一种具有降低心脏肌酸激酶同工酶含量功能的复方组合物及其应用的制作方法

本发明涉及一种具有治疗酒精性心肌病作用的中药有效部位的组合物，即复方组合物在预防或治疗酒精性心肌病药物中的应用。(二)
背景技术：
：酒精性心肌病(alcoholiccardiomyopathy，acm)是目前心血管领域中日益增长多的疾病，由于长期饮酒导致心肌变性，表现为心脏扩大和心功能不全的一种心肌病，本病的发病与长期大量的酒精摄入有密切关系，具有典型扩张型心肌病的血流动力学变化、症状、体征及影像学所见。酒精性心肌病是由于乙醇及其代谢产物乙醛等对心肌直接毒害的结果。酒精对心肌细胞的直接毒性作用主要表现在以下几方面：①损害心肌细胞膜的完整性；②影响细胞器功能；③影响心肌细胞离子的通透性；④酒精代谢时引起中间代谢的改变；⑤长期饮酒可变更调节蛋白(肌凝蛋白和原肌凝蛋白)的结构，影响心肌舒缩功能；⑥长期大量饮酒还可造成人体营养失调，易导致维生素缺乏，尤其是b族维生素缺乏，也可加重心功能不全。此外，酒类的某些添加剂中含有钴、铅等有毒物质，长期饮用可引起中毒或心肌损伤。由于上述原因的相互作用和影响最终可导致酒精性心肌病的发生。二氢杨梅素为葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中的主要活性成分黄酮类化合物，此类物质具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、消炎等多种奇特功效；二氢杨梅素目前研究主要体现在肝脏相关疾病。在解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌的发病率、抗高血压、抑制体外血小板聚集和体内血栓的形成、降低血脂和血糖水平，提高sod活性以及保肝护肝等方面具有特殊功效。在抗氧化方面，二氢杨梅素有显著的效果,能明显抑制大鼠心肌、肝和脑组织匀浆中丙二醛(mda)的生成,并随二氢杨梅素浓度增加而抑制mda生成的作用增加，二氢杨梅素能明显抑制油脂中mda的生成,随二氢杨梅素纯度(60％～90％)增加抗氧化作用增强。熊果酸(ursolicacid，复方)又称乌索酸、乌苏酸，是从杜鹃花科常绿蔓生灌木熊果中提取的一种五环三萜类化合物，具有特殊的气味，在无水乙醇中得大而有光泽的棱晶，而在稀乙醇中得细得像毛似的针晶。现有研究表明：熊果酸具有抗肿瘤，抗血管生成作用和增强免疫功能作用；熊果酸能明显抑制hl-60细胞增殖，可诱导其凋亡；能使小鼠的巨噬细胞吞噬功能显著提高。说明熊果酸的抗肿瘤作用广泛，极有可能成为低毒有效的新型抗癌药物。姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分，是植物界很稀少的具有二酮的色素，为二酮类化合物。姜黄素为橙黄色结晶粉末，不溶于水，近年的研究不仅证明了姜黄的传统作用，而且还揭示出一些新的药理作用，如抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗人类免疫缺陷病毒、保护肝脏和肾脏、抗纤维化以及防癌抗癌等作用，可能与其抑制核因子-κb和激活蛋白-1等转录因子的激活及表达有关，而且无明显的毒副作用。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种复方组合物在制备预防或治疗酒精性心肌病药物中的应用，复方成分为二氢杨梅素，熊果酸，姜黄素。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种具有降低心脏肌酸激酶同工酶含量功能的复方组合物，所述复方组合物由如下重量配比的原料组成：二氢杨梅素1-50份，熊果酸1-250份，姜黄素1-50份，更优选二氢杨梅素1-15份，熊果酸4-40份，姜黄素1-15份。进一步，优选所述复方组合物由如下重量配比的原料组成：二氢杨梅素15份，熊果酸250份，姜黄素15份。进一步，优选所述复方组合物由如下重量配比的原料组成：二氢杨梅素1份，熊果酸4份，姜黄素1份。