本发明涉及纳米硒药物制备领域，具体涉及一种白藜芦醇纳米硒药物及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔兹海默症（ad）是常见的神经退行性疾病，临床表现主要为记忆功能和认知能力的衰退。在中国，随着人口老龄化问题的日益加剧，ad的发病趋势也显著增加。由于ad病情的严重性极大地影响了患者及家人的生活质量，因此，ad药物的研制是十分必需且紧迫的。ad的主要病理特征是在脑部发现淀粉样斑块及神经元细胞内出现纤维缠结。其中，淀粉样斑块是一个行之有效的ad神经病理学标志。aβ多肽是构成淀粉样斑块的主要成分。虽然，目前ad的致病机理还不明确，但淀粉样沉积假说被视为ad发病机理的核心假说。该假说认为，aβ聚集形成的纤维及其各种形式的聚集体可引发ad患者脑部的一系列病变，如突触损伤、炎症及神经细胞死亡等。另一方面，聚集的aβ是活性氧及活性氮自由基产生的促进剂。神经系统是耗氧量较高的器官，在老年脑中，由于氧气大量损耗及低的抗氧化水平，大量活性氧自由基的出现导致患者脑部氧化应激的出现。活性氧可造成细胞膜上的脂质氧化，dna损伤及蛋白质的氧化等。因此抑制aβ多肽自发聚集同时清除活性氧对ad的治疗具有非常重要的意义。
植物多酚类物质是高等植物的次级代谢产物。目前已证实多酚具有多种生物功能，如较强的抗氧化、预防高血糖、高血脂、心脑血管等慢性疾病、抗癌以及抵抗神经性疾病。多酚中的白藜芦醇，虽然有较高的生物活性，但其存在水溶性较低、生物利用率低等缺点。纳米材料的出现为解决多酚在生物医药方面的应用提供了新的途径。纳米材料具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高等优点。同时，吸附到纳米粒子表面的蛋白和多肽的构象常常会发生变化，这将影响它们的生物功能及聚集情况。然而，对于白藜芦醇修饰纳米材料是否具有抑制金属离子诱导的aβ多肽的纤维化聚集并同时清除活性氧仍是一个未知数。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种兼具抑制金属离子诱导aβ多肽聚集及清除活性氧的纳米粒子，以期解决多酚中白藜芦醇水溶性低及生物利用率低等缺点。
本发明另一目的在于提供一种兼具抑制金属离子诱导aβ多肽聚集及清除活性氧的白藜芦醇纳米硒的制备方法。
本发明再一目的在于提供上述兼具抑制金属离子诱导aβ多肽聚集及清除活性氧的白藜芦醇纳米硒在制备抗阿尔兹海默综合症药物中的应用。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种上述兼具抑制金属离子诱导aβ多肽聚集及清除活性氧的白藜芦醇纳米硒的制备方法，包含如下步骤：
分别取白藜芦醇与na2seo3混合，滴加硼氢化钠，搅拌，冷却静置，离心，得到白藜芦醇纳米硒。
所述na2seo3溶液浓度为0.02~0.1mol/l。
所述白藜芦醇溶液浓度为0.02~0.1mol/l。
所述调节反应温度范围为25-50℃。
所述调节ph范围为2-12。
所述硼氢化钠溶液浓度为0.02~0.1mol/l。
优选地，所述的白藜芦醇与na2seo3摩尔比为1:1~8:1。
优选地，所述的硼氢化钠与na2seo3摩尔比为1:1~4:1。
最优选地，所述的白藜芦醇和na2seo3摩尔比为4:1；硼氢化钠与na2seo3的摩尔比为1:1。
优选地，所述的反应温度为35℃。
优选地，所述的ph为6。
优选地，所述的搅拌是在25~50℃下搅拌10-60分钟。
优选地，所述的冷却静置时间为12~24h。
优选地，制得的纳米溶胶可保存在4℃。
优选地，离心后所得纳米粒子用超纯水洗涤。上述配置溶液均采用超纯水配置即可。
上述白藜芦醇纳米硒在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
上述白藜芦醇纳米硒作为aβ聚集抑制剂的应用。
上述白藜芦醇纳米硒作为抗氧化剂的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下优点及有益效果：
（1）本发明的白藜芦醇纳米硒不仅能抑制金属离子所诱导aβ多肽聚集，而且同时能清除活性氧降低氧化损伤；
（2）本发明的白藜芦醇具备较强抗氧化性，但不具备抑制金属离子诱导aβ多肽聚集的能力。而白藜芦醇纳米硒后不仅具备白藜芦醇的强抗氧化性还呈现出抑制金属离子诱导的aβ多肽聚集的能力，这同时也提高了白藜芦醇的生物活性。
（3）本发明制备的白藜芦醇纳米硒，其制备过程简单，产品体系稳定，可直接保存和使用。
附图说明
图1为白藜芦醇纳米硒形貌图。
图2为白藜芦醇纳米硒对金属离子诱导aβ42多肽聚集的抑制曲线图。
图3为白藜芦醇纳米硒对金属离子诱导aβ42聚集及其形态的影响图。
图4为白藜芦醇纳米硒与aβ42多肽结合能力。
图5为白藜芦醇纳米硒对aβ42聚集体诱导细胞内活性氧的影响图。
图6为白藜芦醇纳米硒对aβ42聚集体诱导的pc12细胞凋亡影响图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
实施例1白藜芦醇纳米硒的制备
