于第15天取样，干燥恒重后称重，并计算出降解率。其中，mo为降解前的样品质量；m为降解后的样品质量。结果如表1所示，从表1可看出本发明制得的骨组织工程支架具有降解性能，且各实施例的降解效果相近。表1本发明的骨组织工程支架体外降解第15天的降解率鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠的体积比第15天降解率(％)1:127.91:227.81:428.9(2)骨组织工程支架的压缩模量的检测，具体步骤如下：分别把样品(实施例1～3制得的骨组织工程支架)做成半径约10mm、高约6.5mm的圆柱，记录各样品的厚度和半径，利用万能材料力学试验机以0.1mm/s的加载速度，对样品的力学性能进行测试，根据测试数据计算各组样品的压缩模量。结果如表2所示，从表2中可以看出，本发明制得的骨组织工程支架的压缩模量与人体股骨中段皮质骨相近。表2为本发明的骨组织工程支架的压缩模量检测结果。鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠的体积比压缩模量(mpa)1:11.71:20.961:40.72(3)骨组织工程支架体外细胞毒性检测，具体步骤如下：取生长状态良好的贴壁3t3细胞(购于bncc)，用pbs清洗两次，加入适量胰酶进行消化。将细胞吹打成均匀的细胞悬液，后吸入离心管中，离心后去除上清液，细胞计数后配制密度为10000/ml的细胞悬液。取96孔培养板，每孔加入100μl的细胞悬浮液培养24小时。按mtt试剂盒(购于南京建成生物工程研究所)说明书，孔内分别加入10μl的空白对照液、阴性对照液、阳性对照液和各样品浸提液(将实施例1～3制得的骨组织工程支架分别浸泡在培养液(dmem高糖液体培养基，hyclone公司)里，37℃条件下浸泡24小时得到样品浸提液)。每组设3孔，培养24小时，在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待时间培养过后，每孔加入50μlmtt溶液孵育4小时。终止培养后，把移液枪调至150μl抽出孔内液体，再每孔加入150μldmso(二甲基亚砜)，振荡1分钟，使结晶物充分溶解，用酶标仪测定在570nm处的吸光度，并计算细胞存活率：其中，a为样品组吸光度；ao为空白对照组吸光度；ab为阴性对照组吸光度。结果如表3所示，从表3中可以看出，本发明制得的骨组织工程支架细胞毒性符合作为医疗器械使用的要求。表3为本发明的骨组织工程支架体外细胞毒性检测结果。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12