本发明还提供一种所述复方组合物在制备预防或治疗酒精性心肌病药物中的应用。本发明二氢杨梅素，熊果酸，姜黄素的结构式分别为：二氢杨梅素熊果酸姜黄素本发明中复方组合物主要是恢复了心脏射血能力，减轻了心脏损伤情况，降低心脏肌酸激酶同工酶(ck-mb)的含量。本发明的有益效果主要体现在：本发明复方组合物将酒精性心肌病模型中血浆ck-mb含量降低了46.86％(图9)，恢复了酒精性心肌病中心脏射血能力及减轻心肌肥大，显著降低由酒精性心肌病模型引起的心肌损伤。目前酒精性心肌病的临床表现常伴随心脏扩大和充血性心力衰竭，其中以左心室衰竭为主。复方能有效恢复左心室后壁厚度增加及心肌损伤，因此复方有效的恢复了酒精饮食模型所引起的心脏损伤情况。(四)附图说明图1为实施例1复方组合物及复方中单体化合物对酒精诱导的心肌细胞损伤中乳酸脱氢酶(ldh)(a)和肌酸激酶同工酶(ck-mb)(b)的影响，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05。图2为实施例2中复方组合物及复方中单体化合物两两组合对酒精诱导的心肌细胞损伤中乳酸脱氢酶(ldh)(a)和肌酸激酶同工酶(ck-mb)(b)的影响，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05。图3为实施例3复方组合物及复方组合物替换后对酒精诱导的心肌细胞损伤中乳酸脱氢酶(ldh)(a)和肌酸激酶同工酶(ck-mb)(b)的影响，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05。图4为本发明酒精性心肌病模型建立过程进食量曲线图。图5为本发明酒精性心肌病模型建立过程进食总量柱形图。图6为本发明复方组合物对小鼠血浆中乳酸脱氢酶(ldh)的影响。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图7为本发明复方组合物对小鼠血浆中肌酸激酶同工酶(ck-mb)的影响。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图8为本发明复方组合物对小鼠左心室射血分数的变化。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图9为本发明复方组合物对小鼠左心室短轴缩短率的变化。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图10为本发明复方组合物对小鼠心脏中舒张期左心室后壁厚度的影响。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图11为本发明复方组合物对小鼠心脏中收缩期左心室后壁厚度的影响。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图12为本发明复方组合物对小鼠的心脏重量的影响。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图13为本发明复方组合物对小鼠的心脏与体重比值的影响。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。图14为本发明实例中各组小鼠心脏tunnel染色的。(图中，与对照组比较，#p<0.05；与酒精组比较，*p<0.05)。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例11、材料：试剂：熊果酸；二氢杨梅素；姜黄素；无水乙醇；ldh检测试剂盒，ckmb检测试剂盒。2、细胞株及培养基：h9c2心肌细胞，购自atcc。fbs(biologicalindustries)。dmem高糖培养液(吉诺生物医药技术有限公司)，无水乙醇。