1）称取0.173g亚硒酸钠，用蒸馏水定容至10ml配制成0.1mol/l储存液；同时称取0.143g白藜芦醇，用60%乙醇定容至25ml配制成0.025mol/l储存液；称取0.0378g硼氢化钠，用蒸馏水定容至10ml配制成0.1mol/l储存液。
2）取0.2ml亚硒酸钠储备液与不同比例白藜芦醇混合，在400rpm/min搅拌，调节反应温度范围为25-50℃，ph范围为2-12。逐渐滴加不同比例的硼氢化钠，继续搅拌10至60分钟。亚硒酸钠与白藜芦醇或硼氢化钠的摩尔比分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8。其中，35℃，ph为6条件下，亚硒酸钠与白藜芦醇的摩尔比为1:4的样品最稳定，而亚硒酸钠与硼氢化钠的摩尔比为1:1。搅拌30分钟后溶液颜色变为砖红色。将上述溶液在4℃下放置12h，离心分离，弃上清液，洗涤，定容至10ml，得到白藜芦醇纳米硒。通过teanai-10型透射电子显微镜（tem）观察，如图1所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径在100nm左右。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例2白藜芦醇纳米硒对金属离子诱导aβ42多肽聚集的抑制作用
取35μmaβ42多肽分别与70μmcucl2及不同浓度的白藜芦醇及实施例1制备得到的白藜芦醇纳米硒孵育0-5天。每日从孵育溶液中取50μl同200μl15μmtht混合后在黑暗处孵育15min。在荧光分光光度计上检测tht的荧光强度。tht的激发波长为440nm，发射波长为490nm。实验结果如图2所示，白藜芦醇不能显著抑制金属离子诱导aβ42多肽聚集，tht荧光仍然维持在较高的强度。随着白藜芦醇纳米硒浓度的增加，tht的荧光随之下降，金属离子诱导aβ42多肽聚集的迟滞期也随之延长，说明白藜芦醇纳米硒是一个有效的金属离子诱导aβ42多肽聚集抑制剂而且可以在聚集的早期就开始抑制多肽的聚集。
实施例3白藜芦醇纳米硒对金属离子诱导aβ42聚集形态的影响图
取35μmaβ42分别与70μmcucl2及不同浓度的白藜芦醇及实施例1制备得到的白藜芦醇纳米硒孵育3天。从孵育溶液中取10μl滴在铜网上，晾干10分钟后，再滴加5μl1.5%(w/v)磷钨酸进行染色。随后在透射电镜上观察白藜芦醇纳米硒对金属离子诱导aβ42聚集形态的影响图。实验结果如图3所示，金属离子可诱导aβ42聚集，可观察到块状的aβ42聚集体。白藜芦醇不能显著抑制金属离子诱导aβ42多肽聚集，而白藜芦醇纳米硒可显著抑制金属离子诱导aβ42多肽聚集，只有观察到少量的聚集体。说明白藜芦醇纳米硒比白藜芦醇更有效抑制金属离子诱导aβ42多肽聚集。
实施例4白藜芦醇纳米硒与aβ42结合能力
首先检测白藜芦醇纳米硒与aβ42纤维的结合。将aβ42多肽孵育3天后形成aβ42纤维，随后加入60μg/ml的纳米粒子孵育6h，随后在透射电镜上观察纳米粒子与aβ42纤维结合能力。实验结果如图4a所示，在aβ42纤维上结合白藜芦醇纳米硒。随后采用共振光散射方法检测白藜芦醇纳米硒与aβ42单体的结合。共振光散射强度与散射粒子的大小相关。取2ml0.05μg/ml白藜芦醇纳米硒稀释，随后加入5μlaβ42单体，使得终体积中aβ42单体浓度从5×10-5到50×10-5μg/ml。在caryeclipse荧光分光光度计上检测200nm到800nm的同步荧光光谱，δλ=0nm，激发和发射狭缝宽度均设置为5nm。实验结果如图4b所示，同步荧光光谱中，白藜芦醇纳米硒可检测到相应特征峰，而在加入aβ42单体后其特征峰强度随着aβ42单体浓度的增加而增加。说明白藜芦醇纳米硒均可与aβ42纤维或者单体结合，这种结合会影响到金属离子诱导aβ42聚集。因此，白藜芦醇纳米硒比白藜芦醇更有效抑制金属离子诱导aβ42多肽聚集。
实施例5白藜芦醇纳米硒对aβ42聚集体诱导细胞内活性氧的抑制作用
aβ42聚集体诱导细胞内ros产生通过dcfh-da荧光变化进行检测。aβ42多肽（35μm）与70μmcucl2及60μg/ml白藜芦醇纳米硒或白藜芦醇在细胞培养基中37℃孵育3天。随后pc12细胞同这些孵育溶液中继续培养72h。用胰酶将pc12细胞消化下来，加入10mmdcfh-da，避光孵育15min，随后在流式细胞仪检测细胞内ros的含量。激发波长和发射波长分别为488nm和525nm。实验结果如图5所示，cu2+离子可显著促进aβ42单体聚集，从而促使pc12细胞内活性氧含量显著增加。白藜芦醇纳米硒显著减少细胞内活性氧含量，且降低程度优于白藜芦醇。
实施例6白藜芦醇纳米硒对aβ42聚集体诱导细胞凋亡的影响
aβ42聚集体诱导的细胞凋亡所产生的dna片段采用tunel试剂盒检测。35μmaβ42单体同70μmcucl2及60μg/ml白藜芦醇纳米硒或白藜芦醇在细胞培养基中37℃孵育3天。将pc12细胞接种到无菌玻片上，并同上述孵育溶液培养48h。用4%多聚甲醛溶液固定细胞15min。pbs洗涤后，再用0.1%tritonx-100通透15min。采用tunel检测试剂盒进行染色，最后用dapi染色10min，在nikoneclipsete2000-e荧光显微镜（200×）观察凋亡的细胞核。实验结果如图6所示，白藜芦醇纳米硒显著减少aβ42聚集体诱导细胞凋亡，其效果同样优于白藜芦醇。