3、实验方法本次实验分为6组，对照组(ut)、酒精模型组(酒精组)、+酒精组(熊果酸)、二氢杨梅素+酒精组(二氢杨梅素)、姜黄素+酒精组(姜黄素)、复方+酒精组(复方)。将h9c2细胞接种至含10％fbs的dmem高糖培养液的24孔板中，每孔1*105个细胞，37℃培养24h后，吸弃上清，向每组培养孔中加入含不同药物的10％fbs+dmem高糖培养液1ml，37℃培养2h后，再向每组培养孔中加入终浓度为200mm无水乙醇继续37℃培养12h，取培养液离心，取上清用乳酸脱氢酶(ldh)测定试剂盒和心肌同工酶ckmb试剂盒测定乳酸脱氢酶(ldh)和肌酸激酶同工酶(ck-mb)活力，方法按照试剂盒说明书。各组药物在培养液中剂量终浓度(均用dmso配制)：熊果酸(40μm)；二氢杨梅素(15μm)；姜黄素(15μm)，复方(熊果酸40μm+二氢杨梅素15μm+姜黄素15μm)，对照组加等量双蒸水，酒精模型组加入等量的dmso。4、实验结果：结果见图1所示，为复方药物与其内成分效用对比，复方能有效降低由乙醇诱导的细胞损伤释放的乳酸脱氢酶(图1中a)以及肌酸激酶同工酶ckmb(图1中b)，效果较熊果酸、二氢杨梅素和姜黄素更为显著。因此本复方能有效的保护乙醇诱导的心肌细胞损伤。实施例2将实施例1中分组及各药物用量改为6组，对照组(ut)、酒精模型组(酒精)、二氢杨梅素+熊果酸+酒精组(二氢杨梅素15μm+熊果酸40μm)、二氢杨梅素+姜黄素+酒精组(二氢杨梅素15μm+姜黄素15μm)、姜黄素+熊果酸+酒精组(姜黄素15μm+熊果酸40μm)、二氢杨梅素+熊果酸+姜黄素+酒精组(二氢杨梅素15μm+熊果酸15μm+姜黄素15μm)。其他操作同实施例1，结果见图2所示。图2表明，复方三种化合物共同作用能有效降低由乙醇诱导的细胞损伤释放的乳酸脱氢酶(图2中a)以及肌酸激酶同工酶ckmb(图2中b)，效果较其中两种单体化合物更为显著。因此本复方能有效的保护乙醇诱导的心肌细胞损伤。实施例3将实施例1中分组及药物浓度改为：对照组(ut)、酒精模型组(酒精)、黄连素+二氢杨梅素+熊果酸+酒精组(黄连素20μm+二氢杨梅素15μm+熊果酸40μm)、黄连素+二氢杨梅素+姜黄素+酒精组(黄连素20μm+二氢杨梅素15μm+姜黄素15μm)、黄连素+姜黄素+熊果酸+酒精组(黄连素20μm+姜黄素15μm+熊果酸40μm)、二氢杨梅素+熊果酸+姜黄素+酒精组(二氢杨梅素15μm+熊果酸40μm+姜黄素15μm)。其他操作同实施例1，结果见图3所示。图3表明，其中黄连素在目前报道中具有保护心肌损伤的功效，因此本次实验对比在替换复方中单体化合物成分对心肌细胞保护的影响，结果表明黄连素并不能代替复方中化合物而起的相同的疗效。结果表明二氢杨梅素+熊果酸+姜黄素三种化合物共同作用能有效降低由乙醇诱导的细胞损伤释放的乳酸脱氢酶以及肌酸激酶同工酶ckmb，效果较其中两种单体化合物更为显著。因此本复方能有效的保护乙醇诱导的心肌细胞损伤。结果表明黄连素并不能代替复方中化合物而起的相同的疗效。实施例41、材料：实验动物：c57bl/6雄性小鼠30只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，公司许可证编号：scxk(沪)2017-0005，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，spf环境中。试剂：熊果酸；二氢杨梅素；姜黄素；lieber-decarli酒精液体模型饲料(产品代码tp-4030b，南通特洛菲饲料科技有限公司)；lieber-decarli对照液体饲料(产品代码tp-4030bc，南通特洛菲饲料科技有限公司)；胆碱，复合维生素(南通特洛菲饲料科技有限公司)；无水乙醇(cas-no：64-17-5，lichrosolv)；肌酸激酶同工酶(lot:n28018610，cusabio)。2、方法：c57bl/6小鼠于spf级别动物实验室进行适应喂养后，对8周龄的c57bl/6小鼠随机分为3组，每组10只，分别为对照液体饲料组(pf组)，酒精液体饲料组(af组)，酒精液体饲料+复方组(af+复方组)。pf组用lieber-decarli对照液体饲料喂养4周，期间根据af组lieber-decarli酒精液体模型饲料摄入量调整pf组对照液体饲料的体积；af和af+复方组第1-3天给予lieber-decarli对照液体饲料，第4-5天给予5.5％热量比酒精液体饲料，第6-7天给予11％热量比酒精液体饲料，第二周给予22％热量比酒精液体饲料，第三周27％热量比酒精液体饲料，第四周32％热量比酒精液体饲料，af+复方组每日酒精液体饲料中加入复方组合物，复方组合物剂量：二氢杨梅素150mg/l，姜黄素150mg/l，熊果酸2.5g/l。小鼠所食用的液体饲料每日17：00更换为新配置饲料，每周记录小鼠的体重，检测变化，4周后酒精性心肌病模型造模成功，小鼠使用10％水合氯醛腹腔注射进行麻醉，心尖取血测定肌酸激酶同工酶(ck-mb)，取小鼠心脏部分组织用4％多聚甲醛固定，用于tunnel染色。3、饲料配方(1)pf组小鼠所使用对照液体饲料配制方法：表1：对照组小鼠所食用液体饲料配方(1l)lieber-decarli对照液体饲料(g)胆碱(g)复合维生素(g)218.800.532.5加水600ml左右，搅拌完全溶解后，加水定容至1l。(2)不同酒精浓度液体饲料的配制：以配制1l液体为例，表2：实验组小鼠所食用液体饲料配方(1l)加水600ml左右，搅拌完全溶解后，加水定容至1l。4、实验结果：图4为小鼠每日进食量汇总，由于小鼠长期摄入酒精会对小鼠本身造成影响，随着酒精浓度的提高(即酒精热量比的增加)会使小鼠摄入饲料量减少，实验中所配制lieber-decarli的液体饲料中对照饲料和酒精饲料在等体积的条件下其卡路里相同，因此本次实验确保各组小鼠每日摄入饲料量大致相同。图5为小鼠总进食量，其中pf组，af组，af+复方组小鼠总进食量无明显差异，即本次实验保证了各组小鼠所摄入的能量大致相同，明确了本次实验后续相关实验指标组间差异与小鼠所摄入液体饲料量无关。图6的结果表明，长期饮酒的小鼠血清中乳酸脱氢酶(ldh)含量较对照组小鼠明显升高，酒精组(af组)有明显的心肌损伤，即说明长期饮酒会引起心肌损伤，而af+复方组能显著降低ldh的含量，有效的减轻心肌损伤。因此复方组合物可以显著降低酒精摄入所引起的ldh升高。图7的结果表明，长期饮酒的小鼠血清中肌酸激酶同工酶(ck-mb)含量较对照组小鼠明显升高，酒精组(af组)有明显的心肌损伤，即说明长期饮酒会引起心肌损伤，而af+复方组能显著降低ck-mb的含量，有效的减轻心肌损伤。因此复方组合物可以显著降低酒精摄入所引起的ck-mb升高。图8和9可以看出酒精组(af)小鼠心脏左室射血分数和左心室短轴缩短率相对于对照组(pf)明显降低，而af+复方组小鼠其心脏左室射血分数和左心室短轴缩短率相对于af组显著升高，所以判断af组小鼠心肌能力受损，心脏射血能力下降，而复方组合物能有效的恢复小鼠心肌射血能力。图10和11为舒张期和收缩期左心室后壁厚度，可以看出酒精组(af)小鼠心脏左心室后壁厚度对于对照组(pf)明显增加，而af+复方小鼠心脏左心室后壁厚度与对照组(pf)无明显差异，所以判断复方能有效的减少小鼠酒精引起的左心室壁厚度的增加，避免长期酒精摄入引起的心肌肥大症状。图12和13为小鼠心脏的重量和心脏与体积的比值，可以看出酒精组(af)小鼠心脏重量增加，心脏和体重比值较高，而af+复方组心脏重量及心体比值显著降低，恢复了心肌肥大的病症。图14为小鼠心脏tunnel染色结果，放大倍数(200×)，酒精组(af)组的心肌细胞较对照组(pf)组有明显的细胞凋亡(染棕色的部分为凋亡小体)，af组凋亡小体约为pf组2.2倍，af+复方组凋亡小体明显较af组减少，仅为pf组的1.2倍。通过tunnel染色分析长期饮酒对小鼠心肌细胞凋亡的影响，表明复方组合物能有效减轻心肌损伤情况。5、优点和效果：本发明复方组合物能有效的保护由酒精引起的心肌损伤，改善酒精诱导的酒精性心肌病。当前第1页12